Method Article

לוקליזציה וקוונפיקציה של וירוסים באגאוטיות ברקמות Whitefly על ידי Immunofluorescence ו-PCR כמותי

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטת ה-PCR הכמותית וכמותית ללוקליזציה וכימות של וירוסים ברקמות החרקים. ניתן להשתמש בפרוטוקול האימונוללונציה כדי להתאים חלבונים וקטוריים ומוקטורים. הפרוטוקול PCR כמותי ניתן להאריך כדי לכמת וירוסים בגופים שלמים כנימה וצמחים נגועים בווירוס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוסים (סוג של וירוס, משפחה גמביתיים) משודרים על ידי ויטאווניים של מתחם הטבק הבומיסיה באופן מתמשך, circulative. בהתחשב בנזק הנרחב שנגרם על-ידי וירוסים לחיתוך הייצור ברחבי העולם, זה הכרחי להבין את האינטראקציה בין וירוסים באגאוטיות לבין וקטור כנימה שלהם. לשם כך, לוקליזציה וקוונפיקציה של הנגיף ברקמות וקטורי הוא קריטי. כאן, באמצעות עגבניה צהוב עלה וירוס תלתל (TYLCV) כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי להתאים וירוסים בתוך מידות בינוני, בלוטות הרוק הראשי, והשחלות על ידי immunofluorescence. השיטה מבוססת על שימוש בנוגדנים ספציפיים נגד חלבון מעיל וירוס, נוגדנים משניים המסומנים בצבע, ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. הפרוטוקול יכול לשמש גם כדי להתאים את החלבונים באמצעות ויראלי להלבין. אנו מתארים עוד פרוטוקול עבור כימות של TYLCV ב midefly מידות, בלוטות הרוק הראשי, המוליקמ, והשחלות על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). באמצעות התחל שתוכנן במיוחד עבור TYLCV, הפרוטוקולים עבור כימות לאפשר השוואה של כמות TYLCV ברקמות שונות של הלבנה. הפרוטוקול המתואר הוא שימושי פוטנציאל לכמת של וירוסים בתוך הגוף של להלבין ומפעל נגוע בווירוס. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול המחזור של וירוסים בהאגאוטיות ב כנימה או כהשלמה לשיטות אחרות כדי ללמוד אינטראקציות וירוס להלבין.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעשורים האחרונים, וירוסים (סוג של וירוסבימודוללי, משפחה גמניריתיים) גרמו נזק חמור לייצור של ירקות רבים, סיבים, וגידולים דקורטיביים ברחבי העולם1. וירוסים משודרים באופן מתמשך על ידי המיסיה הבוטטיות של הטבק , שהוא מינים מורכבים המכילים מעל 35 מינים מסתורית2,3. וירוסים יכול להשפיע ישירות או בעקיפין על פיזיולוגיה והתנהגות של כנימה, כגון פוריות4, אריכות ימים4, והעדפה מארחים5,6. יתר על כן, את היעילות השידור של מינים וירוסים מסוג מסוים/זן משתנה עבור מינים שונים ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. whitefly, וירוס, צמחים, ורכישת הווירוס

  1. להלבין האחורי (MEAM1) על כותנה (Gossypium שעירות קורות חיים. zhemian 1793) בכלובים הוכחה חרקים בחממה ב 26 ± 1 ° צ' עם אור 14:10: מחזור כהה 60 ± 10% לחות יחסית.
  2. לבצע ה-PCR המקובלת על בסיס אוקסידאז מיטוכונדריאלי כרום הגנים כדי לקבוע את טוהר האוכלוסיה הלבנה.
    1. לאסוף 20 מבוגרים whiteflies ולהעביר אותם בנפרד לצינור PCR המכיל 30 μl של מאגר לפירוק (10 מ"מ, pH = 8.4, 50 mm kcl, 0.45% [wt/vol] יצירת רצף-20, 0.2% [wt/vol] הג, 0.45% [vol/vol] nonidet P 40, 60 g/mL פרוט
    2. להוסיף 5 – 7 חרוזי קרמיקה (2 מ ' קוטר) לתוך כל צינור PCR ולטחון את הדגימות כדי לבצע את הליזה רקמות.
    3. מודקון את כל ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MEAM1 להלבין את מורכבות B. עש ו TYLCV שימשו לדוגמה כאן כדי לתאר את ההליכים. הסקירה של התהליכים האימונולואוליים והליכי הקוונפיקציה המתוארים בכתב יד זה מוצגים באיור 1. איור 2 מציג את התוצאות הייצוגיות של זיהוי immunofluorescence של TYLCV ו dapi הצביעת ב psgs, מידות המעיים, והשחלות, המציין כי TYLCV שהצטברו יותר ב-psgs ו-midguts, ופחות בשחלות. איור 3 מראה את הכמות היחסית של וירוס בשנת psgs להלבין, מידות, המוליקמ, ושחלות לאחר כנ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור לוקליזציה וכימות של וירוס באגאוטיות ברקמות של וקטור להלבין שלה על ידי immunofluorescence סנס ו-qPCR. חיתוך מייצג את הצעד הראשון לוקליזציה ולכמת את הנגיף ברקמות להלבין. הגוף הלבן הוא כ 1 מ"מ באורך, כלומר הרקמות קטנות מאוד, וקשה לנתח אותם. חוץ מזה, יש קשרים. חזקים בין הרקמות לדוגמה, השחלות קשורות היטב לקטקטציטים, מה שמקשה על בידוד. כאן, בהתחשב המאפיינים והמיקומים של הרקמות השונות, אנו מתארים גישות שונות לניתוח. עם זאת, הרבה תרגול נדרש כדי לנתח במהירות ובדייקנות הרקמות האלה. בנוסף, מוטב להשתמש ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (מספר גרנט: 2017YFD0200600), הקרן מיועד למחקר החקלאות סין מערכת (מספר מענק: מכוניות 23-D07) ואת ביל & מלינדה גייטס קרן (מזהה השקעה OPP1149777 ). אנו מודים לפרופסור ג'יאן-שיאנג וו למתן נוגדנים TYLCV CP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% פרפורמלדהידMultiSciencesF0001
4',6-דיאמידינו-2-phé nylindole (DAPI)Abcamab104139
אלבומין סרום בקר (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect מערכת זיהוי PCR בזמן אמתBio-RAD185-5201
מיקרוסקופיה קונפוקליתZeissLSM800
Dylight 549-עז נגד עכברEarthoxE032310-02נוגדן משני
חד-שבטי נוגדן (MAb 1C4)נוגדן ראשוני
פוספט חוצץ מלח (PBS)סנגון ביוטקB548119-0500
מיקרוסקופ סטריאוZeissStemi 2000-C
TB ירוק premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR מאסטר מיקס
תרמרוצקלר ThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI מדעי החיים9002-93-1
Tween 20BBI מדעי החיים9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Begomovirus LocalizationWhitefly Tissue DissectionImmunofluorescence ProtocolQuantitative PCRConfocal MicroscopyTYLCV DetectionStromal Vascular FractionHemolymph CollectionPrimary Salivary GlandsVirus Quantification

Related Articles