מאמר שיטה

ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

DOI:

10.3791/60698

⸱

9 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, 2School of Life Sciences, Bengbu Medical College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להמחיש התנהגות מקרופאג ומוות העובריים מתחלקים במהלך הזיהום של מריחיידק של פטרת . צעדים להכנת חיידקים, זיהום העוברים, ומיקרוסקופ ה, כלולים. טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על התבוננות של התנהגות תאית ומוות בתרחישים דומים הכרוכים זיהום או דלקת סטרילית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish הוא אורגניזם מודל מעולה לחקר התנהגות התא החיסונית מולדת בשל טבעו שקוף הסתמכות אך ורק על מערכת החיסון שלה מולדת במהלך ההתפתחות המוקדמת. Zebrafish מריחיידק מארנום (מ. מרנום) מודל זיהום כבר הוקמה היטב ללמוד תגובה חיסונית מארחים נגד זיהום פטרת. יש כבר הציע כי שונים סוגי מוות מקרופאג cell יוביל לתוצאות מגוונות של זיהום בקטריאלי. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ המקרופאג להתבונן במוות התאים בתוך עוברי דגים בעקבות זיהום מ. מרנום . Zebrafish הקווים הטרנסגניים במיוחד בתוויות מקרופאגים ו נויטרופילים נגועים באמצעות מיקרוהזרקה שרירית של fluorescently אופן שכותרתו M. marinum באמצע המוח או המטען. עוברים מזוהמים העוברי דגים הם רכוב לאחר מכן על התכה נמוכה ההיתוך ונצפתה על ידי המיקרוסקופיה בממדים X-Y-Z-T. מכיוון שהדמיה לטווח ארוך מחייבת שימוש בכוח לייזר נמוך כדי למנוע הלבנת ופוטורעילות, מומלץ לבטא מאוד את הביטוי. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של התהליכים הדינאמיים ב vivo, כולל העברת תאים חיסוניים, אינטראקציה עם הפתוגן מארח, ומוות תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום פטרת הוכח לגרום למוות תא החיסון מארח1. למשל, זן מחליש יהיה להפעיל אפופטוזיס במקרופאגים ולהכיל את הזיהום. עם זאת, זן המוני יהיה להפעיל את המוות התא lytic, גרימת הפצת חיידקים1,2. בהתחשב ההשפעה האלה סוגים שונים של מוות תאים יש על מארח התגובה נגד פטרת, התבוננות מפורטת של מקרופאג cell מוות במהלך זיהום פטרת ב vivo הוא צורך.

השיטות הקונבנציונליות למדידת מוות תאי הן להשתמש בכתמי תאים מתים, כגון V, tunel, או אקרידיין אורנג '/propidium יודידה כתמים3,4,5. עם זאת, שיטות אלה אינן מסוגלים לשפוך אור על התהליך הדינמי של מוות התאים בvivo. האבחנה של מוות תאים בתוך מבחנה כבר הונחה על ידי הדמיה חיה6. עם זאת, האם התוצאות מחקות במדויק את התנאים הפיסיולוגיים נותרים ברורים.

Zebrafish כבר מודל מצוין עבור לימוד מארח נגד פטרת תגובות. יש מערכת חיסונית שימור מאוד דומה לזה של בני אדם, הגנום מניפולציות בקלות, והעוברים המוקדמים הם שקופים, אשר מאפשר הדמיה חיה7,8,9. לאחר ההדבקה עם מ. מרנום, בוגרים מסוג זברפיש מבנים טיפוסיים של גרגירומת מבוגרים, ויוצריםבצורת מבנה שכגרגירומה מוקדםמבנים 9,10. התהליך הדינמי של האינטראקציה הטבועה תא החיסונית בקטריה כבר נחקרו בעבר במודל דג זברה M. מרנום מודל11,12. עם זאת, בשל הדרישה גבוהה מרחבית ברזולוציה הזמנית, הפרטים המקיפים את מותם של תאים חיסוניים מולדים להישאר במידה מוגדרת ברובו.

כאן אנו מתארים כיצד להמחיש את התהליך של מוות תא מקרופאג lytic המופעל על ידי זיהום פטרת בvivo. פרוטוקול זה עשוי להיות גם להחיל על התנהגות תאית הvivo במהלך פיתוח ודלקת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish גדלו תחת תנאים סטנדרטיים בהתאם הנחיות בעלי חיים מעבדה לסקירה אתית של בעלי חיים רווחה (GB/T 35823-2018). כל ניסוי דג זברה במחקר זה אושרו (2019-A016-01) וניהל ב שנגחאי הציבור בריאות קלינית המרכז, אוניברסיטת fudan.

1. M. מרנום תא יחיד הכנה לרשת (איור 1)

  1. הפשרת Cerulean-פלורסנט M. marinum גליצרול מלאי מ-80 ° c והאיחסן לוחית 7h10 אגר עם 10% (v/v) oadc, 0.25% גליצרול ו 50 Μg/mL hygromycin. מודקת את הצלחת ב 32 ° c עבור כ 10 ימים.
  2. בחר מושבה המבטא זריחה חיובית והאיחסן 3 מ ל של 7H9 בינוני עם 10% OADC, 0.5% גליצרול, ו 50 μg/mL hygromycin.
    1. מודדקת את החיסונים ב 32 ° צ' ו 100 מהפכות לדקה (rpm) עבור 4 – 6 ימים עד התרבות מגיעה לשלב לוגריתמי (OD600 = 0.6 – 1.0).
    2. תת-תרבות (1:100) ב 30 מ ל של טריים 7H9 בינוני עם 10% OADC, 0.5% גליצרול, 0.05% יצירת רצף-80, ו-50 μg/mL עד OD600 מגיע ~ 1.0.
      הערה: לאיכות התרבות הגבוהה ביותר, מומלץ לשלב זה צעד תת-תרבות. בניסיון שלנו, הוספת שיבוט ישירות לנפח גדול של בינוני יוביל היווצרות של גושים חיידקיים.
  3. לאסוף תאים M. מרנום כמתואר להלן.
    1. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 10 דקות כדי לאסוף את M. מרנום כמו גלולה. למחוק את כל אבל 300 μL של supernatant ולהשתמש בו כדי להשעות מחדש את הגלולה.
    2. הוסף 3 mL של 7H9 בינוני עם 10% גליצרול כדי להשהות עוד יותר את הגלולה, ולאחר מכן sonicate את ההשעיה באמבט מים ב 100 W ב 15 s ON, 15 s ביטול עבור סכום כולל 2 דקות.
      הערה: המטרה של sonication היא להשיג תא בודד המגון לצורך האירשת, אשר תמנע חסימה של מחט המיקרו הזרקה.
  4. להעביר את ההשעיה חיידקים 10 mL מזרק, ואז לעבור דרך מסנן 5 יקרומטר כדי להסיר את כל הגושים בקטריאלי.
  5. למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה באמצעות ספקטרוסקופיה ולדלל אותו OD600 = 1.0 עם מדיה 7H9 המכיל 10% גליצרול. לחלק את ההשעיה לתוך 10 μL הבליטים ולאחסן ב-80 ° c מקפיא לשימוש עתידי.
  6. לאשר את הריכוז החיידקי של האינוניות (cfu/mL) על ידי דילול סדרתי ציפוי של מלאי בקטריאלי על הצלחת 7H10 אגר המכיל 10% (v/v) של OADC, 0.5% של גליצרול, ו 50 μg/mL של hygromycin.

2. הכנה לעובר בדגים

  1. , אחד מיום לפני ההשרצה. להקים זוגות מתרבים בחדר הרבייה
    הערה: הוסף רק זוג אחד לכל חדר רבייה.
  2. לאסוף את העוברים בבוקר למחרת בתוך 1 h הפריה הפוסט (hpf). בזהירות לשטוף את העוברים עם מים מזוקקים ולהעביר עד 100 עוברים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ המכיל 30 מ ל של E3 מדיום. מודטה ב 28.5 ° c.
  3. לאחר 12 שעות, להתבונן תחת מיקרוסקופ ולהשליך ביצים לא מופרות או פגום.
  4. ב 24 hpf, לשנות את המדיום ל-E3 בינונית טרייה עם N-פניylourea (PTU, 0.2 nM הריכוז הסופי) כדי למנוע את התפתחותם של פיגמנט. מודטה את העוברים ב 28.5 ° c עד העוברים מוכנים מיקרוהזרקה.

3. זיהום באמצעות מיקרו הזרקה חיידקית

  1. הכנת בורוסיליקט מחטי זכוכית מיקרוקפילר כפי שמתואר קודם לכן בהתייחסות13.
  2. עוברי דג שעוברים הרכבה לזיהום
    1. מיקרוגל 100 mL של 1% (w/v) ו 100 mL של 0.5% (w/v) התכה נמוכה ההיתוך בינונית E3 עד הצמח נמס לחלוטין. לחלק לצינורות mL 1 מ"ל ולאחסן ב 4 ° צ' לשימוש עתידי.
    2. לפני השימוש, לחמם את הצמח ב 95 מעלות צלזיוס בלוק חימום עד שהוא נמס לחלוטין. שמור על הצמח בצורה נוזלית על-ידי הצבתו בבלוק של 45 ° c (איור 2).
    3. הרכבה לזיהום תוך-שרירית באזור הגזע
      1. צור את שכבת agarose התחתונה על-ידי שפיכת 0.5 mL של 1% (w/v) התעוררה באופן שווה על שקופית זכוכית. מניחים על תיבת קרח או משטח קר עבור 3 דקות כדי לגבש.
      2. העבר את עוברי הדג (48 – 72 hpf) ב מי ביצה עם tricaine (200 μg/mL) ו-PTU עבור 5 דקות לפני ההרכבה. מקום עד 60 דג זברה עוברים על השכבה התחתונה agarose ולהניח אותם בזהירות לתוך שתי שורות (איור 2ב).
      3. הסר את המים הנותרים על השכבה התחתונה agarose עם נייר טישו לפני הוספת 0.3 mL של 0.5% (w/v) agarose כדי ליצור את השכבה העליונה. ודא כי העוברים מוטבעים לחלוטין בתוך הצמח. החזר את שקופית הזכוכית אל תיבת הקרח שוב כדי לחזק את הצמח ולמנוע התייבשות.
      4. לשמור על השכבה העליונה של agarose לחות על ידי כיסוי פני השטח עם תוספת E3 מי ביצה.
    4. הרכבה לזיהום מוחי בינוני
      1. לכסות את החריץ של מיקרוסקופ יחיד מיקרוסקופית זכוכית שקופית עם 1% (w/v) agarose, ולאחר מכן להעביר את 4 – 6 עוברים מורדם לתוך הצמח.
      2. מקמו את ראשו של כל עובר כלפי מעלה בזהירות עם מחט של 10 גר' (איור 2ג).
      3. לאחר כל מיקומי העוברים קבועים, להעביר את שקופית הזכוכית לתיבת קרח או משטח קר כדי לאפשר לחזק את הצמח.
        הערה: הימנע מדילול ההיתוך נמוך על ידי מזעור נפח של העברת מים ביצה עם העוברים.
  3. הכנת חיידקים לזיהום
    1. הוסף 1 μl של מסוננים סטרילי-פנול אדום (10x) ל 10 μl סדרת מחלקים של מלאי חיידקי (עשה בשלב 1) ולערבב על ידי vortexing בקצרה.
      הערה: ניתן לכוונן את הריכוז הסופי באמצעות ה-PBS הסטרילית.
    2. Sonicate ההכנה באמצעות 100 W ב -10 s ON, 10 s כבוי עבור 1 דקות כדי לשבור את כל הגושים שייתכן שנוצרו14.
  4. זיהום באמצעות מיקרו-הזרקה
    1. כוונן את המיקרו-מזרק והמיקרומניפולציה למיקום הנכון ולהגדרה של מיקרוהזרקה כפי שדווח בעבר על13.
    2. העברה 3 μL של הכנה חיידקית באמצעות מטעין מיקרו לתוך המחט מוכן (ראה שלב 3.1). הפיפטה לאט ובזהירות כדי להימנע מיצירת בועות אוויר.
    3. עבור זיהום אזור הגזע, להזריק 100 cfu לתוך אזור הגזע (איור 3א). הימנע מהזרקת חיידקים לתוך מיתר הנוטוקורד.
      הערה: cfu להזרקה מוערך על ידי הנוסחה cfu = ריכוז מלאי חיידקי x דילול גורם x הזרקה droplet. Cfu בפועל הוא אישר על ידי ציפוי טיפה אחת של בקטריות בצלחת 7H10 אגר המכיל 10% (v/v) של OADC, 0.5% של גליצרול, ו 50 μg/mL של hygromycin.
    4. עבור זיהום המוח האמצע, להזריק על 500 cfu לתוך האזור המוח אמצע (איור 3ב).
    5. לאחר המיקרוהזרקה, שוטפים בזהירות את העוברים לתוך מי ביצה טריים עם פיפטה פלסטיק.
      הערה: העוברים הר בצלחת הזכוכית בתחתית בהקדם האפשרי כדי לכסות את התצפית של התגובה המוקדמת מאוד מולדת התא החיסונית.

4. הדמיה חיה של הזיהום

  1. הרכבה לדגים להדמיה חיה
    1. העברה עד 10 העוברים tricaine-מ, לאמצע התחתונה זכוכית 35 mm צלחת. התעלם מאמצעי E3 נוסף.
    2. לכסות את הצלחת עם 1% התכה נמוכה בנקודה והאוריינט העוברים בזהירות באמצעות המחט 10 G. מקרין את הקערה בתחתית הזכוכית על קרח 10 כדי לחזק את הצמח.
      הערה: לצורך הזרקת מוח מוחית, יש לרכוב על עוברים בתוך הצמח כאשר הראש מופנה כלפי מעלה (איור 4א). עבור האזור גזע הזיהום הפנימי, העוברים צריך להיות מותקן בתוך הצמח (איור 4ב).
    3. ברגע שהוא התחזק לחלוטין, לכסות את agarose עם שכבה של מי ביצה (פלוס 1 x tricaine ו PTU).
  2. שלושה צבעים ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית
    הערה: השלבים הבאים מופעלים על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד 63.0 x 1.40 הנפט היעד UV עדשה.
    1. הגדר את טמפרטורת חדר הסביבה עד 28.5 ° c. מניחים כמה נייר טישו רטוב בתוך החדר כדי לספק לחות ולמנוע אידוי של מי ביצה (משלים איור 1).
    2. מניחים את הצלחת 35 מ"מ זכוכית בתחתית עם דג דג זברה בחדר הסביבה.
    3. פתח את התוכנה הקונקלית ואתחל את הבמה. עבור אל מטרת ה-UV של 63.0 x 1.40 שמן, ואתר את הדגים באמצעות ערוץ השדה הבהיר עם מסנן ניגודיות דיפרנציאלי (DIC).
    4. פתח את 405 דיודות, ארגון (20% כוח), ו DPSS 561 לייזר nm. הגדרת עוצמת הלייזר והגדרות הספקטרום המתאימות.
      הערה: להלן הגדרות הספקטרום עבור Cerulean (עירור = 405 nm; פליטה = ~ 456 – 499 nm), eGFP (עירור = 488 nm; פליטה = ~ 500 – 550 ננומטר), DsRed2 (עירור = 561 nm; פליטה = ~ 575 – 645 nm) (משלים איור 2B).
    5. בחר את "XYZ" "סריקה סדרתית" מצב הרכישה ולהגדיר את הפורמט תמונות "512 x 512 פיקסלים" (איור משלים 2a).
    6. עבור אל 'מצב נתונים חי'. למקד את המיקום של הדגים הראשונים ולסמן את מיקום "התחל" ו "סוף" Z. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מהעוברים הנותרים. ניתן להוסיף "השהה" בסוף התוכנית (איור משלים 2 ג).
    7. הגדר את הלולאה ואת מחזור התוכנית.
    8. . שמור את הקובץ

5. תא יחיד UV הקרנה לגרום אפופטוזיס והדמיה חיה

  1. דג הר כפי שמתואר בשלב 4.1.
  2. הדמיה של אזור אמצע המוח של 3 ימים הפריה (dpf) מקרופאג העובר הספציפי Tg (mfap4-eGFP) 15
  3. בחר את האזור של העניין של ממקרופאג אחד בודד התווית ולסרוק ב-400 Hz מהירות 6% לייזר UV כוח עבור 50 s.
    הערה: מהירות הסריקה והזמן צריכים להיות ממוטבים בהתאם למיקרוסקופ הבודד. זמן סריקה צריך להיות ממוטב כדי לגרום נזק DNA נרחב כי לאחר מכן לגרום היעד תאים אפופטוזיס, אבל לא photobleach כל התא.
  4. חזור על השלב שלעיל כדי להקרין תאי יעד נוספים.
  5. בצע הדמיית זמן הדמיה של אזור אמצע המוח כמתואר בסעיף 4.

6. עיבוד תמונה

  1. בצע "הטלה מקסימלית" עבור התמונות שנרכשו.
  2. חפש וסמן את המיקום והשעה של תרשימי XY בתאי היעד תחת התצוגה "הקרנה מקסימלית".
  3. חזור אל התצוגה הרגילה כדי לחפש ולסמן את מיקום Z של תאי היעד.
  4. חתוך את תמונת השכבה הבודדת של תאי היעד.
  5. יצא את ערוץ הכיסוי והשדה הבהיר כסרטוני וידאו בתבנית AVI.
  6. חתוך את אזור העניינים של ערוץ הכיסוי והשדה הבהיר ב-ImageJ.
  7. לשלב את שני קטעי וידאו בשלב האחרון אנכית ולשמור כמו וידאו אחד בפורמט AVI ב-ImageJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום פטרת יכול להפעיל תגובות מארח שונים מבוסס על נתיבי זיהום. בפרוטוקול זה, עוברי דג דג זברה נגועים על ידי הזרקת מיקרותוך שרירית של חיידקים המסומנים fluorescently לתוך המוח האמצע או המטען (איור 3) ונצפתה על ידי הדמיה מוקד חי. זיהום באמצעות שני המסלולים הללו יהיה באופן מקומי להגביל את הזיהום גרימת גיוס התא החיסונית מולדים מוות התאים הבאים.

המחשה של הפרטים של מוות תא החיסון הטבוע הוא מאתגר. מוות תאי ליטיק מתרחש על חלון זמן קצר מאוד ודורש מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של מוות מקרופאג במהלך זיהום פטרת. מבוסס על גורמים כגון שלמות קרום התא, זיהום מונחה תאים מוות יכול להיות מחולק אפופטוזיס ו-lytic מוות התא24,25. המוות התאי lytic הוא מלחיץ יותר עבור האורגניזם מאשר אפופטוזיס, כי זה מפעיל תגובה דלקתית חזקה 24,25. התבוננות של מוות תאי lytic ב vivo הוא קשה, בשל הדרישה של רזולוציה גבוהה מרחבית בזמן, הגדרות מיקרוסקופ מיקוד הנכון, וביטוי טרנסגניים חזק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד ר זילונג ון על שיתוף זנים הדגים, ד ר. סטפן Oehlers וד ר. דוד טובין על שיתוף M. marinum משאבים קשורים הקשורות, Yuepeng הוא לסיוע בהכנת הדמות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81801977) (B.Y.), תוכנית ההדרכה לנוער מצטיינים של הנציבות העירונית של שנגחאי (2018yq54) (B.Y.), תוכנית השייט של שנגחאי (18yf1420400) (B.Y.), והקרן הפתוחה של המעבדה מפתח שנגחאי של שחפת (2018

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% Tween-80SigmaP1379
10 מ"ל מזרקSolarbioYA0552
10% OADCBD211886
3-חומצה אמינו-בנזואיתSigmaE10521
5 μ מסנן mMille XSLSV025LS
50 μ l/ml hygromycinSangon BiotechA600230
7H10BD262710
7H9BD262310
צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מבמבחנה מדעיתD35-10-0-N
AgaroseSangon BiotechA60015
מיקרוסקופ קונפוקליLeicaTCS SP5 II
תא סביבתיפקון37-2 מיקרו-מטען דיגיטלי
אפנדורףאפנדורףמס' 5242956003
שקופית מיקרוסקופ זכוכיתBioland Scientific LLC7105P
גליצרולסנגון ביוטקA100854
אינקובטורKeelreinPH-140(A)
M.marinumATCC BAA-535
מחט מיקרו-הזרקהWorld Precision InstrumentsIB100F-4
מיקרו-מזרקEppendorfFemtojet
MicromanipulatorNARISHIGEMN-151
msp12: ceruleanRef.: PMID 25470057; 27760340
פנול אדוםסיגמהP3532
PTUסיגמאP7629
שקופית מיקרוסקופ זכוכית קעור יחידמפרש מותג7103
סוניקטורSCICNTZJY92-IIDN
ספקטרופוטומטר (OD600)Eppendorf AG22331 מיקרוסקופ סטריאו המבורג
OLYMPUSSZX10
Tg(mfap4:eGFP)Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2)Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG; lyz:eGFP)Ref.: PMID 27424497; 17477879
בקרת טמפ'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
  2. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
  3. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
  4. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
  5. Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
  6. Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
  7. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
  8. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  9. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  10. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
  11. Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).
  14. Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
  15. Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
  16. Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
  17. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).
  18. Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
  19. Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
  20. Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
  21. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
  22. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  23. Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
  24. Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
  25. Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XYZ

מאמרים קשורים