הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת SNS קובלט (II) מכלולי מודל מודלים של הכבד אלכוהול דהידרוגנאז

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60668

⸱

19 במרץ 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

במאמר זה

סיכום

הכנת של sns לקחיים קובלט (II) דגמי מתחמים של אלכוהול הכבד דהידרוגנאז מוצג כאן. התסביכים יכול להיות מוכן על ידי התגובה ליקודמן עם cocl2· 6h2O ולאחר מכן יכול להיות recrystallized על ידי מתן המאפשר דיאתיל אתר לפזר לאט לפתרון acetonitrile המכיל את מתחם קובלט.

תקציר

מתחמי מודל כימיים מוכנים לייצג את האתר הפעיל של אנזים. בפרוטוקול זה, משפחה של tridentate לקחיים ליגונס (כל אחד מהם בעל שני גופרית ואחד התורם חנקן פונקציונליות (sns) ומבוסס על התרכובות bis או bis-triazole) הם metallated עם cocl2· 6h2O כדי להרשות לעצמם tridentate sns לקחיים קובלט (II) תסביכים. הכנת מתחמי מודל קובלט (II) לאלכוהול הכבד דהידרוגנאז הוא facile. מבוסס על שינוי צבע מהיר על הוספת CoCl2· 6h2O לפתרון acetonitrile המכיל את ליגהקודמן, טפסים מורכבים במהירות. היווצרות של מתחם המתכת הוא השלם לאחר המאפשר את הפתרון ריפלוקס לילה. אלה מתחמי קובלט (II) לשמש מודלים עבור האתר הפעיל אבץ הכבד דהידרוגנאז (ladh). התסביכים מאופיינים באמצעות עקיפה אחת של קרני רנטגן בגביש, ספקטרוסקופיית מסה מאסיבית, אולטרה סגול לעין ספקטרוסקופיה, ניתוח אלמנטלים. כדי לקבוע במדויק את מבנה הקומפלקס, יש לקבוע את מבנה הגביש היחיד שלו. גבישים בודדים של התסביכים המתאימים לעקיפה של קרני רנטגן מגודלים לאחר מכן באמצעות הפצת אדים איטיים של דיאתיל האתר לפתרון מורכב המכיל את הקומפלקס קובלט (II). עבור גבישים באיכות גבוהה, recstalliטיזציה בדרך כלל מתרחשת לאורך שבוע 1, או יותר. ניתן ליישם את השיטה על הכנת מתחמי תיאום מודל אחרים וניתן להשתמש בהם במעבדות לימוד לתואר ראשון. לבסוף, הוא האמין כי אחרים עשויים למצוא את השיטה הסופית להשיג גבישים בודדים מועילים למחקר שלהם.

מבוא

מטרת השיטה המוצגת היא להכין מולקולה קטנה ואנלוגית של LADH כדי להבין עוד יותר את הפעילות הקטליטית של מטלואנזימים. LADH הינה אנזים dimeric המכיל קופקטור, דומיין ואבץ (II) מתכת המכילה את התחום הקטליטי1. LADH, בנוכחות שיתוף פקטור NADH, יכול להפחית את הטונים ו-אלדהדס לנגזרות האלכוהול המתאימות שלהם2. בנוכחות NAD+, ladh יכול לבצע מזרז הפוכה של חמצון של האלכוהול כדי קטונים ו-aldehydes2. מבנה הגביש של האתר הפעיל של ladh מראה כי האבץ שלה (II) מרכז מתכת מאוגד אטום חנקן אחד, שסופקו על ידי שרשרת הצד היסטידין ושני אטומי גופרית, המוצעים על ידי שני ליגנדס לגדת3. מחקר נוסף הראה כי מרכז מתכת האבץ הוא מהפך עם מולקולת מים יציב משך, וכתוצאה מכך גאומטריה פסאודו-מישור מסביב למרכז המתכת4.

אנו דיווחו בעבר ומנוצל sns לקחיים ליגםו בשרי, כמו גם metallated ליגו מראש עם הלצ2 לטופס zn (II) מתחמי המכילים את tridentate ליגיום2 5,6,7. סמני משנה אלה מוצגים באיור 1. אלה אבץ (II) מכלולי הציג פעילות עבור הפחתת הסטואיצימטרי של אלקטרון-המסכן אלהידס ולכן מתחמי מודל עבור LADH. לאחר מכן, סינתזה ואפיון של סדרה של נחושת (I) ו-נחושת (II) מתחמים המכילים sns ליגנד מראש דווחו8,9,10.

למרות LADH הוא האנזים אבץ (II), אנו מעוניינים להכין קובלט (II) מתחמי מודל של LADH על מנת להשיג מידע ספקטרוסקופי יותר על קובלט (II) אנלוגיות של LADH. התסביכים קובלט (II) הם בצבע, בעוד אבץ (II) מתחמי הם מחוץ ללבן. מאז מתחמי קובלט (II) הם צבעוניים, הספקטרום הנראה האולטרה סגול של התסביכים ניתן להשיג, שבו מידע על כוחה של ליגפילד בתחום קובלט (II) מתחמי ניתן גם לאסוף. על-ידי שימוש במידע מחישובי גאוס והוא השיג את הספקטרום הנראה של אולטרה סגול, מידע על כוחה של השדה ניתן להסיק. קובלט (ii) הוא תחליף טוב אבץ (ii), מאז שני היונים יש רדיוi יונית דומה ודומה לואיס acidities11,12.

השיטה המוצגת כוללת סינתזה ואפיון מתחמי מודל כדי לנסות לחקות את ההתנהגות הטבעית קטליטי של לאדן5,6. יש לנו בעבר metallated משפחה של ליגו מראש עםלש2 כדי ליצור אבץ (II) מתחמי מודל של ladh, אשר המודל את המבנה ואת הפעילות מחדש של האתר הפעיל אבץ ב ladh4. באמצעות ניסויים מרובים, הוכיחו ליגונים אלה להיות חזקים בתנאים סביבתיים שונים ונשארו יציבים עם אוסף מגוון של קבוצות R מחוברות. 5,6

לעומת זאת, מכיוון שהם נמצאו מצליחים יותר עם מתכת בשל ההשפעות הכלריות והחזקות של הליגריות. התבוננות זו נובעת מאנטרופיה מועדפים יותר של משולש הפידנאט והיווצרות בהשוואה ללימודנט ליגונאט13. יתר על כן, הטרידנאט ליגפות נוטים למנוע דימרזציה של מכלולי מתכת, אשר המועדף כי דימריזציה עשויה להאט פעילות קטליטי של קומפלקס14. לפיכך, באמצעות tridentate מלקחיים ליגנדס הוכח מוצלחת בכימיה אורגנומתכתית בהכנת מתחמים פעילים וחזקים של קטליטי. Sns מתחמי לקחיים כבר נחקרו פחות מאשר מערכות לקחיים אחרים, כמו מתחמי לקחיים בדרך כלל מכילים שורה שנייה ושלישית מתכות מעבר15.

מחקר זה על מטלואנזימים יכול לעזור עוד יותר את ההבנה של הפעילות האנזימטית שלהם, אשר ניתן להחיל על תחומים אחרים בביולוגיה. שיטה זו של סינתזה מתחמי מודל לעומת השיטה החלופית (סינתזה החלבון כולו של LADH) היא חיובית מספר סיבות. היתרון הראשון הוא שמערכות מודל נמוכות במסה מולקולרית והם עדיין מסוגלים לייצג במדויק את הפעילות הקטליטית ואת התנאים הסביבתיים של האתר הפעיל של האנזים הטבעי. שנית, מערכות מודל פשוטות יותר לעבוד עם ולייצר נתונים אמין ולתרגום.

כתב יד זה מתאר את ההכנה הסינתטית והאפיון של שני מתחמי מודל של קובלט (II) של LADH. שני התסביכים כוללים מלקחיים ומכילים אטומים של גופרית, חנקן ותורמי גופרית. הקומפלקס הראשון (4) מבוסס על מבשרמקודד, והשני (5) מבוסס על triazole קודמן. התסביכים מציגים פעילות מחודשת עבור הפחתת הסטואיצ'ימטריה של האלקטרונים המסכנים בנוכחות של תורם מימן. תוצאות הפעילות החוזרת ידווחו בכתב יד שלאחריו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. סינתזה של כלורו-(n3-S, s, n)-[2, 6-Bis (n-איזופרופיל-n'-מתיונין-2-thione) הפירידיין] קובלט (II) טטרלורוקובלאטטייט [4]

  1. כדי להכין מורכב 4, להוסיף 0.121 g (3.12 x 10-4 מול) של 2, 6-bis (N-איזופרופיל-n'-מתיונין-2-thione) Pyriסעדו (C19H25N5S2)שישה עד 15 מ ל של acetonitrile ב 100 ml בקבוקון התחתון עגול. לאחר מכן, לפתרון זה, להוסיף 0.0851 g (3.58 x 10-4 מול) של קובלט כלוריד (II) הקסהמיים (cocl2· 6h2O). פתרון התגובה צריך לשנות את צבע צהוב בהיר לירוק ברקת מיד לאחר הוספת קובלט (II) כלוריד הקסהמיים מתווסף.
  2. להוסיף בר מהומה לבקבוקון. הריפלוקס ומערבבים את התגובה 20 h כדי להבטיח תגובה מלאה. הסר את הממס באמצעות rotovap בלחץ מופחת.

2. הראכליזציה של כלורו-(n3-S, s, n)-[2, 6-Bis (n-איזופרופיל-n')-מתיונין-2-thione) קובלט (II) טטרלורוקובלטייט [4] על ידי האדים האיטיים דיפוזיה

  1. לפזר את התמיסה ב acetonitrile (7.5 mL), לסנן את הפתרון, ולמקם את הפתרון באופן שווה ב 1 בבחנות בבקבוקונים. ממלאים כל בקבוקון עם 1.5 mL של פתרון acetonitrile.
    1. הוסיפו כותנה לכיסוי הבקבוקונים, דבר המאפשר לדיפוזיה של אדי איטי. להתאים את הכותנה בפתח בראש הבקבוקון.
    2. מניחים את הבקבוקונים בצנצנת 240 mL המכילה 50 mL של דיאתיל אתר. . סגור את הצנצנת עם כובע
    3. לאפשר לקריסטלים לצמוח לאורך שבוע אחד.
      הערה: מומלץ להאריך את הסריקה למשך יותר מיום אחד.

3. סינתזה של כלורו-(n3-S, s, n)-[2, 6-Bis (n-איזופרופיל-n'-methylenetriazole-2-thione) פירידיין] קובלט (II) טטרלורוקובלטייט [5]

  1. כדי להכין קומפלקס 5, להוסיף 0.183 g (4.70 x 10-4 מול) של 2, 6-bis (N-איזופרופיל-n'-methylenetriazole-2-thione) Pyriדיין (C17H23N7S2)6 כדי 15 מ ל של acetonitrile ב 100 ml בקבוקון התחתון עגול. לפתרון זה, להוסיף 0.223 g (9.37 x 10-4 מול) של קובלט כלוריד הקסמיים (cocl2· 6h2O). פתרון התגובה צריך לשנות את צבע צהוב בהיר לכחול מלכותי מיד לאחר הוספת קובלט (II) כלוריד הקסא2 מתווסף.
    1. להוסיף בר מהומה לבקבוקון. הריפלוקס ומערבבים את התגובה 20 h כדי להבטיח תגובה מלאה. הסר את הממס באמצעות rotovap בלחץ מופחת.

4. הכלליזציה של כלורו-(n3-S, s, n)-[2, 6-Bis (n-איזופרופיל-n'-methylenetriazole-2-thione) pyridine] קובלט (II) טטרלורוקובאנטייט [5] על ידי האדים האיטיים דיפוזיה

  1. לפזר את התמיסה ב acetonitrile (9.0 mL), לסנן את הפתרון, ולמקם את הפתרון באופן שווה ב 1 בבחנות בבקבוקונים. ממלאים כל בקבוקון עם 1.5 mL של פתרון acetonitrile.
    1. הוסיפו כותנה לכיסוי הבקבוקונים, דבר המאפשר לדיפוזיה של אדי איטי. להתאים את הכותנה בפתח בראש הבקבוקון.
    2. מניחים את הבקבוקונים בצנצנת המכילה 50 מ ל של דיאתיל אתר. סגור את הבקבוקון עם כובע.
    3. לאפשר לקריסטלים לצמוח לאורך שבוע אחד.
      הערה: מומלץ להאריך את הסריקה למשך יותר מיום אחד.

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן

  1. הר גביש של 4 על לולאה ניילון. לאסוף את הנתונים על דיגאקא אוקספורד מריקציה. כאן, נתוני עקיפה של קרני רנטגן נאספים ב-173 (2) K. לפתור את מבנה הגביש באמצעות Olex216 ו-שילוב17 פתרון מבנה תוכניות באמצעות שיטות ישירות. מקד את המבנה עם חבילת העידון של ShelXL18 באמצעות מזעור ריבועים לפחות.
  2. הר גביש של 5 על לולאה ניילון. אספו את נתוני העקיפה של קרני הרנטגן על דיגאקא אוקספורד. כאן, נתוני עקיפה של קרני רנטגן נאספים ב-173 (2) K. לפתור את מבנה הגביש באמצעות Olex216 ו-שילוב17 פתרון מבנה תוכניות באמצעות שיטות ישירות. מקד את המבנה עם חבילת העידון של ShelXL18 באמצעות מזעור ריבועים לפחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סינתזה
התחביר של מתחמים 4 ו- 5 בוצע בהצלחה על ידי תגובה פתרון acetonitrile המכיל bis-thione ליגנד הקודמן עם קובלט (II) כלוריד הקסאומיים (איור 2). תגובה זו התרחשה בטמפרטורת הריפלוקס בנוכחות אוויר. באופן כללי, מתחמי 4 ו- 5 נצפו להיות מסיסים ב-acetonitrile, דימתיל סולפוקסיד, דיכלורומתאן ומתנול. קומפלקס 4 היה ירוק בצבע ומורכב 5 היה כחול בצבע. התשואה אחוז עבור מתחמי 4<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכנת מתחמי 4 ו 5 הוא facile. הצעד העיקרי הוא להוסיף את CoCl מוצק2· 6h2O לפתרון acetonitrile המכיל את ליגהקודמן המתאים. הפתרון הופך ירוק כהה בתוך שניות לאחר התוספת של CoCl2· 6h2O כדי טופס מורכב 4. הפתרון הופך כחול בהיר לאחר תוספת של CoCl2· 6h2O כדי טופס מורכב 5. כדי להבטיח תגובה מלאה, הפתרון מונח על ריפלוקס לילה.

כדי לגדל גבישים בודדים של מתחמי 4...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

ג'ון Miecznikowski קיבל תמיכה כספית מן הבאים עבור פרויקט זה: קונטיקט שטח של נאס א מענק הברית (הפרס מספר P-1168), המכון המדעי של אוניברסיטת פיירפילד, המכללה לאמנות ולמדעים הפרסום קרן, פיירפילד אוניברסיטת הפקולטה למחקר קיץ קצבה, וקרן המדע הלאומי-מכשור מחקר הגדולות תוכנית (גרנט מספר צ'ה-1827854) עבור כספים כדי לרכוש 400 MHz NMR מגה-הרץ. הוא גם מודה לטרנס וו (אוניברסיטת ייל) לסיוע ברכישת ספקטרום המסה של הריסוס. ג'רי יאסנסקי מכיר בקרן המדע הלאומית-תוכנית מכשור מחקר מחשוב (גרנט מספר צ'ה-1039027) עבור כספים כדי לרכוש הפצת רנטגן. שילה בונטסבוס, אמריסה אלמנזה, רמי ח'ובאץ ', וסמנתה זיגלימונט מכירים בתוכנית לחוקרי ההרדימן למתן קצבה למחקר הקיץ שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 מ"ל בקבוק תחתון עגולChem GlassCG150691100 מ"ל צוואר יחיד בקבוק עם תחתית עגולה, 19/22 מפרק חיצוני
אצטוניטרילפישרHB9823-4צ'ילר בדרגת HPLC
לרוטו-vapLaudaL000638Alpha RA 8
קובלט כלוריד הקסהידרטAcros OrganicsAC423571000Acros Organics
דיאתיל אתרפישרE-138-1דיאתיל אתר אנהידורוס
צילינדר בוגרפישרS6345625 מ"ל פלטת צילינדר מדורגת
פישר11-100-49SHאיזוטמפ צנצנות פלטה לערבוב בסיסי
פישר05-719-481250 מ"ל צנצנות
ליגנד----------סונתז בעבר על ידי פרופסור מיצ'ניקובסקי
בינוני כדורי כותנהפישר22-456-80כדורי כותנה בינוניים
דראם אחדפישר03-339בקבוקוני דראם אחד עם TFE מרופד כובע
pipetפישר13-678-20B5.75 אינץ 'pipets
pipet נורותפישר03-448-21פישר מותג לטקס נורת עבור
פיפט התגבשות מחדש צלחת לאמבט חולפישר08-741 D325 מ"ל צלחת התגבשות מחדש למעבה
ריפלוקסChem GlassCG-1218-A-22מעבה עם מפרק פנימי 19/22
RotovapHeidolph Collegiate36000090Brinkmann; מאייד סיבובי Heidolph Collegiate עם אמבט אקולוגי Heidolph WB מאייד סיבובי
חול ים לאמבטיית חולAcros Organics612355000חול ים שטוף לאמבטיית חול
Stir barFisher 07-910-23בצורת ביצה מגנטית לערבב בר
ואקום גריזפישר14-635-5DDow Corning משאבת ואקום שומן גבוהה
עבור rotovapHeidolph Collegiate36302830בקרת שסתומים של Heidolph Rotovac
בקבוקוני אמבט חול

מקורות

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chemical Reviews. 96 (7), 2239-2314 (1996).
  2. Ibers, J. A., Holm, R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules. Science. 209 (4453), 223-235 (1980).
  3. Kannan, K. K., et al. Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase B. Three-dimensional structure at a nominal 2.2-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 72 (1), 51-55 (1975).
  4. Eklund, H., Brändén, C. I. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 254, 3458-3461 (1979).
  5. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes. Inorganica Chimica Acta. 376, 515-524 (2011).
  6. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations, and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes Based on Bis-Imidazole or Bis-Triazole Precursors. Inorganica Chimica Acta. 387, 25-36 (2012).
  7. Sunderland, J. R., et al. Investigation of liver alcohol dehydrogenase catalysis using an NADH biomimetic and comparison with a synthetic zinc model complex. Polyhedron. 114, 145-151 (2016).
  8. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis and characterization of three- and five-coordinate copper(II) complexes based SNS ligand precursors. Polyhedron. 80, 157-165 (2014).
  9. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis, Characterization, and Computational Study of Three-Coordinate SNS Copper(I) Complexes based on Bis-Thione Ligand Precursors. Journal of Coordination Chemistry. 67, 29-44 (2014).
  10. Lynn, M. A., et al. Copper(I) SNS Pincer Complexes: Impact of Ligand Design and Solvent Coordination on Conformer Interconversion from Spectroscopic and Computational Studies. Inorganica Chimica Acta. 495, (2019).
  11. Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/zinc/atom_sizes.html (2019).
  12. Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/cobalt/atom_sizes.html (2019).
  13. Caballero, A., Díez-Barra, E., Jalón, F. A., Merino, S., Tejeda, J. 1,1'-(pyridine-2,6-diyl)bis(3-benzyl-2,3-dihydro-1H-imidazol-2-ylidine), a new multidentate N-heterocyclic bis-carbene and its silver(I) complex derivative. Journal of Organometallic Chemistry. 617-618, 395-398 (2001).
  14. Albrecht, M., van Koten, G. Platinum Group Organometallics Based on "Pincer" Complexes: Sensors, Switches, and Catalysis. Angewandte Chemie International Edition. 40 (20), 3750-3781 (2001).
  15. Peris, E., Crabtree, R. H. Key factors in pincer ligand design. Chemistry Society Reviews. 47, 1959-1968 (2018).
  16. Dolomanov, O. V., Bourhis, L. J., Gildea, R. J., Howard, J. A. K., Puschmann, H. A complete structure, solution, refinement, and analysis program. Journal of Applied Crystallography. 42, 339-341 (2009).
  17. Sheldrick, G. M. Integrated Space Group and Crystal Structure Determination. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  18. Sheldrick, G. M. Crystal Structure Refinement with SHELXL. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  19. Pauling, L. Metal-metal bond lengths in complexes of transition metals. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 73, 4290-4293 (1976).
  20. Trzhtsinskaya, B. V., Abramova, N. D. Imidazole-2-Thiones: Synthesis, Structure, Properties. Sulfur Reports. 10 (4), 389(1991).
  21. Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
  22. Yang, L., Powell, D. R., Houser, R. P. Structural variation in copper(I) complexes with pyridylmethylamide ligands: structural analysis with a new four-coordinate geometry index, τ4. Dalton Transactions. , 955-964 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SNS PincerIIXUV Visible
הכנת SNS קובלט (II) מכלולי מודל מודלים של הכבד אלכוהול דהידרוגנאז
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.