הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

Summary

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

Abstract

הנוף החיסוני של מיקרוסביבה הגידול (TME) הוא גורם הקובע התקדמות הסרטן ותגובה לטיפול. באופן ספציפי, הצפיפות והמיקום של תאים חיסוניים ב-TME יש ערכי אבחון והתחזיות חשובים. הפרופיל multiomic של TME הגביר באופן אקספוננציאלי את ההבנה שלנו של רשתות סלולריות ומולקולריות רבות ויסות ייזום הגידול וההתקדמות. עם זאת, שיטות אלה אינן מספקות מידע אודות הארגון המרחבי של תאים או אינטראקציות תא תא. במחיר נוח, נגיש, וקל לבצע טכניקות ריבוב המאפשרים רזולוציה מרחבית של תאים חיסוניים במקטעי רקמות נחוצים כדי להשלים בודד מבוססי תא בטכנולוגיות תפוקה גבוהה. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה המשלבת הדמיה טורית, תיוג סדרתי, ויישור תמונה כדי ליצור שקופיות וירטואליות רב פרמטרים של מקטעי רקמות שלמים. שקופיות וירטואליות מנותחות לאחר מכן בצורה אוטומטית באמצעות פרוטוקולים המוגדרים על-ידי המשתמש, המאפשרים זיהוי, כימות ומיפוי של אוכלוסיות תאים מעניינות. ניתוח התמונה מתבצע, במקרה זה באמצעות מודולי הניתוח Tissuealign, מחבר, ו HISTOmap. אנו מציגים דוגמה שבה התחלנו את האסטרטגיה הזאת בהצלחה לדגימה קלינית אחת, ממקסם את המידע שניתן להשיג מדגימות רקמות מוגבלות ומספקות תצוגה בלתי משוחדת של ה-TME בחלק הרקמות כולו.

Introduction

התפתחות הסרטן היא תוצאה של תהליך רב-שלבים הכרוך באינטראקציות הדדיות בין תאים ממאירים לבין TME. מלבד תאים סרטניים, TME מורכב של תאים לא ממאירים, מסטרומה תאים, אוכלוסיות תאים החיסונית, מטריצה החילוץ (ECM)¹. הארגון המרחבי של רכיבים סלולריים ומבניים שונים של רקמת הגידול וחילופי דינמי בין הסרטן לתאים שאינם סרטניים השכנה בסופו של דבר לווסת את ההתקדמות בגידול תגובה לטיפול^2,3,4. הוכח כי התגובה החיסונית בסרטן הוא מוסדר באופן זמני^5,6. אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים החדירה את הנגע הנאופלסטי ואת התצוגה הסמוכה התערוכה דפוסי הפצה מרחבית מגוונות הפעלה מגוונת מדינות הקשורות פונקציות שונות (למשל, pro-נגד antitumor). אלה אוכלוסיות החיסונית שונים הפרמטרים שלהם להתפתח שעות נוספות עם הגידול ותאי סטרומה.

הופעתה של טכנולוגיות מאפשר תא בודד multiomics פרופיל יש העלה באופן אקספוננציאלי ההבנה שלנו של רשתות סלולריות ומולקולריות רבות הוויסות קרצינובגנזה והתקדמות הגידול. עם זאת, מרבית הכלים האנליטיים המבוססים על תאים בעלי תפוקה גבוהה דורשים שיבוש רקמות ובידוד תא בודד, והתוצאה היא אובדן מידע אודות הארגון המרחבי של תאים ואינטראקציות תא תאים⁷. בגלל המיקום והסידור של תאים חיסוניים ספציפיים ב-TME יש ערך אבחון והתחזיות, טכנולוגיות המאפשרות פתרון מרחבי הם משלימים חיוניים של שיטות פרופיל המערכת החיסונית בודד.

באופן מסורתי, טכניקות הדמיה כמו אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו-מולטיסטיסטילואוורןהחיסונית (mIF) היו מוגבלים למספר קטן של סמנים שניתן לדמיין בו זמנית. מגבלה זו יש כנגד את המחקר של הדינמיקה הרקתית הטמפורלית של תאים חיסוניים החדירה לגידולים, אשר מוגדרים בדרך כלל על ידי סמנים מספר פנוטימית. ההתפתחויות האחרונות הדמיה וכלים אנליטיים הרחיבו את האפשרויות של ריבוב. חדש נוגדן מבוסס תוויות טכנולוגיות כמו histo-cy, הדמיה המסה cy, לנסות שימשו מרחב להפריד עד 12 ו 32 ביוארקרס, בהתאמה^8,9. הדמיה של ספקטרומטר המסה, טכניקה שאינה דורשת תיוג, מהווה את הפוטנציאל לדמות אלפי סמנים בו בסעיף אחד ברקמה^10,11. למרות טכניקות אלה כבר הראו פוטנציאל גדול לניתוח הסביבה החיסונית של רקמות בסרטן, הם משתמשים בציוד מתוחכם ויקר מאוד והתוכנה ואינם נגישים בקלות לרוב החוקרים.

לחילופין, יכולת ריבוב של ihc המסורתית ו mif הורחבה באמצעות השימוש הדמיה טורית, סיבובים רציפים של תיוג, ו הדמיה ספקטרלית^{7,12,13,14,15,16}. טכניקות אלה יוצרות תמונות מרובות ממקטעים של רקמה טורית שניתן לאחד לתוך שקופיות וירטואליות בריבוי פרמטרים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. כתוצאה מכך, מספר הסמנים שניתן לדמיין ולנתח בו מגדיל בו.

כאן, אנו מציעים אסטרטגיה עבור העיצוב הרציונלי של מולטיפלקס הרקמה מספר השימוש בחומרים מסחריים בעלי זמינות מסחרית, ציוד מיקרוסקופ במחיר נוח, ותוכנה ידידותית למשתמש (איור 1). מתודולוגיה זו משלבת הדמיה טורית, תיוג סדרתי של מולטיפלקס, הדמיה מלאה של רקמות ויישור רקמות כדי ליצור שקופיות וירטואליות עם פרמטרים מרובים שניתן להשתמש בהם לצורך כימות אוטומטי ומיפוי של תאים חיסוניים במקטעי רקמה. באמצעות אסטרטגיה זו, יצרנו שקופית וירטואלית אחת הכוללת 11 סמנים ביולוגיים ועוד שני כתמים היסטולוגית בשימוש תכוף: המטאוקסילין ואאוזין (H & E) ו-picrosirius אדום (PSR). מספר אוכלוסיות תאים החיסונית זוהו, ממוקם, כימות בתאי רקמות שונים התפלגות מרחבית שלהם נפתרה באמצעות מפות החום רקמות. אסטרטגיה זו מגדילה את המידע שניתן להשיג מדגימות קליניות מוגבלות, והיא ישימה בדגימות רקמה בארכיון, כולל רקמות שלמות, ביופסיה ממחט ליבה ומיקרומערכים לרקמות. אנו מציעים מתודולוגיה זו כמדריך שימושי עבור עיצוב מותאם אישית עבור זיהוי, כימות, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית ב TME.

Protocol

שלושה סעיפים FFPE סדרתי מ resected צהבת B וירוס (HBV)-קרצינומה של האדם hepatocellular המשויכים המרכז אשפוז דה לאוניברסיטת דה מונטריאול (צ'אם) Hepatopancreatoהמרה סרטן בסיס נתונים קליני דגימה ביולוגית מאגר (ביאובנק). חולים המשתתפים בבנק רקמות זה סיפק הסכמה מושכלת. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית (פרוטוקול מספר 09.237) והופיעה בהתאם להכרזת הלסינקי.

1. פרוטוקול המטאוקסילין ואאוזין (H & E)

הערה: H & E כתמים בוצע על ידי מתקן ליבת הפתולוגיה המולקולרית של מרכז דה Recherches du מרכז אשפוז דה לאוניברסיטת מונטריאול (CRCHUM) באמצעות שימוש multiprogram שקופיות רובוטי שקופית המערכת באמצעות התוכנית הבאה.

1. לצורך מיקוד, שקופיות לטבול 3 x עבור 2.5 דקות כל אחד בתחליף קסילן.
   התראה: התחליפים של קסילן דליקים, מגירויים בעור ומזיקים אם נשאפים.
2. עבור מחדש, לטבול שקופיות ב 100% אתנול 3x עבור 2.5 דקות כל אחד. רוחצים עבור 1 דקות במים מזוקקים כפולים (ddH₂O) להשקות מחדש.
3. . מודקון לעוד 1 דקות במטאוקסילין שטוף 3 x עבור 1 דקות כל אחד בתוך ddH₂O.
4. דגירה של 5 s עם אאוזין. שטוף 30 s עם 95% אתנול. לשטוף 2x עבור 1 דקות עם 100% אתנול.
   התראה: אתנול הוא דליק ומגרה בעין. אאוזין הוא מטרד עיניים.
5. עבור התייבשות, לטבול 3x עבור 1.5 מינימום כל אחד בתחליף קסילן. טעינת שקופיות באופן ידני.
   הערה: הזמן המשוער לביצוע חלק זה של הפרוטוקול הוא 30 דקות.

2. מולטיפלקס למקטעים של מקטעי FFPE

הערה: פרוטוקול זה הותאם מרוברטסון ואח '^.

1. לחות והתחדשות
   הערה: לפני בתיווך נוגדן התיוג של סעיפים FFPE על ידי IHC או mIF, יש להסיר את הפרפין. אי להסיר ביעילות את תוצאות הפרפין בהכתמים תת-מיטביים.
   1. מקום 4 יקרומטר מקטע רקמות ffpe שקופיות לתוך מחזיקי זכוכית. מתחת למכסה המנוע, לטבול את השקופיות בצנצנת Coplin המכילה 37 ° c מחומם מראש במשך 10 דקות.
      התראה: קסילן הוא דליק, מגרה העור, ומזיק אם שאפה.
   2. באופן ידני להתסיס את השקופיות עבור 10 s כל 2 דקות. חזור על 1x בקסילין טרי לעוד 5 דקות.
   3. במכסה הכימי, לטבול את השקופיות ברציפות עבור 5 דקות בכל אחד הפתרונות הבאים: 1) קסילן: אתנול (1:1 v/v); 2) 100% אתנול; 3) 70% אתנול; 4) 50% אתנול; 5) שלושים אחוז אתנול; 6) מלוחים באגירה פוספט (PBS).
      הערה: שמור את השקופיות ב-PBS עד שיהיה מוכן לבצע אחזור אנטיגן. . השאר את החלקים בשעווה מהתייבשות כל הזמן ייבוש החוצה יגרום לכריכת נוגדנים ספציפית ולכן כתמים ברקע גבוה.
2. בידוד אנטיגן המושרה
   הערה: אנטיגנים יכולים להיות רעולי פנים על קיבעון-קיבוע, מניעת כריכת נוגדנים וכתוצאה מכך הדמיה. השימוש במאגרי מיסוך אנטיגן והליכים מחדש באופן חלקי את הקונפורמציה הטבעית של האפיסקופים ובכך מחזיר זיהוי נוגדנים. סוג של מאגר אחזור אנטיגן ומשך צריך להיות ממוטב עבור תנאי הצריכה הספציפיים (למשל, המטרה, הנוגדן, רקמות, וכו ').
   1. לטבול שעווה שקופיות בצנצנת Coplin המכיל את הפתרון לאחזור אנטיגן (מתכון בטבלה של חומרים).
   2. מניחים את צנצנת הקופלין הסגורה בסיר לחץ חשמלי עם מי ברז. מפלס המים לא יעלה על חצי מגובה הצנצנת כך שהמים לא מתערבבים עם התמיסה לאחזור אנטיגן.
   3. סגור את המכסה ואת שסתום הלחץ של הסיר. לבחור לחץ גבוה עבור 10 דקות ולהתחיל. כאשר נעשה, לנתק את סיר, לשחרר את הלחץ, לפתוח את המכסה, ולשמור את הצנצנת בתוך תנור עבור 30 דקות, המאפשר לשקופיות להתקרר.
3. חסימה של איגוד שאינו ספציפי
   1. העבר את ארון התקשורת עם השקופיות לצנצנת של קופלין המלאה ב-PBS. לשטוף את מאגר אחזור אנטיגן עם PBS 2x עבור 5 דקות כל אחד.
   2. להקיף את חתכי הרקמה עם עט פאפ כדי ליצור מחסום הידרופובי. לטבול את השקופיות בצנצנת Coplin המכילה 0.1 M גליצין ב PBS. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: גליצין מגבש את קבוצות אלדהיד שנוצרו במהלך אחזור אנטיגן. קבוצות אלה יכולות לאגד נוגדנים ראשיים ומשניים באופן בלתי ספציפי.
   3. לשטוף את הפתרון גליצין ידי שטיפת 2x עם PBS עבור 5 דקות. מניחים את השקופיות לתוך תא לחות ומוסיפים פתרון חוסם מספיק כדי לכסות את כל מקטעי הרקמה. הימנע מהמכשול ההידרופובי. דגירה עבור 30 דקות ב RT.
      הערה: ניתן למצוא את המתכון לפתרון החסימה בטבלת החומרים. הפתרון החוסם אמור להכיל חלבון (לדוגמה, BSA) כדי לחסום אתרי איגוד שאינם ספציפיים. זה יכול גם לשלב חומרי ניקוי כמו טריטון X-100 או הרצף 20 להפחית את האינטראקציות הידרופוביות בין מטרות נוגדנים ורקמות, ובכך להפוך זיהוי אנטיגן סלקטיבי יותר. תוספת של 10% סרום סך מן המינים שבהם הרקמה מגיע היה לחסום קולטני Fc, ובכך להפחית את הכריכה לא ספציפית נוגדן. לבסוף, תוספת של 10% מהנסיוב ממינים הנוגדנים המשניים הועלו ב היה למזער את ההחזקה הישירה לא ספציפית של נוגדנים משניים לחלק הרקמה.
4. מדבקת אימונואופלוורנציה
   1. לשטוף עם הערוץ הPBS (0.1% v/v) 2x עבור 5 דקות כל אחד ולמקם את השקופיות בחדר הלחות.
   2. הוסיפו את הקוקטייל של הנוגדנים הראשיים שמושהים בפתרון חסימת. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c. נוגדנים ראשוניים ומשניים המשמשים למחקר זה מפורטים ברשימת החומרים.
      הערה: הקוקטייל של הנוגדנים הראשוניים צריך להכיל את הנוגדנים הגדלים במינים שונים, או מאותו מינים, אלא של איזוסוגים שונים. לקבלת רשימה של זוגות הנוגדן הראשי משני בשימוש זה להתייעץ מחקר שולחן 2. פרטים על כל הנוגדנים הנמצאים בשימוש נמצאים בטבלה של חומרים ושולחן 2.
   3. לשטוף עם הערוץ הPBS (0.1% v/v) 3x עבור 5 דקות ולמקם את השקופיות בחזרה לתוך התא לחות. בחשיכה, מוסיפים את הקוקטייל של נוגדנים משניים ואת הדגירה עבור 1 h ב RT.
      הערה: כאשר הנוגדנים העיקריים הם ממינים שונים, יש לבחור את הנוגדנים המשניים כך שכל אחד מהם נקשר רק לאחד הנוגדנים הראשיים ולא זה לזה. הדבר מושג בדרך כלל באמצעות נוגדנים משניים הגדלים באותו מינים כל עוד המין הזה שונה מהמין שבו נוצרו הנוגדנים העיקריים. במקרים שבהם הנוגדנים העיקריים גדלו באותו מינים אך יש להם איזוסוגים שונים, יש להשתמש בנוגדנים משניים ספציפיים.
   4. לשטוף עם הPBS-רצף (0.1% v/v) 3x עבור 5 דקות כל אחד. לשטוף עם ddH₂O. הסר את הנוזל העודף והר במדיה הרכבה עם dapi. אמצעי האחסון שבשימוש תלוי בגודל המקטע. בדרך כלל 40 μL מספיק כדי לכסות את פני השטח של שקופית מיקרוסקופ רגיל.
   5. הצב את שקופית הכיסוי על המקטע וסחוט בעדינות את מדיית הטעינה העודפת הנמנעת מיצירת בועות. תנו לשקופיות להתייבש 20 דקות ב-RT בחושך ולאחסן ב -4 ° c עד שהוא מוכן לרכישה.
   6. השג תמונות עבור כל הערוצים באמצעות סורק השקופיות כולו (ראה טבלת חומרים).
      הערה: הנוגדנים אומתו באמצעות רקמת קרצינומה של האדם hepatocellular כשליטה חיובית. עבור כל נוגדן ראשי, שלושה מקטעים סידוריים היו מוכתמים בנוגדן העיקרי, בקרת isotype, או רק חסימת פתרון בהתאמה ללא וריאציה בשאר פרוטוקול הכתמים. התמונות שנרכשו הושוו כדי לבסס את הספציפיות של ההכתמים. ההכתמים נחשב ספציפי כאשר האות בסעיף מודקות עם הנוגדן העיקרי היה דפוס צפוי היה בקלות להבדיל מהרקע. נוגדנים ראשוניים הנותנים אות ברקע גבוה או מרכיבים רקמת התוויות בסוג isotype ולא מקטעי נוגדנים ראשוניים נחשבו לא ספציפיים. הזמן המשוער להשלמת חלק זה של הפרוטוקול הוא 2 ימים. פקדים נדרשים כוללים: (1) פקד Isotype כדי ליצור את התרומה של איגוד לא ספציפי של הנוגדן העיקרי לאות הרקע. קטע אחד הוא מוכתם באותו אופן כמו רקמות לדוגמה אחרים למעט כי הוא מודטת עם נוגדן עם אותו סוג isotype ואת המקור של הנוגדן העיקרי אבל ספציפי ליעד נעדר בסעיף הרקמה. אם הנוגדן המתאים בקרת isotype אינו זמין, זה יכול להיות מוחלף על ידי סך IgG מאותו זן שבו הנוגדן העיקרי גדל; (2) אין בקרת נוגדנים מרכזית (כלומר, שליטה שלילית) כדי לבסס את הייחודיות של ההכתמים ולאמוד את התרומה של כריכה לא ספציפית של נוגדנים משניים לאות הרקע. במקרה זה, מקטע הפקד מוכתם באותו אופן כמו הסעיפים האחרים פרט לכך שאין נוגדן ראשוני; (3) בקרה חיובית כדי לקבוע כי הצביעת עובד. במקרה זה, הצביעת מבוצעת על מקטע רקמות כי ידוע לבטא את הסמן המזוהה על ידי הנוגדן העיקרי.

3. picro-סיריוס אדום (PSR)/מהיר הפרוטוקול מכתים ירוק

הערה: המטרה של כתמים זה הוא להמחיש fibrillar collagens I ו III בתוך מקטעי רקמת FFPE. פרוטוקול זה הותאם מסגנאני ואח '¹⁸. כל השלבים מתבצעים בכיפה כימית.

1. בצעו את הפעולות וההידרציה של מקטעי הרקמה הדומים לפרוטוקול של מדורים מורכיבים באופן מדומה עבור סעיפים FFPE (סעיף 2.1).
   הערה: אם המקטע להיות מוכתם בעבר השתמשו בתיוג immunofluorescence והפרפין כבר הוסר, שלבי הטעינה-מעבר החוצה שימושיים כדי להסיר את המדיה המועלת. DAPI אינו מוסר באמצעות הליך זה, אך הוא אינו perceivably להפריע לצביעת ה-PSR.
2. לטבול את השקופיות בצנצנת המכילה את picro-סיריוס אדום/מהיר הפתרון הירוק (מתכון בטבלה של חומרים) ו דגירה עבור 30 דקות ב-RT (יותר מ 30 דקות תוצאות מכתים לא ספציפי של הגרעינים של hepatocytes).
3. שוטפים את השקופיות במהירות ב-ddH₂O (5 מטבלים). אז, לשטוף במהירות אתנול 100% (5 מטבלים). לשטוף 30 s ב xylene-100% אתנול (1:1 v/v). . שטוף במשך 30 שנות בקסילין הר עם הרכבה מדיה (ראה טבלת חומרים) לפני קסילן התאדה לחלוטין (זה עוזר עם ההרכבה).
   הערה: הזמן המשוער לביצוע חלק זה של הפרוטוקול הוא 1 h.

4. הימנעות נוגדנים מחתכי רקמה

הערה: כדי לעשות שימוש חוזר בסעיפים של רקמה רציפה באמצעות תוויות, יש צורך בהסרה מלאה של נוגדנים ראשיים ומשניים. נוגדנים מאוגדים הוסרו כפי שתוארו בעבר¹³.

מחממים אמבט מים עד 56 ° c. לשים את הסעיפים בתוך צנצנת המכילה מאגר החשפנות (מתכון בטבלה של חומרים), לסגור את המכסה, ולחתום אותו עם סרט הפרפין סרטים כדי למנוע דולף במהלך הרעד.

1. שימו את הצנצנת בתוך מרחץ המים והמדגירה למשך 30 דקות עם עצבנות.
2. לשטוף 4x עבור 15 דקות כל אחד בתוך ddH₂O ב RT. לשטוף עם רצף הערוץ (0.1% v/v).
3. עד שיהיה מוכן לבדוק מחדש את החלק. עם הסיבוב השני של הנוגדנים הראשוניים
   הערה: הזמן המשוער לביצוע חלק זה של הפרוטוקול הוא 2 h.
4. לוודא את היעילות של הליך הימנעות נוגדן.
   הערה: לפני השימוש בפרוטוקול עבור הימנעות נוגדן בתוך הסדר תיוג סדרתי, את היעילות של הסרת נוגדנים ראשיים ומשניים צריך להיות מאומת.
   1. לבצע את הצביעת ורכישת תמונה של מקטע עם זוג נוגדן משני הראשי של העניין כפי שצוין בפרוטוקול מדומה החיסונית של מקטעי FFPE (סעיפים 2.1 – 2.4.6).
   2. על רכישת תמונה, לבצע הימנעות רקמות מאוגד הראשי משני מתחמי נוגדנים כפי שצוין בסעיפים 4.1 – 4.3.
   3. מודטה את המקטע עם נוגדן משני אותו התנאים בשימוש שלב 2.4.3.
   4. בצע כביסה, הרכבה ושלבי רכישת תמונות כפי שמצוין ב2.4.4 – 2.4.6.
   5. השוואה בין תמונות צד שנרכשו לפני ואחרי החשפנות כדי לקבוע אם האות הספציפי נעלם.
      הערה: השוואה של תמונות לפני ואחרי הסרת נוגדנים יאמת את היעילות של הליך הימנעות. עם זאת, זה נורמלי לראות עלייה באות הרקע בכל הערוצים, כמו גם דיפוזיה של DAPI. זה מגביל את מספר סיבובים של החשפנות שניתן לבצע באותו מקטע רקמות. . נראה ששלושה סיבובים של חשפנות הם המקסימום

5. רכישת תמונה

1. יצירת תמונות באמצעות סורק שקופית שלם.
2. השתמש בעדשת המטרה 20x 0.75 NA ורזולוציה של 0.3225 μm/פיקסל.

6. ניתוח תמונה

הערה: השיטה המתוארים כאן מתייחסת לדוגמה הנוכחית. נא עיין בטבלה 1 ובטקסט שיתאים לדגימות ספציפיות אחרות.

1. בצע יישור רקמות באמצעות מודול Tissualign של תוכנת ניתוח התמונה (VIS בפרוטוקול זה, ראה טבלת חומרים).
   1. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ולחץ על הכרטיסיה Tissuealign .
   2. יבא את התמונות שיש ליישר למגש השקופיות על-ידי הולך לקובץ | מסד נתונים ובחר את התמונה הראשונה שיש ליישר. חזור אל הכרטיסיה Tissuealign וטען את התמונה על-ידי לחיצה על לחצן טען במגש השקופיות. התמונה תופיע במגש השקופיות ובסביבת העבודה.
      הערה: יש לטעון רק את ערימת הריבית במגש השקופיות.
   3. חזור על השלב 6.1.2 עבור כל התמונות בסדר היישור, הטענת אותן זו אחר זו. לאחר שכל התמונות המעניינות ייטענו אל מגש השקופיות, המשך לקשר את התמונות על-ידי לחיצה על הבא בשלבי זרימת העבודה ברצועת הכלים.
   4. לאחר מכן, גרור ושחרר את התמונה השניה מעל התמונה הראשונה. התמונות הראשונות והשניות מקושרות כעת. חזור על שלב זה כדי שהתמונות האחרות יהיו מיושרות, בזו אחר זו, בצורה מסודרת. שם התמונה הראשונה ישתנה ויציין שהוא הקושר לתמונות האחרות. במקביל, התמונות המקושרות יוצגו בסביבת העבודה שבצד מגש השקופית.
   5. בשלב זה, יישר את התמונות באמצעות יישור אוטומטי, יישור אוטומטי או יישור ידני. תמיד עדיף לנסות את היישור האוטומטי תחילה. עבור יישור אוטומטי לחץ על לחצן הבא בשלבי זרימת העבודה (שלב 3) ברצועת הכלים.
   6. סקור את היישור האוטומטי על-ידי ניווט במיקומים שונים של הרקמה ומוודא חזותית שהמבנים המתאימים בתמונות שונות מסודרים באותו אופן בשני הממדים של התמונה.
   7. אם תוצאת היישור האוטומטי אינה משביעת רצון, שפרו אותה באמצעות פינים (השתמש במינימום של שלושה פינים לכל תמונה) המציינות תכונות של רקמת הומוולוגי בתמונות המקושרות. לאחר שהפינים ימוקמו במיקומים הומוולוגיים בתמונות המקושרות, למשתמש יש שתי אפשרויות: יישור אוטומטי או יישור ידני. לקבלת יישור אוטומטי לחץ על לחצן אוטומטי-ליישר בהתבסס על נקודות האצטרובל הנוכחי ברצועת הכלים. ליישור ידני, לחץ על הלחצן החל פינים ברצועת הכלים.
   8. כאשר היישור מרוצה, לחץ על הלחצן הבא בשלבי זרימת העבודה ושמור את התמונה המורכבת במסד הנתונים.
      הערה: יישור שש שקופיות המפרסות על 11 סמנים בתוספת התמונות H & E ו-PSR נדרשו 15 דקות בניתוח המוצג.
2. בצע זיהוי רקמות באמצעות הפרוטוקול המוגדר על-ידי המשתמש חבילת פרוטוקול 1 (APP 1, טבלה 1).
   1. פתח את מודול ניתוח התמונה של התוכנה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ניתוח תמונה ברצועת הכלים.
   2. יבא את התמונה המורכבת (מיושרת) על-ידי הולך לקובץ | מסד נתונים ובחירת תמונת הריבית ולחיצה על הכרטיסייה ' ניתוח תמונה ' בחזרה.
   3. פתח את תיבת הדו בחירת APP על-ידי לחיצה על סמל היישום הפתוח ובחר באיזו חבילת פרוטוקול ניתוח (APP) להשתמש. במקרה זה לבחור APP 1 עבור זיהוי רקמות.
   4. לאחר APP 1 נפתח, לאשר כי APP1 הוא עובד כראוי על ידי הולך מיקום רקמה שנבחרה לחיצה על לחצן התצוגה המקדימה . אם התוצאות משביעות רצון, עבור לשלב הבא.
   5. לחץ כדי להפעיל את APP 1 ולעבד את התמונה באמצעות ה-APP הנבחר.
   6. יצא את הנתונים (לדוגמה, תמונות, מדידות וכו ') כאשר הניתוח מתבצע על-ידי לחיצה על קובץ/ייצוא.
      הערה: APP 1 יוצר אזור מעניין (ROI) המדגיש את הרקמה (ROI רקמה) ומחשב את האזור של הרקמה.
   7. שמור את התמונה ששונתה עם ROI חדש שנוצר על ידי הולך לקובץ | . בסדר, שמור
      הערה: זיהוי הרקמה ויצירת ROI עם APP 1 בדוגמה שסופקה לקח 5 דקות בתחנת ניתוח התמונה המתוארת. השטח של הרקמה מעובד היה 3.2 ס מ².
3. לבצע פילוח רקמת לתוך משתית ו בתוך האפליקציה באמצעות APP 2 (טבלה 1).
   הערה: APP 2 עובד על הרקמה ROI מוגדרות מראש. APP 2 מחלקים את הרקמה לתוך ROIs משתית ו בתוך כימומה.
   1. פתח את המודול ' ניתוח תמונה ' על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ' ניתוח תמונה ' ברצועת הכלים.
   2. יבא את התמונה המכילה את רקמת ROI על-ידי הולך לקובץ | מסד נתונים ובחירת התמונה שנשמרה בשלב 6.2.7. חזור לכרטיסיה ' ניתוח תמונה ' וטען את התמונה על-ידי לחיצה על לחצן ' טען ' במגש השקופיות. התמונה תופיע במגש השקופיות ובסביבת העבודה.
   3. פתח את APP 2 באמצעות הדו בחירת APP כמו ב 6.2.3.
   4. הצג תצוגה מקדימה של APP 2 על-ידי עיבוד בשדה תצוגה נבחר. אם התוצאות משביעות רצון, הפעל את APP 2 על התמונה המלאה על-ידי לחיצה על לחצן הפעלה . כפלט של APP 2, הרקמה ROI מחולקת ב ROIs סטרומה ו-בתוך כימומה באזורים שלהם נקבע. לייצא תוצאות כמו ב 6.2.6. שמור את התמונה ששונתה כמו ב-6.2.7.
      הערה: הקמת הרקמה בסטרומה ובתוך מיכל באמצעות APP 2 נטלה 4 שעות בתחנת הניתוח המוצגת. השטח של הרקמה מעובד היה 3.2 ס מ².
4. זהה וכמת FoxP3^hiCD4 + תאים באמצעות הפרוטוקול המוגדר על-ידי המשתמש APP 3 (טבלה 1).
   הערה: APP 3 עובד על המוגדרים מראש ROIs משתית ו-כימומה.
   1. פתח את המודול ' ניתוח תמונה ' ויבא את התמונה המכילה את ה-ROIs סטרומה ו-"כימומה" כמו ב6.3.1 וב6.3.2. פתח APP 3 באמצעות תיבת הדו בחירת APP כמו ב 6.2.3.
   2. תצוגה מקדימה של APP 3 עיבוד בשדה נבחר של תצוגה מועשר FoxP3^hiCD4 + תאים. אם התוצאות משביעות רצון, הפעל את APP 3 בתמונה המלאה. כפלט של APP 3, כל בודדים FoxP3^hiCD4 + אובייקטים יהיו מתויגים קואורדינטות הרקמה שלהם מאוחסן. צפיפות של FoxP3^hiCD4 + אובייקטים ב-Rois משתית ו בתוך כימומה יהיה נחוש. יצא את התוצאות כמו ב 6.2.6.
   3. בצעו מיפוי חום רקמות של עצמים FoxP3^hiCD4 + מתויג.
      1. פתח את הפרוטוקול המוגדר על-ידי המשתמש FoxP3^hiCD4 + מפה באמצעות תיבת הדו בחירת APP כ6.2.3.
         הערה: FoxP3^hiCD4 + MAP משתמשת בקואורדינטות של FoxP3^hiCD4 + מתויג אובייקטים ליצירת מפות החום צפיפות. זיהוי וספירה של FoxP3^hiCD4 + התווית אובייקטים באמצעות APP 3 לקח 25 דקות בתחנת ניתוח תמונה תיאר. השטח של הרקמה מעובד היה 3.2 ס מ².
      2. הפעל את FoxP3^hiCD4 + מפה על-ידי לחיצה על לחצן הפעלה . לייצא את מפת החום הרקמה על ידי לחיצה על קובץ | ייצוא | . אזור עבודה
         הערה: מיפוי FoxP3^hiCD4 + התווית אובייקטים באמצעות FoxP3^HICD4 + מפה לקח 5 דקות בתחנת ניתוח התמונה המתוארת.
5. לזהות ולכמת CD8 +, CD68 +, MPO +, αSMA, ו CD34 + אובייקטים באמצעות הפרוטוקולים המוגדרים על-ידי המשתמש APP 4, APP5, APP6, APP7, ו-APP 8, בהתאמה (טבלה 1) כפי שנעשה בסעיף 6.4 כדי 6.4.3.2 טעינת האפליקציה של עניין בכל מקרה.
   הערה: יישומים 4 כדי 8 לעבוד על המוגדרים מראש ROIs משתית ו-כימומה.

Results

מבט כולל על האסטרטגיה לצורך המחשה, כימות ומיפוי אוכלוסיות תאים של עניין ב-TME
כדי לכמת אוכלוסיות תאים של עניין (COIs) בתאי רקמות שונים (TCs) ולאפיין את הארגון המרחבי שלהם, עיצבנו זרימת עבודה המשלבת טכניקות במחיר נוח וקל לשימוש ומגדיל את מידע המרחב שניתן להשיג מדגימות קליניות FFPE יקרות (איור 1). ראשית, מקטעים סדרתי מלאה הרקמה FFPE היה מוכתם עבור ויזואליזציה של COIs (למשל, תאים חיסוניים) ו TCs (למשל, משתית לעומת מצכיצ'ימה) (איור 1, שלב 1). יש לשמור על מספר הסעיפים העוקבים לצורך המוכתמת למינימום המאפשר הדמיה של תאי הריבית או הרקמה הדרושים לטיפול בשאלת המחקר. ככל שמספר המקטעים הסידוריים קטן יותר, העיצוב הגבוה יותר דומה לארכיטקטורת הרקמה והקונקורדנציה במקטעים רציפים. בנוסף, יכולת ריבוב ניתן להרחיב באמצעות שימוש חוזר של מקטעים מוכתם fluorescently באמצעות להתפשט ולגשש טכניקות¹⁹.

לאחר שנעשה שלבי ההכתמים, סורק שקופיות שלם שימש לדיגיטציה של התמונות. תמונות שנרכשו ממקטעים סידוריים היו מיושרים ומאוחדים לתוך שקופית מולטיפלקס וירטואלי בצורה אוטומטית (איור 1, סעיף 2). לאחר מכן, התשואה על הרקמה הייתה מקושרת עם פרוטוקול המוגדר על-ידי המשתמש שזיהה פיקסלים המשויכים לרקמה (ברזים) (איור 1, שלב 3). לאחר מכן, רקמת ROI הייתה מחולקת ל-TCs המוגדרת כ-ROIs נוספים. (איור 1, שלב 4). לאחר מכן, פרוטוקולים מוגדרים על-ידי המשתמש זוהו ומשתמשים ב-COIs ב-TCs שונים (איור 1, שלב 5). לבסוף, מפות החום רקמות של COIs נוצרו על בסיס צפיפויות שלהם קואורדינטות הרקמה שלהם (איור 1, שלב 6).

איור 1: ייצוג סכמטי של האסטרטגיה להמחיש, לכמת ולמיפוי תאים חיסוניים ב-TME. (1) מקטעים הסידוריים כל רקמה היו מוכתמים לתיוג cois ו tcs. מקטעים רקמות שלמות היו סרוקים באמצעות סורק שקופית שלמה. (2) תמונות שנרכשו מסעיפים סידוריים קושרו, מיושרים, והוכנסו בצורה אוטומטית באמצעות מודול ניתוח Tissuealign. תמונה מורכבת נוצרה מהיישור הדיוק הגבוה של תמונות בודדות. (3) נעשה שימוש בפרוטוקול המוגדר על-ידי המשתמש לזיהוי אוטומטי של פיקסלים המשויכים לרקמות (ברזים) בתמונה ללא הפרדות צבע. (4) הרקמה הייתה מחולקת ל-tcs (למשל, משתית וכימוסמה) שהוגדרו כ-rois. (5) משתמש פרוטוקולים שהוגדרו שימשו עבור זיהוי אוטומטי וכימות של Cois ב tcs שונים. (6) רקמת חום מפות של cois נוצרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הדמיה ממוחשבת ו-TCs
שלושה חלקים של הרקמה FFPE סדרתי שלמות של גידול מחדש מנושא עם HBV הקשורים קרצינומה hepatocellular היו מוכתם אחד או יותר סיבובים של כתמים כמו באיור 2א. סעיף הייתי מוכתם עם H & E כדי להראות את הארכיטקטורה רקמה, מורפולוגיה התא, כדי לקבוע פרמטרים רלוונטיים קלינית כגון סוג של ממאירות, כיתה הגידול, הערכה כוללת של חדירה חיסונית (איור 2ג). במקטע רציף II, שני סיבובים של mIF שימשו לתיוג הכבד כאשר התאים שאינם בתוך הבית (איור 2א). בסיבוב הראשון, כלים נורמליים וסרטניים היו דמיינו באמצעות CD34 כתמים של תאי האנדותל. בנוסף, תאים אפיתל (hepatocytes והאקנוציטים) זוהו באמצעות ציטוקרטין 8/18, ותאים פיברוגניים המופעל הכבד stellate זוהו כמו אלפא שריר חלק שרירים אקטין חיובי (αSMA +) תאים (איור 2ג). בעקבות רכישת תמונות, מקטעי רקמות הוסרו ובו עם נוגדנים נגד מקרופאגים (CD68), ו מיופיברופיצוצים (desmin). כדי לאפיין טוב יותר הגידול החיסונית לחדור, מקטע טורי הסמוך III היה מוכתם באמצעות שני סיבובים של mIF עבור סמנים הסלולר CD3, CD4, CD8, forkhead box P3 (FoxP3), ו myeloperoxidase (MPO). בכל המקרים DAPI שימש ככתם גרעיני. בסופו של דבר, סעיף III היה מוכתם עם כתם PSR ומוכתם בצבע ירוק מהיר כדי לדמיין קולגן fibrillar ופלח את הרקמה לתוך משתית ו מבאככימה (איור 2ג).

סורק שקופית שלמה מצויד בעדשה אובייקטיבית 20X שימש לדיגיטייז סעיפים ויטראז ' כדי ליצור שקופיות וירטואליות. שישה תמונות נרכשו משלושת הסעיפים הסידוריים (איור 2ב') והשקופיות הווירטואליות נותחו לאחר מכן באמצעות התוכנה לעומת הייצוג הסכימטי באיור 1.

מחקר תמונה
ניתוח התמונה הורכב מחמישה שלבים: 1) יישור רקמות; 2) זיהוי רקמות; 3) מקטעי רקמה; 4) הקוונפיקציה האוטומטית של COIs; ו-5) מיפוי חום רקמות. כל הפרוטוקולים לניתוח תמונה פותחו באמצעות מודול מחבר של תוכנת ניתוח התמונה מכונים בטקסט כמו APP.

התאמת רקמות
שישה שקופיות וירטואליות משלושה מקטעים סידוריים, המשתרעים על 11 סמנים ועוד כתמי H & E ו-PSR, נטענו לתוך מודול Tissualign של תוכנת ניתוח התמונה. לאחר מכן, התמונות היו מקושרות, מיושרים, ומקושרות באופן אוטומטי, הפקת התמונה של 11-plex בתוספת H & E ו-PSR ללא הפרדות צבע וירטואלי, המכילה את כל השכבות של התמונות הבודדות (דמויות 2A – C). היישור היה מדויק במקרה של תמונות שמקורן בסעיפים סידוריים סמוכים, מראה מבנה רקמות המקביל ממוקם ומסודרים בצורה הומולוגיים על יישור (איור 2C ו איור S1A). יתרה מזאת, היישור היה מדויק ברמת התא הבודדת עבור תמונות שמקורן באותו מקטע (איור S1B). הזמן ליישור אוטומטי תלוי במספר, בגודל, במורכבות ובדמיון של התמונות שיש ליישר. היישור של שש השקופיות הווירטואליות שהוזכרו לעיל לקח 15 דקות בתחנת VIS שלנו.

איור 2: צביעת מקטעי רקמה טורית ויישור תמונה. (א) סיכום הפריטים שנעשו בשלושה מקטעים סידוריים עבור ויזואליזציה של cois ו-tcs. מספרים בסוגריים מציינים ייעוד תמונה. עבור סעיפים II ו III, הרקמות הוסרו ונחקר מחדש עם קוקטייל שני של נוגדנים. (ב) סקירה של שש תמונות רקמה שלמות בודדות לפני ואחרי היישור רקמות (שמאל וימין, בהתאמה). סרגל קנה מידה = 3,500 μm. (C) תצוגה מוגדלת של תמונות מיושרות. סרגל בקנה מידה = 80 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איתור רקמות
ברגע שהתמונות היו מקושרות ומיושרות, ביקשו לזהות את הברזים (איור 3א). כדי לעצב APP עבור זיהוי אוטומטי של ברזים (APP 1, טבלה 1), ניצלנו שני מאפיינים להבדיל ברזים מפני פיקסלים לא קשור לרקמות. ראשית, אות DAPI (הלהקה הכחולה) מוגבלת הגרעינים, אשר נמצאים באופן בלעדי ברקמה, כלומר כל DAPI + פיקסלים הם תת-קבוצה של הברזים. שנית, ברזים יש אות אוטוטנטית גבוה יותר בלהקות הירוקות והצהובות בהשוואה לפיקסלים שאינם משויכים לרקמה. כתוצאה מכך, פיתחנו APP 1 עבור זיהוי רקמות (שולחן 1), אשר מזהה את הברזים מבוסס על אות בסיסית בערוצים אלה באמצעות טכניקות סף פשוטה. להקות הכחול, הירוק והצהוב הוגדרו כך שלברז היו ערכים בעצימות הרקע מעל לספי הנייר, בעוד שלפיקסלים שאינם קשורים לרקמה היו ערכים מתחת. APP 1 עבור זיהוי רקמות הוחל IIA התמונה, אשר מכיל שכבות בכחול, ירוק, וצהוב ערוצים (איור 3א). כמו התפוקות של APP 1, מסכה ירוקה בהירה הונחה על גבי הברזים, ו ROI בשם "רקמה" היה מתחום (פלט, איור 3א). יתר על כן, אזור הרקמה נקבע כמשתנה פלט כמותי. בגלל APP 1 לא לשלב את הפיקסלים לא משויך הרקמה לתוך רקמת ROI, הם לא נכללו בניתוח העוקבים מבוסס על זה ROI (איור 3A). הדיוק של APP 1 בזיהוי ברזים מוצג באיור 3א.

פילוח רקמות ותיחום ROIs עבור TCs
לאחר מכן, המשכנו להגדיר תאים שונים בתוך רקמת ROI ידי הגדלת הרקמה לתוך משתית לעומת מסכיצ'ימה. השתמשנו בתמונה המוכתמת psr (iiic, איור 2ג), שם משתית יכול להיות מוגדר כאזור המשויך התצהיר של fibrillar collagens (הלהקה האדומה), את המתחם כאזור שבו fibrillar collagens נעדרים, ואת הצבע מהיר ירוק נגד כתמים מנצחת (הלהקה הירוקה) (איור 3ב). יצרנו APP 2 (שולחן 1) כדי להפריד באופן דיגיטלי את ה-Tcs סטרומה ו-מצכימה. יישום זה פועל על רקמת ROI מוגדרת מראש (פלט, איור 3A) ושימושים מסטרומה ואזורים מייצגים לאמן את הכלי מסווג משולב במודול ניתוח תמונה. המסווג המיומן מקצה את הפיקסלים לתווית של משתית או ל-כימומה (סלמון וירוק, בהתאמה, איור 3ב). עם סיווג של פיקסלים, APP 2 להפעיל פעולות מורפולוגיות כיוון להגדיר את ROIs משתית ו בתוך כימומה (איור 3B ושולחן 1). הביצועים של APP 2 ב סיווג פיקסלים ויצירת ROIs בהתאמה מוצג באיור 3ב. בנוסף, APP 2 לכמת את האזור של משתית ואת בתוך המיקוכימה. לבסוף, אף על פי שפילוח מתבצע באמצעות המקטע המוכתם PSR, ניתן להעביר את אזורי השסטרומה והפרכימה שבמיתאר לכל תמונה המיושרת לתמונת PSR.

איור 3: אבחון אוטומטי של רקמות/פילוח והדור של ROIs המתאימים. (A) תמונה iia השתמשו כדי לזהות את הברזים (התמונה השמאלית, סרגל קנה מידה = 6,000 μm). מסכה ירוקה בהירה הוקצה הברזים באמצעות APP 1 (טבלה 1) יצירת ROI הנקרא רקמה (פלט 1). נכון, הזחה מראה תצוגה מוגדלת להפגין את הדיוק של APP 1 ב זיהוי ברזים. סרגל בקנה מידה = 350 μm. (ב) הרקמה ROI (פלט 1) מחולק לתוך משתית ו בתוך מיקרומטר באמצעות APP 2. התמונה בצד שמאל מראה תצוגה של רקמת ROI מחולקת לתוך ROI משתית (סלמון) ו-ROI מתוך הבית (ירוק). סרגל קנה מידה = 4,500 μm. מימין, תצוגה מוגדלת של כניסת הכניסה לרקמת ROI, מכתים PSR המקורי (תמונה IIIC), ואת ROIs משתית ו בתוך כימומה. סרגל קנה מידה = 250 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קוונפיקציה אוטומטית של COIs
לאחר מכן, המשכנו לזהות, לאתר, ולכמת COIs ב ROIs משתית ו בתוך מקוכימה. APPs 3 עד 8 (טבלה 1) נוצרו כדי לאתר ולספור את cois הבא: CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, MPO +, αSMA +, CD34 + תאים, בהתאמה. APP 3 נועד לאתר ולספור CD4 + FoxP3 + תאים (תמונה iiia, איור 2ג) כסמנים חלופיים של תאי T הרגולציה (tregs). פרוטוקול זה מזהה לוקליזציה של האות מתוך שעתוק הגרעין גורם FoxP3 (הלהקה האדומה) ו DNA תיוג צבע DAPI (הלהקה הכחולה). בהינתן כי הופעל לאחרונה תאי T upregulate FoxP3, כדי להעשיר עבור Tregs אנו להגדיר סף לבחירת מראש רק FoxP3 בהיר תאים (FoxP3^hi). הבא, מתוך כל התאים הנבחרים DAPI + FoxP3^hi , רק אלה שהיו מוקפים בצורת טבעת בהירה CD4 אותות (הלהקה הירוקה) היו מסומנים ונספרו FoxP3^hiCD4 + תאים (תווית ורוד, איור 4א). הצפיפות של FoxP3^hiCD4 + תאים ב Rois משתית ו בתוך כימומה נקבעו משתני פלט כמותי של APP 3 (איור 4א).

באופן דומה, APPs 4 עד 6 תוכננו לאיתור CD8 +, CD68 +, ו MPO + תאים. APPs אלה חולקים את אותו עיצוב בסיס לזיהוי וכימות COIs. באופן ספציפי, COIs מזוהים בהתבסס על עוצמת האות מתוך הסמנים הספציפיים של אוכלוסיית התאים, ולאחר מכן כמה שלבים מורפולוגית המעבד מופעלים כדי להתוות תאים בודדים (טבלה 1). התאים הבודדים או COIs הם מתויג, נספר, ואת קואורדינטות הרקמה שלהם רשום. APPs 4 כדי 6 גם לקבוע את הצפיפות של COIs ב ROIs משתית ו בתוך כימומה (איור 4B – D).

האיכות של כתמים DAPI שלנו לא היה מספיק טוב עבור שילוב של פילוח גרעינים לתוך APPs 3 אל 6, אז אנחנו לא יכולים להבטיח כי כל האובייקטים המוצגים בנפרד הם תאים בודדים. מסיבה זו, אנו מבטאים את צפיפות התאים בספירות של אובייקטים/mm² (איור 4). עם זאת, אגרגטים תא הופרדו בהצלחה לתאים בודדים בשלבי עיבוד הדואר שנבנו לתוך APPs 3 עד 6, ובדיקה חזותית נרחבת הראו כי האובייקטים המסומנים ביותר התכתב עם תאים בודדים.

לגילוי αSMA + ו CD34 + שטח, פיתחנו APPs 7 ו-8, בהתאמה (שולחן 1). יישומים שניהם לזהות את האות הספציפי מבוסס על ספי ולקבוע את אחוז השטח החיובי ב ROIs סטרומה ו מתחם (איור 4E – F).

אחת האפשרויות המעניינות ביותר ליצירת מגלשות במגה-וירטואליות היא ניתוח של ביטוי לוקליזציה. יצרנו APP 10 כדי לזהות התאמה לשפות אחרות בין αSMA ו desmin, שני סמנים מבוטא על ידי מיופיברופיצוצים בכבד. APP 10 משתמש ספי למציאת פיקסלים חיוביים עבור αSMA, desmin, ו αSMA plus desmin (טבלה 1). כמו משתני פלט כמותיים, APP 10 קובע את αSMA + אזור, desmin + אזור, ואת האזור של הביטוי המותאם לשפות אלה שני סמנים (S3 איור).

איור 4: זיהוי וקוונפיקציה של COIs ב-TCs משתית ו-מככימה. (א–ו) זיהוי אוטומטי וכימות של CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, MPO +, αSMA +, CD34 + COIs ב-ROIs משתית ו-בתוך כימומה באמצעות פרוטוקולים 3, 4, 5, 6, 7, ו 8, בהתאמה (טבלה 1). מוצג משמאל הם התמונות המקוריות, באמצע התמונות המעובדות ומימין לפני הכמת. לאיורים 4A – D, סרגל קנה מידה = 40 μm. לאיורים 4E ו- F, סרגל קנה מידה = 350 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כחלופה לכמת את COIs ב TCs סטרומה ו מדומה, קבענו צפיפות של תאים חיסוניים בגושים ממאירים שונים בשם 1 עד 4 (איור 5A, H, ואני). ההחזר עבור כל גולה היה מסומן באופן ידני כפי שצוין באיור 5א. רקמה ייחודית חתימות החיסון מאופיין כל גולה, עוד חושף את טרוגניות הפנימי של TME.

מפות חום רקמות
כפי שהוזכר לעיל, APPs 3 עד 8 מאחסנים את קואורדינטות הרקמה של כל חפץ שתויג בנפרד. תכונה זו מאפשרת את הדור האוטומטי של מפות רקמות שבהן אזורים בעלי צפיפות גבוהה של אוכלוסיית תאים נתונה מוצגים כנקודות חמות (אדום), ואזורים בעלי צפיפות נמוכה יחסית כנקודות קרות (כחול כהה). ערכי צפיפות בינוניים מוקצים צבעים בהתאם לסולם הצבעים המוצג באיור 5. מפות החום של רקמות נוצרו על ידי APPs שחילקו את התמונות למעגלים של 50 יקרומטר קוטר והוקצה צבע על פי צפיפות יחסית של coi נתון בתוך המעגל. כפי שמוצג באיור 5ב – G, דפוסי המיקום והפצת העוצמה של cois השונים ב-tme היו מגוונים למדי. יתר על כן, ברמה של גושים בודדים, ההסדר של אוכלוסיות שונות באזור הרקמה היה ייחודי (איור S2A-C). כדי לספק דוגמה של הכוח של טכניקה זו ולהמחיש את הארגון המרחבי של נקודות חמות של אוכלוסיות שונות באותו גולה, נקודות חמות של סוגי תאים בודדים חולצו באופן ידני ממופה יחד על קו המתאר של גולה 2 (איור S2, איור D, ואיור E).

איור 5: רקמת חום מפות של COIs ב TME. (א) picrosirius אדום הצביעת מראה מיקום של גושים 1, 2, 3, ו 4. (ב–ז) מפות חום רקמות עבור CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, MPO +, CD34 +, αSMA + COIs, בהתאמה. כחול כהה מציין דחיסות נמוכה יחסית, ואדום מציין צפיפות גבוהה יחסית. ערכי צפיפות ביניים מוקצים צבעים בהתאם לסרגל הצבעים המוצג. (H ו- I) הקוונפיקציה של cois ב גושים 1, 2, ו 3 + 4 מאורגן לכל סוג תא, לכל גולה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: ואלידציה של יישור רקמות. (א) CD34 צביעת (באדום) בסעיף II (קלט 1) משמשת ליצירת מסיכת CD34 בירוק (פלט 1). המסיכה הירוקה (פלט 1) מצופה בתמונת ה-H & E מהמקטע הטורי המיושר (קלט 2). תמונת המיזוג מציגה תכתובת מושלמת של מבני כלי הדם. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב) תמונה המציגה את המיזוג של DAPI, CD4 ו-FoxP3 (קלט 1) שימש להפקת תווית עבור CD4 + FoxP3 + תאים (פלט 1 באדום-ארגמן). תווית פלט 1 הועברה אל התמונה המיושרת (קלט 2) ומציגה תכתובת מושלמת בין זוגות FoxP3/DAPI, ו-CD4/CD3 בתמונת המיזוג. סרגל קנה מידה = 15 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דמות משלימה S2: מבט מוגדלת של מפות החום רקמות. (א–ג) מפות החום רקמות עבור CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, ו MPO + תאים גושים 1 – 4. סרגל ברים גושים 1, 2, ו 3 + 4 מייצגים 1,500 יקרומטר, 700 יקרומטר, ו 500 יקרומטר בהתאמה. (ד) מיתאר של גולה 2 עם קו אחיד שחור. (ה) מקומות חמים עבור CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, ו MPO + תאים בגולה 2 חולצו ממופה יחד על גולה 2 מוגדרת מיתאר D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

S3 דמות משלימה: ניתוח לוקליזציה של colocalization. (א) בצד שמאל ובאמצע הם תמונות של תווית αSMA ב ירוק ו desmin תווית באדום בהתאמה. מימין הוא αSMA/desmin אזור חיובי כפול בצהוב. (ב) קוונפיקציה של αSMA + אזור, desmin + אזור, ו αSMA/desmin כפול אזור חיובי. סרגל קנה מידה = 150 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

APP	מטרה	סיווג	סיווג	שלבים שלאחר עיבוד	משתני פלט
		שיטה	תכונות
			(ערך פיקסלים)
1	איתור רקמות	סף	ערוץ DAPI (150)	o סמן אובייקטים עם ערכי הסף המותאמים למעלה עבור 3 הערוצים	o רועי רקמה
			ערוץ FITC/A488 (120)	o סגור אובייקט חיובי 5 פיקסלים	o האזור רקמה
			ערוץ TRITC/A568 (40)	o צור רקמת רועי
2	פילוח רקמות	יער ההכרעה	החציון RGB-R	o מילוי חורים	הו רועי משתית
			החציון RGB-G	o ליצור ROI משתית	או אזור משתית
			תיכון RGB-B	o צור ROI כימומה	רועי א-כימומה
			החציון של IHS-S		באזור מתחם כימומה
			החציון של H & E אאוזין
3	כדי לאתר ולכמת CD4 + FoxP3 + תאים	סף	הערוץ DAPI (> 600)	o סמן אובייקטים עם לוקליזציה של DAPI ו Cy5/A647, מוקף באות FITC/A488	o ספירות וצפיפות של CD4 + FoxP3 + תאים ב-ROIs משתית ובתוך כימומה
			A488 פולי ערוץ החלקה (> 850)	o ברור אובייקטים קטנים יותר 7 יקרומטר2	o קואורדינטות של CD4 + FoxP3 + תאים בודדים
			ערוץ Cy5/A647 (> 800)
4	כדי לאתר ולכמת CD8 + תאים	סף	הערוץ DAPI (< 1200)	o נקה אובייקטים חיוביים קטן מ 15 יקרומטר2	o ספירות וצפיפות של CD8 + תאים ב-ROIs משתית ו בתוך כימומה
			ערוץ Cy5/A647 חציון (> 80)	o סגור אובייקטים חיוביים 2 פיקסלים	o קואורדינטות של תאים בודדים
				o הפרדת עצמים
מיכל 5	כדי לאתר ולכמת CD68 + תאים	סף	ערוץ FITC/A488 (> 200)	o נקה אובייקטים חיוביים קטן יותר 20 יקרומטר2	o ספירות וצפיפות של CD68 + תאים ב-ROIs משתית ו בתוך כימומה
				o ההתרחב אובייקטים חיוביים 3 פיקסלים	o קואורדינטות של CD68 + תאים בודדים
				o הפרדת עצמים
6	כדי לאתר ולכמת MPO + תאים	סף	הערוץ DAPI (> 400)	o ברור אובייקטים קטנים יותר 5 יקרומטר2	o ספירות וצפיפות של MPO + תאים ב ROIs משתית ו בתוך כימומה.
			ערוץ TRITC/A568 (900-4000)	o ההתרחב 3 פיקסלים אובייקטים חיוביים	o קואורדינטות של MPO + תאים בודדים.
				o הפרדת עצמים
7	כדי לאתר ולכמת αSMA + אזור	סף	ערוץ TRITC/CF568 (> 1050)	o נקה אובייקטים חיוביים קטן יותר 25 יקרומטר2	o ספירות וצפיפות של αSMA + שטח ב-ROIs משתית ומתחם כימומה
				o ההתרחב 3 פיקסלים אובייקטים חיוביים	o קואורדינטות של αSMA + פיקסלים
8	כדי לאתר ולכמת CD34 שטח	סף	ערוץ DAPI (< 5000)	o נקה אובייקטים חיוביים קטן יותר 25 יקרומטר2	o ספירות וצפיפות של CD34 + שטח ב-ROIs משתית ומתחם כימומה
			ערוץ Cy5/A647 חציון (> 120)	o ההתרחב 3 פיקסלים אובייקטים חיוביים	o קואורדינטות של CD34 + פיקסלים
9	יצירת מפות החום של רקמות עבור אוכלוסיית תאים מסוימת	מפת החום של האובייקט	מפת החום של האובייקט		o החום מפה
			ציור רדיוס 50 יקרומטר	---
10	התאמה לשפות אחרות בין αSMA לדסמאין	סף	ערוץ TRITC (CF568) (> 1050)	o להוספת תוויות לאובייקטים בעלי ערכי סף (CF568)	o מכמת ביטוי מקומי של αSMA ו Desmin
			ערוץ Cy5 (A647) (> 1000)	o סמן אובייקטים עם ערכי הסף מעל לCy5 (A647)
				o סמן אובייקטים עם התאמה לשפות אחרות של ערכי הסף עבור TRITC (CF568) ו-Cy5 (A647)
				o נקה אובייקטים חיוביים קטן יותר 25 יקרומטר2

טבלה 1: פרמטרים כלליים המשמשים לעיצוב של APPs המועסקים בניתוח תמונה. הפרמטרים שצוינו בטבלה זו מותאמים למאפיינים הייחודיים של התמונות המשמשות בניתוח זה (למשל, רקע, ממצאים וכו ') וייתכן שאינם ישימים לתמונות אחרות. מאחר שהשלבים שהוזכרו לאחר העיבוד הוגדרו עבור התמונות הספציפיות שנותחו במחקר זה, הן לא מפורטות במכוון. המשתמש צריך להתאים אישית את היישומים כדי לנתח את התמונות.

מקטע/צביעת	נוגדן ראשוני	נוגדן משני
סעיף II/1 כתמים	העכבר IgG2a אנטי אדם αSMA העכבר IgG1 אנטי אדם CD34 ארנב נגד האדם ציטוקרטין 8/18	עז נגד עכבר IgG2a CF568 עכברוש נגד עכבר IgG1 A647 חמור נגד הארנב A488
סעיף II/2 כתמים	ארנבת אנטי-אנושית דסמאין CD68 העכבר נגד האדם	חמור נגד הארנב A647 החמור נגד העכבר לdylight 755
סעיף III/1 כתמים	CD4 העכבר נגד האדם FoxP3 ארנב נגד האדם MPO עז אנטי-אנושיים	חמור נגד העכבר A488 חמור נגד הארנב A647 A568 חמור נגד עז
סעיף III/2 כתמים	ארנב נגד אדם CD3 CD8 העכבר נגד האדם	החמור נגד העכבר לdylight 755 חמור נגד הארנב A647

שולחן 2: הנוגדן משני זוגות עבור mIF.

Discussion

פשוט, נגיש, וקל לבצע טכניקות ריבוב המאפשרים רזולוציה מרחבית של תאים חיסוניים במקטעי רקמות נחוצים כדי למפות את הנוף החיסונית בסרטן והפרעות אימונולוגיים אחרים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה המשלבת תיוג זמין נרחב טכניקות ניתוח דיגיטלי כדי להרחיב את יכולת ריבוב הערכה רב מימדית של הדמיה מספר^12,13,17,19. הכתמים של שלושה סעיפים סידוריים עבור סמנים שונים, ושימוש חוזר של סעיפים באמצעות שיטות החשפנות והבדיקה החוזרת, איפשר לנו להמחיש 11 פרמטרים בנוסף לכתמי H & E ו-PSR. שישה תמונות מסעיפים אלה היו מיושרים בצורה אוטומטית באמצעות מודול יישור רקמות. היישור היה מדויק ברמת התא הבודד עבור תמונות שמקורם באותו מקטע ו concordant מאוד עבור תמונות שמקורם מקטעים השכנה. ריבוב וירטואלי איפשר לנו לקבוע כיצד סמנים דמיינו בסעיף אחד לקשר מרחב סמנים דמיינו בסעיף רציף אחר. בעוד כמה מהסטונים מתויג COIs, אחרים מתויג TCs, המאפשר לנו לכמת COIs ב TCs השונים. השימוש בכלי תוכנה עבור הקוונפיקציה האוטומטית של COIs מאוד פשוטה ומואצת עיבוד של תמונות. יתר על כן, ניתוח דיגיטלי הוחל על מקטעים רקמות שלמות במקום שדות התצוגה שנבחרו, והתוצאה היא ייצוג משוחדת של TME. יתר על כן, בגלל הקואורדינטות רקמות של COIs נרשמו, ניתן היה ליצור מפות החום רקמות.

קיימים מספר אזורים בפרוטוקול זה, שבהם ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות. ראשון, לאחזור אנטיגן עני יכול להשפיע על האיכות של mIF, ולכן סוג של מאגר אחזור אנטיגן ומשך צריך להיות ממוטב עבור התנאים הספציפיים של השימוש בקריטריונים/ביואריקר. שנית, סוג של פתרון חסימת שימוש צריך להיות מותאם לרקמות/אנטיגן/מינים של נוגדנים ראשי ומשני. בידינו, תוספת של 10% סרום סך מן המינים שבהם הרקמה מגיע קולטני Fc חסומים, ובכך מופחתת כריכת נוגדן לא ספציפית. תוספת של 10% מהנסיוב ממינים שבהם הנוגדנים המשניים הועלו לצמצום ההחזקה הישירה של נוגדנים משניים לחלק הרקמה. שלישית, אימות הספציפיות של הנוגדנים הראשיים והמשניים באמצעות הפקדים החיוביים והשליליים המתאימים הוא חיוני. רביעית, מוגברת של הפעלה פלואורסצנטית בערוצים מסוימים ודיפוזיה של DAPI על להתפשט הנוגדן העיקרי הם גם נפוצים. כדי לטפל autoפלואורסצנטית משופרת, השתמשנו בזוגות נוגדן ראשי/משני שבו האות המסוים היה ערכי עוצמה לפחות 5x זה של הרקע. לבסוף, כמה נוגדנים בעלי זיקה גבוהה לא ניתן להתחמק עם הליכים להתפשט קבוע. במקרה זה, אנו ממליצים להשתמש בנוגדנים כאלה בסיבוב האחרון של תיוג. ייתכן שהמשתמש יצטרך לנסות רצפי מכתים שונים כדי למצוא את התצורה המיטבית עבור הנוגדנים של הריבית. היעילות של החשפנות צריך להיות מאושר לפני שתמשיך הסיבוב השני או השלישי של תיוג.

המגבלה העיקרית והאתגר של אסטרטגיה זו היא למצוא את השילובים הנכונים של נוגדנים בעלי הפלורסנט הראשיים והמשניים עבור סמני העניין. מציאת נוגדנים עיקריים שהועלו במינים שונים או עם איזוסוגים שונים שניתן להשתמש בו זמנית מוגבל על-ידי מה שזמין מסחרית. רוב סורקי השקופיות מצוידים במנורות ומסננים המאפשרים הדמיה של חמישה ערוצים לכל היותר, ונוגדנים משניים במינים הנכונים והימני הנכון אינם זמינים תמיד. אנחנו באופן חלקי התגבר על מגבלות אלה באמצעות סטטינוגים סדרתיים ותיוג סדרתי. כמה שילובים נוגדנים אולי צריך להיבדק כדי להגיע לשילוב הטוב ביותר עבור סמני עניין. מגבלה נוספת היא האיכות של כתמים DAPI, כי החשפנות והבדיקה לא תמיד לאפשר ביצוע פילוח גרעינים.

מודול ליישר רקמות דורש הכשרה מינימלית ללא כישורי תיכנות ממשתמשים. התוכנה תיאורטית מאפשרת יישור של מספר בלתי מוגבל של תמונות. עם זאת, יישור מדויק תלוי בחידוש המקטעים, כאשר מקטעים קרובים יותר שconcordant היסטולוגית יותר מיושרים באופן מדויק יותר. השתמשנו מודול מחבר של VIS ליצירת APPs. הידע הבסיסי של ניתוח תמונה נדרש ליצירת אפליקציות, אבל זה במידה שווה את המקרה בעת שימוש בכל תוכנה אחרת ניתוח תמונה. היתרונות הייחודיים של VIS לעומת תוכנה אחרת ניתוח תמונה כוללים יישור אוטומטי של תמונות ממקטעים שהוכנו באמצעות שיטות שונות (למשל, IF, היסטיוכימיה, IHC). זה מאפשר לימודי לוקליזציה של סמנים מרובים של עניין באמצעות ריבוב וירטואלי. יתר על כן, העיצוב הגמיש וידידותי למשתמש של APPs מאפשר התאמה אישית ספציפית למשתמש. כימות אוטומטי ומיפוי, ואת האפשרות של עיבוד מקטעים רקמות שלמות, חוסך זמן ומפחית הטיה לעומת ספירה ידנית על ידי בדיקה חזותית.

אסטרטגיה זו היא כלי מחקר שימושי מאוד עבור אימונולוגיה רקמות בהקשר של סרטן וחסינות אוטומטית, אך נשאר בלתי מאומת לשימוש קליני. עם סטנדרטיזציה ואימות נוספים, ניתן להשתמש בו בעתיד עבור יישומים מרובים (למשל, כדי למפות את הנוף החיסונית בסרטן כדי לנבא ולנטר את התגובה לסוכנים חיסוני). זה יכול גם להיות מותאם למצבים דלקתיים שונים (למשל, מחלות מעי דלקתיות) לשלב הערכה פתולוגית עם סמנים התחזיות.

השלבים הקריטיים העיקריים בפרוטוקול זה הם היעילות/ספציפיות של התיוג והחוסן של האפליקציות המתוכננות עבור השימוש המיועד או ביואריקר. מכאן, אימות קבוע על ידי בדיקה חזותית, במיוחד על עיצוב APP חדש, הוא חיוני. השימוש היעיל בסיבובים מרובים של התפשטות ובדיקה מחדש או סוגים שונים של כתמים באותו מקטע הם רכיבים קריטיים ויכול להיות מסוים ברקמה או במקטע. אימות היעילות של תהליכים כאלה לפני שתמשיך בניתוח אצווה גדול הוא קריטי.

לסיכום, אנו מספקים אסטרטגיה הממגדלת את המידע הכמותי והמרחבי שניתן להשיג מדגימות של רקמות קליניות יקרות ערך. המשאבים, הציוד והידע הנדרשים ליישום מתודולוגיה זו נגישים באופן נרחב. אנו מציעים מתודולוגיה זו כמדריך שימושי עבור תכנון המתאר מכוון לזיהוי, כימות ומיפוי של אוכלוסיות תאים חיסוניים ב-TME.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תמיסת אחזור אנטיגן: מאגר נתרן ציטראט (10 מ"מ נתרן ציטראט, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)
תמיסת חסימה: 1% BSA, 10% סרום אנושי מסונן, 10% סרום חמור מסונן, 0.1% טווין 20 ו-0.3% טריטון באלבומין סרום בקר PBS
(BSA)	Multicell	800-095-EG
צנצנות קופלין (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)	היצע	חדש5300KIT
שקופיות כיסוי	Fisherbrand	12-545E 22*50
Direct Red 80	Sigma Aldrich	365548
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
אתנול 100%
סיר לחץ חשמלי	Salton
Eosin	Leica Biosystems	3801600	זהירותגירוי בעיניים
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252	זהירות, מזיק בשאיפה, בליעה וספיגת עור
מקטע FFPE (4μ), m) מחליק
גליצין 0,1 M בתמיסת
, גיל 1. ניסוח, חוזק רגיל	Ricca Chemical Company	3535-32
מחזיק (מחזיק צנצנת מכתים EasyDip)	Newcomersupply	5300RK
סרום אנושי	תאומים	22210
תא לחות	Millipore Sigma	Z670138-1EA
עט פאפ		abcam ab2601
PBS
PBS-Tween 20 (0.1% v/v)
Permount Mounting Media	Fisher Chemical	SP15-500
Picric Acid 1.3	Sigma Aldrich	P6744	זהירות, גירוי בעור ובעיניים
Picro-Sirius Red/Fast Green Solution: Fast Green 0.1% w/v + Sirius Red 0.2% w/v בתמיסת
נוגדן ראשוני Anti-αSMA	Mouse דילול IgG2a 1A4	Sigma A2547	1/100
נוגדן ראשוני נגד CD34	עכבר IgG1 HPCA1/763	Novus Biologicals NBP2-44568	דילול 1/250
נוגדן ראשוני אנטי ציטוקרטין 8/18	ארנב EP17/EP30	Agilent IR09461-2	מוכן לשימוש
נוגדן ראשוני נגד CD68	עכבר KP1	Abcam ab955	דילול 1/200
נוגדן ראשוני נגד דסמין	ארנב פוליקלונלי	Invitrogen PA5-16705	דילול 1/200
נוגדן ראשוני נגד CD4	עכבר N1UG0	Affymetrix 14-2444	דילול 1/250
נוגדן ראשוני נגד FoxP3	ארנב 1054C	R & D MAB8214	דילול 1/100
נוגדן ראשוני נגד MPO	עז פוליקלונל	R & D Systems AF3667	דילול 1/250
נוגדן ראשוני נגד CD3	ארנב SP7	Abcam ab16669	דילול 1/200
נוגדן ראשוני נגד CD8	עכבר C8/144B	Invitrogen 14-0085-80	דילול 1/200
נוגדן משני חמור נגד עכבר A488	Polyclonal	Invitrogen A-21202	דילול 1/500
נוגדן משני חמור נגד ארנב A488	פוליקלונלי	Invitrogen A-21206	דילול 1/500
נוגדן משני חמור נגד עזים A568	Polyclonal	Invitrogen A-11057	דילול 1/500
נוגדן משני חמור נגד ארנב A647	Polyclonal	Invitrogen A-31573	דילול 1/500
נוגדן משני חולדה נגד עכבר IgG1 A647	RMG1-1	Biolegend 406618	דילול 1/500
עז נוגדן משני נגד עכבר IgG2a CF568	Polyclonal	Sigma Aldrich SAB4600315	דילול 1/500
נוגדן משני חמור נגד עכבר DyLight 755	Polyclonal	Invitrogen SA5-10171	דילול 1/500
נוגדן משני חמור נגד ארנב DyLight 755	Polyclonal	Invitrogen SA5-10043	דילול 1/500
SDS	BioShop	SDS001,500	זהירות, רעילות לעור הפה ולעיניים
מכתים שקופיות רובוטי רב-תכליתי של שנדון	LabX	11384903
תחליף קסילן שאנדון,	תרמו פישר סיינטיפיק	CA89413-336	זהירות, דליק, גירוי בעור ובעיניים, מזיק בשאיפה
אמבט
SlowFade Gold antifade עם DAPI	Invitrogen	S36938
נתרן ציטראט Dihydrate	Millipore Sigma	1545801	זהירות, בופר הפשטת גירוי בעיניים
: יש לערבב 20 מ"ל 10% w/v SDS עם 12.5 מ"ל 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), ו-67.5 מ"ל מים טהורים במיוחד. מתחת למכסה אדים, הוסף 800 uL של אתנול 2-מרקפטו (ריכוז סופי של 114,4 מ"מ)
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML
Tris-HCl	BioShop	77-86-1
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
VIS Software	Visiopharm
סורק שקופיות שלם Olympus BX61VS	Olympus		מיקרוסקופ: סורק שקופיות אולימפוס BX61VS, סורק 5 שקופיות, במה ממונעת, פוקוס אוטומטי. מצלמה: מקור אור: Xcite-120. מסננים: BrightLine® סט מסנני סדאט (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)
קסילן	סיגמא אולדריץ'	214736-4L	זהירות, דליק, גירוי בעור ובעיניים, מזיק בשאיפת
קסילן: תמיסת אתנול (1:1 v/v)
2-מרקפטואתנול	סיגמא	M6250	זהירות, מזיק בבליעה, שאיפה, קטלני אם ספיגת החלקה. גירוי בעיניים. השתמש במכסה אדים