מאמר שיטה

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

DOI:

10.3791/60727

⸱

16 במאי 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה vivo של נוגדנים בעכברים גידול xenograft מודלים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים חד-קלונליים הם תרופות רב-תכליתיות עם זיקה גבוהה שעובדות על ידי מנגנונים עצמאיים משתנים כדי לחסל תאים סרטניים. במהלך העשורים האחרונים, התחום של נוגדנים-סמים התווסדו, נוגדנים דו-ספציפיים, קולטני אנטיגן כימריים (CAR) ואימונותרפיה סרטן התגלה כתחום המבטיח ביותר של חקירות בסיסיות וטיפוליות. עם ניסויים בבני אדם מוצלחים רבים המתמקדים קולטני מחסום חיסוני ותאי CAR-T בלוקמיה ומלנומה בקצב פורץ דרך, זה זמנים מרגשים מאוד עבור טיפולי אונקולוגיים נגזר וריאציות של הנדסת נוגדנים. למרבה הצער, מספר גדול באופן משמעותי של נוגדנים וטיפולים מבוססי רכב הוכיחו גם מאכזב בניסויים בבני אדם של סרטן מוצק בגלל הזמינות המוגבלת של תאי השפעה חיסונית במיטת הגידול. חשוב לציין, הפצה לא ספציפית של נוגדנים טיפוליים ברקמות אחרות מאשר גידולים גם לתרום לחוסר יעילות קלינית, רעילות הקשורים וכשל קליני. כמו תרגום נאמן של מחקרים פרה-קליניים לתוך שבילים קליניים אנושיים הם מאוד להסתמך על עכברים גידול xenograft יעילות ובטיחות מחקרים, כאן אנו מדגישים שיטה כדי לבדוק את הגידול ואת התפלגות רקמות כללית של נוגדנים טיפוליים. זה מושגת על ידי תיוג נוגדן מטוהר חלבון-A עם צבע פלורסנט אינפרא אדום ליד ואחריו הדמיה חיה של עכברים נושאים גידול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-FDA אישר את הנוגדן המונוקלונלי הראשון מיקוד CD3 (OKT3, Muromonab) בשנת 19861,2. מאז, בעשרים השנים הבאות, היה פיצוץ מהיר בתחום הנדסת נוגדנים בשל ההצלחה המוחצת של נוגדנים נגד מעכבי מחסום חיסוני3. לצד הפעלה עקיפה של המערכת החיסונית, נוגדנים נועדו ישירות לסמן תאים סרטניים כדי לעסוק במדויק בתאי השפעה חיסונית, לעורר cytotoxicity באמצעות אגוניסט קולטן מוות, לחסום איתות הישרדות תאים סרטניים, לחסום אנגיוגנזה (צמיחה של כלי דם), להגביל את הרגולטורים מחסום חיסוני, לספק radioisotopes, תרופות כימותרפיות siRNAכסוכנים בהסכם 2. בנוסף, לימוד שברי משתנה שרשרת יחיד (scFv) של נוגדנים שונים על פני השטח של המטופל נגזר T-תאים ותאי NK (CAR-T ו CAR-NK) הוא אזור גדל במהירות של חקירות קליניות לטיפולים מבוססי תאים4.

הזיקה הגבוהה במיוחד של תרופות מבוססות נוגדנים המספקת תסנות אנטיגן המביעה תאים סרטניים הופכת אותו לסוכן אטרקטיבי. כמו כן, משלוח ממוקד ושמירה על גידול של נוגדן טיפולי (או תרופה כימית) הוא המפתח לאיזון יעילות על רעילות. לכן, מספר גדול של אסטרטגיות מבוססות הנדסת חלבון הכוללות אך אינן מוגבלות bispecific5 ונוגדנים tri-ספציפיים6 מנוצלים כדי לשפר באופן משמעותי את השמירה גידול אופטימיזציה של תוך ורידי (IV) מוזרקטיפולית 5,7. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה מבוססת פלואורסץ כדי לטפל בהתפלגות הגידול והרקמות של נוגדנים אנטי סרטניים יעילים פוטנציאליים.

מכיוון שלרקמות בעלי חיים יש פלואורסצנטיות אוטומטית כאשר הן מתרגשות בספקטרום הנראה לעין, הנוגדנים סומנו בתחילה עם צבע אינפרא אדום ליד (לדוגמה, IRDye 800CW). להוכחת חקירות קונספט, עשינו שימוש קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) מיקוד נוגדן בשם farletuzumab ונגזרתו בשם מפעיל ציטוקסיה עוגן Bispecific (BaCa)7 נוגדן כי מטרות שותפות FOLR1 קולטן מוות-5 (DR5)8 נוגדן רקומביננטי אחד. FOLR1 הוא קולטן יעד מוגדר היטב במטגן יתר בתאים סרטניים בשחלות ו-TNBC, גידול xenografts ותגידוליםהחולה 9. במיוחד, ישנם מאמצים מרובים לנצל קלינית FOLR1 באמצעות גישות מבוססות נוגדנים לעסוק בתאי השפעה חיסונית ותרופת נוגדנים להציות (ADC) לסרטן השחלותוהשד 10,11.

בשיטות אלה נייר, שיכפלנו, ביטאנו ומטוהרים קליני אנטי FOLR1 (farletuzumab) יחד עם נוגדנים שליטה אחרים באמצעות מערכת ביטוי CHO. IgG1 isotype ונוגדן קליני נגד אידיוטי mucin-16 בשם abagovomab12 שימשו כפקדים שליליים. בעקבות טיהור חלבון-A, נוגדנים מסומנים סומנו עם IRDye 800CW וננתן לתוך ויריד הזנב של עכברים עירומים או נושאות xenografts גידול בשחלות או FOLR1 אנושי transfected באופן יציב המביע סרטן המעי הגס murine קסנוגרפטים. ההתקמה הנוגדן היה במעקב על ידי הדמיה חיה באמצעות ספקטרום הדמיה vivo במספר נקודות זמן שונות7. שיטה זו אינה דורשת כל שינוי גנטי או הזרקה של הצוללת כדי לאפשר פליטת אור והוא מהיר יותר באופן משמעותי, חסכוני ויעיל. פרוטוקול השיבוט, הביטוי, הטיהור והתיוג הכללי המתואר להלן יכול להיות מיושם על כל נוגדן קליני ולא קליני אם רצפי שרשרת כבדים וקלים זמינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכרוכים בטיפול בבעלי חיים ובחקרי גידולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) כאן באוניברסיטת וירג'יניה ותואמת את הסטנדרטים הרגולטוריים הרלוונטיים

1. ביטוי וטיהור נוגדנים

  1. תחזוקה של תאי CHO
    1. לגדול תאי CHO ב FreeStyle CHO מדיה בתוספת עם תוסף גלוטמין 1x זמין מסחרית ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 130 סל"ד עם 5% CO2 באמצעות מבחנות ארלנומייר delong או זכוכית או חד פעמי.
      הערה: מומלץ מאוד להשתמש בקבוקון מבולבל עם מכסה מאווררת לתסיסה מוגברת כדי לשפר את העברת גז במהלך מצב רועד. תפוקת נוגדנים מופחתת באופן משמעותי הושגה עם מבחנות רגילות (לא מבולבלות) בשל תסיסה מוגבלת של תרבות ההשעיה.
    2. שמור על מספר התא בין 1-5 x 106 תאים/מ"ל עם >95% יכולת קבילות תא. אם מספר התא גדל מעל 5 x 106 תאים/מ"ל, פצל את התאים. אף פעם לא מאפשר לתאי CHO להגיע מתחת 0.2 x 106 תאים / מ"ל.
  2. טרנסאפציה של תאי CHO
    1. לגדול תאי CHO ב 200 מ"ל של מדיה (2 x10 6 תאים / מ"ל) במבחנות דלונג Erlenmeyer מבולבל.
      הערה: תרביות השעיה הגדלות במבחנות מבולבלות תמיד ייצרו תפוקות חלבון גבוהות יותר לעומת כאשר גדלו במבחנות שאינן מבולבלות.
    2. בצינור 15 מ"ל, לקחת 5 מ"ל של מדיה בסגנון חופשי CHO ולהוסיף 50 μg של VH שיבוט DNA ו 75 μg של DNA שיבוט VL. מערבולת לערבב היטב.
    3. דגירה את תערובת ה-DNA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: דגירה ארוכה יותר מפחיתה את תפוקת החלבון.
    4. להוסיף 750 μL של 1 מ"ג /מ"ל פוליאתילן (PEI) מלאי לתמיסת ה-DNA באגרסיביות מערבולת התערובת עבור 30 s. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות נוספות.
      הערה: יש לעשות PEI טרי. מחזור הפשרה הקפאה מרובה של PEI מפחית את התשואה הכוללת באופן משמעותי.
    5. מוסיפים את כל התערובת של DNA וPEI על התאים תוך ניעור ידני של הבקבוקון. מיד לדגר את delong Erlenmeyer מנוון מבולבל עם תאים ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 130 סל"ד.
  3. ביטוי
    הערה: הנוגדן יש פפטיד אות הפרשה מהונדס לקצה N-מסוף שלה, אשר מסייע נוגדנים להיות מופרשים לתקשורת.
    1. לגדל את התאים הנגועים ב 37 ° C, עם רועד ב 130 סל"ד ביום 1.
    2. ביום 2, להוסיף 2 מ"ל של סוכן 100x נגד clumping ו 2 מ"ל של 100x פתרון אנטי בקטריאלי אנטי-מיקוטי. הזז את הבקבוקון לטמפרטורה נמוכה יותר (32-34°C), עם טלטול של 130 סל"ד.
    3. בכל יום חמישי, להוסיף 10 מ"ל של הזנת 1 ים 1 אחרונות, ו 2 מ"ל של 100x תוסף גלוטמין.
    4. להמשיך לספור את התאים בכל יום שלישי באמצעות hemocytometer לאחר הכתמת aliquot של תאים עם כתם כחול trypan. ודא כי הכדאיות של התא להישאר מעל 80%.
    5. ביום 10 או 11, לקצור את המדיום לטיהור נוגדנים. סובב את התרבות ב- 3000 x g, 4 °C למשך 40-60 דקות ולאחר מכן סנן את המדיה הברורה באמצעות מסנני בקבוקים של 0.22 μM.
  4. טיהור
    הערה: טיהור נוגדנים מתבצע באמצעות טור חלבון-A זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים),באמצעות משאבה פריסלטית.
    1. לערך את העמודה עם שני נפחי עמודה של מאגר איגוד (20 mM נתרן פוספט ב pH 7.4).
    2. העבר את המדיה המסוננת המכילה נוגדן (שהושג בשלב 1.3.5) דרך העמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
    3. שטוף את העמודה עם אמצעי אחסון של שתי עמודות של מאגר איגוד.
    4. הטה את הנוגדן לתוך 500 שברים μL באמצעות מאגר 5 mL elution (30 mM נתרן אצטט ב pH 3.4).
    5. לנטרל את ה-pH של הנוגדן החורץ על ידי הוספת 10 μL של מאגר נטרול (3 M נתרן אצטט ב pH 9) לכל שבר.
      הערה: שבר מספר 3-6 מכיל את רוב הנוגדן. מומלץ לשמור את כל השברים במקרה הנוגדן הוא מצומק בשבר מאוחר מהצפוי.
    6. למדוד את הריכוז של נוגדנים מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר על-ידי בחירת פרוטוקול ברירת המחדל עבור IgG. הריכוז הסופי של הנוגדן מתקבל במ"ג/מ"ל על ידי לשקול את המשקל המולקולרי ואת מקדם הספיגה.

2. תיוג פלורסנט

הערה: נוגדנים מסומנים בצבע אינפרא אדום המכיל קבוצת תגובתיות של NHS ester, אשר זוגות חלבונים ויוצרים התקהלות יציבה. תגובה זו רגישה ל-pH ועובדת בצורה הטובה ביותר ב- pH 8.5. פלואורסצנט מבעבע עם תצוגת הצבע קליטה מקסימלית של 774 מילי-מ', ומקסימום פליטה של 789 מילי-מ"ר. pH 8.5 הוא המפתח להתייחדות יעילה.

  1. דיאליזה 0.5 מ"ל של הנוגדן באמצעות קלטת דיאליזה (0.1-0.5 מ"ל) ב- 1 L של מאגר התייחדות (מאגר פוספט 50 mM ב- pH 8.5). לאחר 4 שעות להעביר את קלטת הדיאליזה למאגר טרי ודיאליזה בן לילה.
  2. הגדרת תגובת התייחדות על ידי הוספת 0.03 מ"ג של IRDye 800CW לכל 1 מ"ג של נוגדן בנפח תגובה של 500 μL.
    הערה: IRDye 800CW מומס DMSO בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.
  3. לבצע תגובות תיוג במשך 2 שעות ב 20 °C.
    הערה: הגדלת הזמן מעבר ל- 2 שעות אינה משפרת את התיוג.
  4. טהר את ההתייחדות המסויגת על-ידי דיאליזה מקיפה נגד PBS 1x.
  5. להעריך את מידת התיוג על ידי מדידת ספיגת הצבע ב 780 נה"מ וספיגה של החלבון ב 280 nm. תרומת הצבע לאות ה-280 נה"מ היא 3%.
  6. חשב את יחס הצבע/חלבון באמצעות נוסחה זו:
    figure-protocol-1
    כאשר 0.03 הוא גורם תיקון לספיגת הצבע המשמש ב 280 נהמ' (שווה ל 3.0 % של הספיגה שלה ב 780 נה"מ), εDye ו εחלבון הם מקדם הכחדה טוחנת עבור הצבע ואת החלבון (נוגדן) בהתאמה.
    הערה: εDye הוא 270,000 M-1 ס"מ-1 ו εחלבון הוא 203,000 M-1 ס"מ-1 (עבור IgG טיפוסי) ב 1:1 תערובת של PBS: מתנול. חלבונים אחרים מאשר IgG עשויים להיות מקדם הכחדה טוחנת שונה מאוד. השימוש במקדם הכחדה נכון עבור חלבון של עניין הוא חיוני לקביעה מדויקת של יחס D/P.
  7. חשב את ריכוז החלבון הסופי באמצעות נוסחה זו:
    figure-protocol-2
    הערה: תמיד לאשר את היעילות מחייב אנטיגן של נוגדן מתויג ללא תווית באמצעות ELISA (אנזים מקושר אימונוסורבנט אסיי) או ציטומטריה זרימה לפני להמשיך במחקרים vivo.

3. מחקרי קסנוגרט עכבר

  1. הכנת תאים סרטניים להזרקה
    1. לגדול OVCAR-3 תאים RPMI-1640 בינוני, בתוספת עם 10% של FBS ו 1x פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. יום לפני ההזרקה, תת-תרבות תאים לתוך מנות תרבות 100 מ"מ חדשות עם 10 מ"ל של בינוני / צלחת מלאה. השתמש במספר תא של 0.5-1 x 106 תאים/צלחת.
    3. דגירה תרביות בטמפרטורה של 37 °C, 95% לחות ו 5% CO2 עבור 20-24 שעות.
    4. ביום ההזרקה, להסיר את מדיום הצמיחה ממנות תרבות. לשטוף ביסודיות את שכבת התא עם Ca2+/ Mg2+ תמיסת מלח פוספט חינם של דולבקו (DPBS) כדי להסיר תאים מתים, פסולת תאית וכל העקבות של סרום, אשר עלול להפריע בפגישה טריפסין.
    5. Trypsinize התאים על ידי הוספת 1.0-1.5 מ"ל של פתרון Trypsin-EDTA לכל מנה ולנסות להפיץ את הפתרון על ידי הטיית המנה בכל רחבי ואחריו דגירה ב 37 ° C במשך 5-10 דקות.
      הערה: שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את מצב trypsinization בפועל. תחת טריפסינוזציה גורמת למספר נמוך יותר של ניתוק תאים מפני השטח של צלחת תרבות, מעל טריפסינון גורם מתח תאי. אז, טריפסינוזציה נכונה היא חשובה.
    6. להוסיף 1.0-1.5 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה לכל מנה כדי לעצור את פעולת trypsin, לאחר מכן להשעות מחדש תאים על ידי pipetting בעדינות.
      הערה: pipetting עדין חשוב כדי לשמור על בריאות התא.
    7. לאסוף את מתלה התא לתוך צינור חסונים 15 מ"ל ולסובב ב 250 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. לאסוף את גלולת התא לאחר הסרת supernatant ולשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הכדור ב DPBS 1x.
    9. סובב את מתלי התא במהירות נמוכה 250 x g במשך 5 דקות.
    10. להוסיף 500 μL של DPBS ולהשעות מחדש תאים על ידי pipetting עדין כדי לקבל מתלה תא יחיד.
    11. לספור תאים באמצעות מד המיוציטומטר או מונה תא אוטומטי.
      הערה: לקבלת דיוק טוב יותר, חזור על הספירה שלוש פעמים וקח בממוצע.
    12. כוונן את עוצמת הקול באופן כזה כך צפיפות התא הסופי יהיה 1 x 108 תאים / מ"ל.
  2. הזרקת תאים תת עוריים לפיתוח xenografts עכבר
    הערה: כל ההליכים צריכים להיעשות בקבינט בטיחות BSL2. אתימית עירום Foxn1nu/ Foxn1+ עכברים שימשו במחקר הנוכחי.
    1. קח 50 μL של מתלה התא לתוך צינור 1.5 מ"ל ולערבב עם 50 μL של מטריצת קרום מרתף מדיום.
      הערה: מטריצת קרום מרתף בינוני נוטה ליצור ג'ל כמו מצב בטמפרטורת החדר, כך בזהירות לשמור על התאים ואת תערובת בינונית מטריקס על קרח. מומלץ לשמור צינורות, טיפים ומזרקים במקרר ולאחר מכן להעביר על קרח לפני הזרקת בעלי חיים.
    2. להרגיז את התערובת כדי למנוע כל תא clumping. לאחר מכן, קח את זה 100 μL של תא מתלה-מטריקס תערובת בינונית המכילה 5 x10 6 תאים, לתוך מזרק 1cc.
    3. הרם בעדינות את עור החיה כדי להפריד את העור משכבת השריר הבסיסית ולהזריק לאט את מתלי התא (100 μL) מתחת לעור (5 x 106 תאים), עם מחט 26 G. המתן כמה שניות לפני להוציא את המחט, כך כי מדיום מטריצת מרתף יכול ליצור ג'ל מוצק למחצה כמו מבנה יחד עם תאים מתחת לעור, מניעת התערובת יוצא מאתר הזריקה.
      הערה: תאים צריכים להיבדק לפני הזרקה לכל זיהום אשר עלול להזיק לעכברים immunodeficient. בעוד הזרקה לא לשים את המחט עמוק מדי לתוך העור כמו זה עשוי ליצור את הגידול עמוק יותר מהצפוי.
    4. יש לשמור את החיה בכלוב סטרילי ולהתבונן במשך כ-20 דקות.
    5. צפה בעכברים במשך 2-3 שבועות ולאפשר לגידול לגדול עד 500 מ"מ3 גודל.

4. התאמה מקומית של נוגדנים באמצעות מערכת הדמיה vivo

הערה: בציוד הדמיה vivo (ראה טבלת חומרים)המשמש בניסוי זה משתמש סט של מסנני יעילות גבוהה ואלגוריתמים ספקטרליים un-ערבוב עבור הדמיה לא פולשנית ומעקב אחר פעילות סלולרית וגנטית בתוך אורגניזם חי בזמן אמת. המערכת מספקת הן יכולת ניטור פלואורססטי והן יכולת ניטור ביולומטרנציה.

  1. להזריק 25 μg של נוגדן מתויג צבע באמצעות וין זנב.
    1. גידול מברים הנושא עכברים באמצעות 2% isoflurane. בדוק אם חוסר תגובה רפלקסים דוושה.
    2. ברגע שעכברים מפסיקים לזוז, תאט את וית הזנב הרוחית על ידי החלת מי תולעים.
    3. להזריק 25 μg (ב 100 μL) של נוגדן מתויג באמצעות מזרק אינסולין 1 cc עם מחט 26 G.
    4. באופן דומה, כשליטה שלילית, תווית ולהזריק את הנוגדן IgG1 איזוטיפ לא ספציפי אשר אינו מתמקד תאים סרטניים.
  2. לבצע בהדמיה חיה vivo לאחר 8, 24, 48 שעות, וכו 'של זריקות נוגדנים.
    1. בתוכנה המשויכת, לחץ על אתחל את הממוקם בלוח הבקרה ואשר שטמפרטורת השלב היא 37 °C.
    2. הפעל את אספקת החמצן, כל המשאבות על מערכת ההרדמה, אספקת גז isoflurane לתא הרדמה ולהגדיר את שסתום אידוי isoflurane ל 2%.
    3. להעביר את העכברים לתא הרדמה ולחכות עד עכברים הם הרדמה לחלוטין. למרוח את משחת סיכת העיניים כדי למנוע ייבוש של עיניהם.
    4. עבור אל לוח הבקרה, הגדר את הדמיית הפלואורסצינטי באמצעות האפשרות אשף ההדמיה ובחר את העירור ב- 773 צפון-שעה ופליטה ב- 792 צפון-שעה.
      הערה: הגדרות ברירת המחדל של חשיפה אוטומטית מספקות תמונת פלורסנט טובה. עם זאת, ניתן לשנות את העדפות החשיפה האוטומטית לפי הצרכים.
    5. להעביר את העכברים המהדמה לתוך תא ההדמיה ולהרכיב אותו על שדה ההדמיה באמצעות קונוס האף. שלב ההדמיה מספק את האפשרות להכיל 5 עכברים בכל פעם.
      הערה: יש עכברי שליטה בתמונה יחד עם עכברי הבדיקה יש כמות דומה של חשיפה והגדרות אחרות בעת הניתוח.
    6. לאחר שהכל מוכן, בחר באפשרות רכישה בלוח הבקרה לרכישת התמונה.
    7. באמצעות הגדרות חשיפת אוטומטי המערכת יוצרת את התמונה בתוך דקה. התמונה שנוצרה היא כיסוי של פלואורסצינציה על תמונה מצולמת עם עוצמת פלואורסצית אופטית המוצגת ביחידות של ספירות או פוטונים, או במונחים של יעילות.
    8. לאחר רכישת התמונה, להעביר את העכברים מתא ההדמיה בחזרה לכלוב שלהם ולצפות להחלמתם במשך 1-2 דקות.
  3. כוונן את התמונה עוד יותר עם הכלים והפונקציות המסופקים בתוך התוכנה לניתוח תמונה. כלי ניתוח תמונה נמצאים בשורת התפריטים ובפלוח הכלים.
    1. תחת כוונון תמונה, כוונן את הבהירות, הניגודיות או האטימות ובחר את קנה המידה של הצבע.
    2. השתמש בכלי ROI כדי לציין אזור עניין (ROI) בתמונה אופטית ותמדד את עוצמת האות בתוך ההחזר על ההשקעה. במידת הצורך, יצא את נתוני האות המיומתים לתוכנה של גיליון אלקטרוני והתווה את הנתונים.
    3. לצורך מחקרי מעקב, לנתח עכברים necropsies של רקמות שונות (למשל, כבד, ריאות, לב, כליות, טחול, המוח וכו ') עבור התפלגות מפורטת לא ספציפית של נוגדן פלואורסצנטי.
      הערה: נתונים יכולים להיות נתמכים עוד יותר עם ELISA ספציפית רקמה על ידי עשיית שימוש אנטיגן (FOLR1 במקרה זה) ב 96 גם אומר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתודולוגיה המתוארת, תחילה שיכפלנו נוגדנים המתמקדים קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) בשם farletuzumab, ונוגדן ביסקי בשם BaCa המורכב farletuzumab ו lexatumumab יחד עם נוגדנים שליטה כגון abagovomab (רצפים שסופקו בקובץ משלים 1). פרטים של תחומים כבדים (VH) משתנים ומשתנים של אור משתנה (pVH, pVL) מוצגים באות 1A. כדי לאשר את השיבוטים החיוביים, ביצענו מושבה PCR באמצעות אות פפטיד קדימה (SP For) ו CK Rev / CH3 Rev פריימרים (רצפים שסופקו בקובץ משלים 1). התוצאות המייצגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משלוח סלקטיבי ותו לא רקמות גידול ספציפי של סוכן טיפולי נגד סרטן הוא המפתח למדיטת יעילות ובטיחות של טיפול ממוקד נתון13. כאן תיארנו גישה מהירה ויעילה לחקור את התפלגות רקמות וגידול מפורט של קליני, farletuzumab ונוגדן BaCa לא קליני. הגישה המתוארת ישימה לכל נוגדן חדש שנוצר וניתן להשתמש בה לצד נוגדן יעיל קלינית (עם התכונות הרצויות) עבור תכונות ההפצה של הגידול/איברים. בהתחשב רוב קולטני היעד נוגדנים (כגון HER2 בסרטן השד) הם ביטויים יתר על המידה בתאים סרטניים (רקמות), ברוב המקרים הביטוי תת אופטימלי שלהם ות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה אוניברסיטת וירג'יניה סרטן מרכז הליבה הדמיה מתקן, מתקן ניתוח ביומולקולרי, מתקן מיקרוסקופ מתקדם ומתקן הליבה Vivarium לסיוע. J. T-S הוא חוקר קריירה מוקדמת של האקדמיה לסרטן השחלות (OCA-DoD). עבודה זו נתמכה על ידי מענק NCI/NIH (R01CA233752) ל J. T-S, ארה"ב. משרד העבודה סרטן השד תוכנית לחקר סרטן השד (BCRP) פריצת דרך ברמה 1 פרס J. T-S (BC17097) ו U.S. משרד העבודה סרטן סרטן התוכנית לחקר (OCRP) פרס מימון (OC180412) כדי J.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
FreeStyle CHO mediaGibco Life TechnologiesCat # 12651-014
אנטי אנטי (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 15240-062
חומר נגד גושיםGibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
BD מזרק אינסוליןBD BioSciencesחתול #329420
קליפר IVIS ספקטרוםפרקין אלמרחתול #124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
קורנינג 500 מ"ל DMEM (מדיום הנשר השונה של דולבקו)קורנינגחתול # 10-13-CV
קורנינג 500 מ"ל RPMI 1640קורנינגחתול # 10-040-CV
Cy5 מצומד אנטי אנושי IgG (H+L)Jackson ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
ערכת HiPure Plasmid MaxiprepInvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe ColumnGE HealthcareCat # 11-0034-93
עירויTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS EsterLI-CORCat # 929-70020
Isoflurane, USPCovetrusCat # 11695-6777-2
חומר סיכה משחת עינייםרענון Lacri-LubeCat #4089
MatrigelCorningCat # 354234
PEI מגיב טרנספקציהThermo FisherCat # BMS1003A
קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer ThermoScientificCat # 66333
ואקום Steritop מסנניםMillipore ExpressCat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
מודלים ניסיוניים: קווי תאים
אנושי: OVCAR-3אוסף תרביות מסוג אמריקאיATCC HTB-161
אנושי: תאי CHO-Kיציבים טרנספורמציה במעבדה שלנוATCC CCL-61
עכבר: 4T1מתנה אדיבה מד"ר צ'יפ לנדן, UVA
עכבר: MC38מתנה אדיבה מד"ר סוזן אוסטרנד-רוזנברג, UMBCמאומת על ידי פרופיל
עכבר: MC38 hFOLR1נוצר במעבדה שלנו (מאמר זה)
<מודלים חזקים>ניסיוניים: עכברים בעלי חיים
: אתימיים עירום Foxn1/Foxn1+envigoעכברים מרובים
: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJמעבדת ג'קסוןהזמנות
STR מרובות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1(2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595(2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50(2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954(2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209(2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Antibody PurificationProtein A ColumnFluorescent LabelingIn Vivo ImagingTumor DistributionAntibody ConjugationCHO Cell CultureIVIS Imaging

מאמרים קשורים