ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

עמידות מיקרוביאלית (עמרו) הוא משבר עולה אשר מהווה איום משמעותי על בריאות האדם ברחבי העולם. עמידות ביותר לאנטיביוטיקה דווחה, זיהומים הנגרמים על ידי חיידקים עמידים לכל התרופות הזמינות קלינית מתגלים. על מנת להילחם בעלייתו של עמרו, עלינו להגביר את הבנתנו את התופעה הרבת-הפנים הזאת ואת המנגנונים הבסיסיים והאינטראקציות בין אנטיביוטיקה לבין חיידקים. היבט אחד שהיה מבחינה היסטורית היטב הבינו הוא החדירות של אנטיביוטיקה לתוך חיידקים, יחד עם התופעות של הצטברות ו למחוק. ידע זה הוא חיוני בעיצוב תרופות חדשות והבנה מנגנונים של התנגדות. מכאן, זה משחק תפקיד קריטי במחקר עמרו.

ישנן שתי גישות עיקריות שניתן לנקוט כדי למדוד ריכוז אנטיביוטי: מדידת התרופה ישירות או תיוג עם moiety שנועד להקל על הקוונפיקציה. למרות תיוג משפר אנטיביוטיקה לגילוי, זה יכול לperturb את הפעילות הביולוגית של התרופה, כגון פעילות מיקרוביאלית וחדירות. זו אינה בעיה עבור שיטות לא מתויגות; עם זאת, זיהוי יכול להיות מאתגר. בשנים האחרונות, התפתחויות טכנולוגיות הובילו בום במחקר ניצול ספקטרומטר המוני (MS) כדי למדוד ישירות את הריכוז לאנטיביוטיקה בקטריה^{1,2,3,4,5,6,7}. מחקרים אלה הראו כי ניתן לחקור הצטברות תאיים במגוון של חיידקים, עם חיידקים גראם שליליים הנרחב ביותר לחקור. הקוונפיקציה של חדירות מולקולה היה אז קשור לפעילות ומשמש כדי ליידעאת פיתוח^{התרופה 2,3,4}, אם כי יש לנקוט זהירות כאשר הצטברות ישירה של פעילות היעד⁵. לפני MS פיתוח, האנטיביוטיקה היחידה אשר הריכוז ניתן למדוד ישירות היו אלה השתלט על הקרינה הפנימית, כגון טטרציקלין ו quinolones^8,9,10,11. למרות שברור שהטווח מוגבל בהיקף, הצטברות ואפלוקס נבדקו וכמותית, הממחישות את התועלת של כימות מבוססות-פלואורסצנטית.

שתייגת אנטיביוטיקה שימשו עשורים רבים כדי ללמוד הפצות, מצבי פעולה, והתנגדות, עם תגיות רדיואקטיביות ו פלורסנט להיות נפוץ. רדיו מתויג בבדיקות יש את היתרון של להיות זהה כמעט למתחם האב, ומכאן הפעילות הביולוגית סביר להיות שונה באופן משמעותי. איזוטופים כגון ³H, ¹⁴ג, ו ¹⁵N כבר בשימוש לעתים קרובות בשל הגדולה של רכיבים אלה באנטיביוטיקה, ומגוון של הפיגומים של אנטיביוטיקה נבדקו^1,10,12,13. בעוד הזיהוי של גלי רדיו הוא פשוט, יש מספר דאגות לוגיסטיות (למשל, בטיחות, מחצית חיים של איזוטופ) אשר הגבילה את השימוש בגישה זו. אסטרטגיה נוספת היא באמצעות פלואורוסקופים-אנטיביוטיקה מתויג. ניתן להשתמש בבדיקות אלה כדי לבחון את התפלגות ומצבי הפעולה וההתנגדות של התרופה הראשית, באמצעות טכנולוגיה פשוטה יותר מאשר MS וללא הבעיות הלוגיסטיות של קרינה⁸. החיסרון העיקרי של גישה זו היא כי אנטיביוטיקה הם בדרך כלל מולקולות קטנות יחסית, ומכאן המבוא של פלורסנט moiety מהווה שינוי כימי משמעותי. שינוי זה יכול להשפיע על תכונות פיזיוכימיות ופעילות אנטיבקטריאלי. לכן, הטיפול יש לנקוט כדי להעריך את הגורמים הללו כדי ליצור את נציג התוצאות של אנטיביוטיקה ההורה.

בעבודה זו, שיטה מתוארת כדי לסנתז, להעריך ולהשתמש באנטיביוטיקה פלורסנט, כמו בפרסומים הקודמים שלנו^14,15,16. במהלך העבודה הקודמת, מספר אנטיביוטיקה פלורסנט הוכנו ושימשו למגוון מטרות (ראה אבן ואח '⁸). כדי למזער את הסבירות להשפיע על פעילות ביולוגית, fluorophores קטנים מאוד משמשים בעבודה זו: nitrobenzoxadiazole (NBD, ירוק) ו-7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-כרומאן-4-YL (DMACA, כחול). יתר על כן, הערכה של פעילות אנטיבקטריאלי באמצעות מיקרומרק דילול הריכוז המינימלי העיכוב (MIC) היכולת מתוארת, כך ההשפעה של שינויים על פעילות ניתן למדוד. אלה בדיקה-מתויג fluorescently ניתן להשתמש ב spectrophotometric assays זרימה cy try, מיקרוסקופ. טווח של יישומים אפשריים הוא היתרון של אנטיביוטיקה פלורסנט שקרים. הצטברות תאית ניתן לכמת, מסווג, ו דמיינו, משהו לא אפשרי באמצעות MS לבד. הוא קיווה כי הידע הנרכש באמצעות אנטיביוטיקה פלורסנט יסייע ההבנה שלנו של התנגדות, ואת המאבק נגד עמרו.

1. סינתזה של אלקין-fluorophores

1. סינתזה של NBD-אלאלקין (7-ניטרו-N-(אביזר 2-yn-1-yl) benzo [ג] [1, 2, 5] oxadiazol-4-אמין)
   1. התמוססות 1,031 מ"ג של 4-כלורט-7-ניטרו-בנזיל (5.181 ממול) ב-60 מ ל של טטרהידרופורונה (THF). הוסף 1,857 מ"ג של CsCO₃ (5.696 mmol), ולאחר מכן 0.39 mL של propargylamine (6.1 mmol). לחמם את התגובה 50 ° c עבור 2 h, אשר יהפוך מחום לירוק, ואז קריר טמפרטורת החדר (RT).
   2. מסננים את התגובה באמצעות הסיוע סינון (ראה טבלת חומרים), ולשטוף עם אתיל אצטט (EA). לרכז את פילטרט תחת לחץ מופחת, ואז לפזר את השאריות ב 150 ml של EA ולעבור 500 ml הפרדת משפך.
   3. לשטוף את הפתרון EA עם 100 mL עם מים מלח בהתאמה. ואז לשלב את השלבים מימית ולשטוף 2x עם 100 mL של EA.
   4. מייבשים את השלבים האורגניים המשולבים באמצעות מגנזיום גופרתי, ואז מסננים ומתרכזים תחת לחץ מופחת.
   5. לטהר את המוצר גולמי על ידי פלאש כרומטוגרפיה על סיליקה ג'ל (20 – 30% EA באתר הנפט [PE]), בדיקת טוהר על ידי כרומטוגרפיה מאסיבית ספקטרומטר המסה (LCMS, [M + H]⁺ = 219.1) ו/או תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרוסקופיית, שינויים כימיים כדלקמן:
      מיכל ^בן H NMR (תקליטור₃OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, j = 8.7 hz, 1h), 6.35 (d, j = 8.4 hz, 1h), 4.31 (dd, j = 5.7 Hz, j = 2.5 Hz, 2H), 2.43 (t, j = 2.5 hz, 1h); מיכל ^{בן 13} C NMR (תקליטור₃OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.
      הערה: כאשר מבצעים טיהור בעזרת כרומטוגרפיה של סיליקה ג'ל, הכינו את הטור בעזרת הקוטביות הפחות של הממיסים המפורטים. תרכובת גולמי ניתן לטעון כפתרון מרוכז או נספחת על סיליקה אם מסיסות אינו מאפשר את זה. לאחר התרכובת נוספה לחלק העליון של סיליקה, לרוץ דרך 1-2 כרכים העמודה של הממס אותו בשימוש עבור הרטבה סיליקה. לאחר מכן להתחיל עם יחס הממס המפורטים, ריצה דרך לפחות 1 העמודה היקף של כל הממס, והקפד לא לעשות קפיצות גדולות הרכב ממס. לאסוף שברים, ולבדוק טוהר/זהות על ידי LCMS או אל-החום (כרומטוגרפיה שכבה דקה). לשלב שברים טהורים להתרכז תחת לחץ מופחת על ידי התאיידות רוטרי.
2. סינתזה של דמקא-אלקין (2-(7-(דימאמילמינו) -2-אוקסו-2H-כרומאן-4-yl)-N-(אביזר 2-yn-1-yl) מרחמיד).
   1. לפזר 5.02 g של 3-(dimethylamino) פנול (36.6 mmol) ב 30 מ ל של אתנול, ולאחר מכן להוסיף 6.7 mL של diאתיל 1, 3-acetonedicarboxylate אוחר (36 mmol). הוסף 10.5 g של_לש2 (77.2 mmol), ולאחר מכן ריפלוקס את הפתרון האדום עבור 42 h. ה9.20 וסיפו תוספת של כ-₂ מהתוספות של המשחק (67.6 mmol), ואז ריפלוקס עבור 8 h.
   2. לצנן את התגובה ולהתרכז תחת לחץ מופחת. לפזר מוצק אדום כתוצאה ב 200 mL של EA, מסנן, ולאחר מכן להעביר 500 mL הפרדת משפך.
   3. לשטוף את EA עם 200 mL כל המים והמלח, ולאחר מכן יבש מעל הלחות מגנזיום סולפט. מסננים את שלב אורגני מיובש ולהתרכז תחת לחץ מופחת.
   4. לטהר את אדום מוצק (אתיל 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) על ידי פלאש כרומטוגרפיה על סיליקה ג'ל (0 – 100% EA ב PE), בדיקת טוהר על ידי lcms ([M + H]⁺ = 275.1) ו/או nmr, שינויים כימיים
      מיכל ^בן H NMR (CDCl₃, 600 מגה-הרץ) δ 7.30 (d, j = 8.9 hz, 1h), 6.52 (dd, j = 8.9 hz, j = 2.6 hz, 1H), 6.40 (ד, j = 2.6 Hz, 1h), 5.87 (ז, 1h), 2.96 (ז, 8H), 2.25 (ד, J = 1.2 Hz, 3h).
   5. לפזר 488 מ"ג של אתיל 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) אצטט (1.18 mmol) ב 10 מ ל של thf, ולאחר מכן להוסיף פתרון של 157 Mg של lioh · H₂O (3.74 mmol) בתוך 15 מ ל של מים. מערבבים את התגובה ב RT עבור 3 h, ואז לעבור משפך הפרדה לדלל עם תוספת 50 mL של מים.
   6. לשטוף את תערובת התגובה 2x עם 50 mL של דיאתיל אתר (Et₂O), ולאחר מכן לשטוף את השלב האורגני המשולב 2x עם 25 מ ל של מים. קחו את כל הזרז צהוב עם השכבה האורגנית. לרכז את השלב האורגני תחת לחץ מופחת באמצעות מאייד רוטרי.
   7. Acidify השלב מימית ל-pH = 2 עם HCl מרוכז, וקריר עד 4 ° c ללילה. לסנן את השלב acidified ימית ולהוסיף את הצבע הצהוב מוצק לשלב אורגני מרוכז.
      הערה: 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) חומצה אצטית ניתן להשתמש ללא טיהור נוסף, אבל זה יכול להיבדק על ידי lcms ([M + H]⁺ = 247.1) ו/או nmr, משמרות כימיות כדלקמן:
      מיכל ^בן H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9.0 Hz, 1h), 6.62 (dd, j = 9.2 Hz, j = 2.8 hz, 1h), 6.52 ( d, j = 2.8 Hz, 1h), 5.98 (ד, j = 0.9 hz, 1h), 3.05 (ד, י =, 1 בחודש), ב (d , j = 2.35 hz, 2h); מיכל ^{בן 13} C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5.
   8. לפזר 466 מ"ג של 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-chromen-4-yl) חומצה אצטית (1.89 mmol) ב 7 מ ל של יבש n,n-דימתיתיל (dmf) ומקום תחת אווירה של חנקן.
   9. התמוססות 0.33 mL של propargylamine (5.1 mmol) ב 7 מ ל של יבש DMF תחת חנקן. הוסף 1.30 מ ל של די-איזופרופיל אמין (DIPEA, 7.50 ממול) לפתרון הצבע, ואז 535 מ"ג של O-(1h-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1, 1, 3, 3-טטרמתילורוניום hexafluorophosphate (בכצ, 1.29 mmol). מערבבים את פתרון הצבע המופעל עבור 15 דקות ב RT, לאחר מכן להוסיף את הפתרון מאמין dropwise, ולעזוב לערבב לילה.
   10. למחרת, לדלל את התגובה עם 35 mL של מים ואז להתרכז תחת לחץ מופחת.
   11. מחיצה הכתום כתוצאה מוצק בין EA ו מלח (100 mL כל אחד) ב 250 mL הפרדת משפך. הפרד את השכבות (להפעיל את שתי השכבות לתוך מבחנות שונות), ולשטוף את השלב מימית עם 100 mL של EA.
   12. לרכז את השלבים האורגניים המשולבים תחת לחץ מופחת, ולאחר מכן לפזר מחדש את הכתום ב 3 מ ל של 1:1 acetonitrile (ACN)/מים (v/v). לטהר את המוצר גולמי על ידי הזרקת אל השלב ההפוך לחץ בינוני נוזלי כרומטוגרפיה (MPLC) מערכת מצויד בעמודת מחסנית סי18 (ממס A: מים, ממס B: ACN).
   13. בדיקת שברים עבור טוהר על ידי LCMS ([M + H]⁺ = 284.1, nmr משמרות כימיות נתון למטה), ולאחר מכן לשלב ליאופליז שברים המתאימים לתת 2-(7-(dimethylamino) -2-אוקסו-2H-כרומאן-4-yl)-N-(אביזר 2-yn-1-YL) מרחאמיד, nmr שינויים כימיים כדלקמן:
       מיכל ^בן H NMR (600 מגה-הרץ, DMSO-d₆) δ 8.65 (t, J = 5.4 hz, 1h), 7.52 (ד, j = 9.0 hz, 1h), 6.72 (dd, J = 9.1, 2.6 hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.6 hz, 1H), 6.00 (s, 1h), 3.88 – 3.87 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1h), 3.01 (ים, 6h); מיכל ^{בן 13} C NMR (125 מגה-הרץ, DMSO-d₆) δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2.

2. סינתזה של אנטיביוטיקה פלורסנט

1. הכינו azide-נגזרות של אנטיביוטיקה כמתואר בעבר^14,15,16.
   הערה: ההליך הוא ספציפי לכל אנטיביוטיקה ודורש בדיקה קפדנית של יחסי הגומלין בין פעילות המבנה (SAR) של מולקולת האב כדי להבטיח שהאנטיביוטיקה הפונקציונליזציה תשמור על פעילות הדומה לאב. (למשל, ציפרופלוקסאצין¹⁶, לינזוכסה¹⁴, ו הטרימאופלרים¹⁵). ראה איור 1 לדוגמאות של אנטיביוטיקה פלורסצנט שפורסמה, וסכימת הסינתזה הכללית.
2. לחץ על הליך התגובה A
   הערה: עבור רוב האנטיביוטיקה, בצע את ההליך המפורט כאן עבור מזרז נחושת Huisgen [2 + 3] הוספת ציקלודה (שלב 2.1) ו-האלה הפלורסנט (מוכן בשלב 1).
   1. מניחים את azide-אנטיביוטי בתוך הבקבוקון התחתון עגול ולהוסיף טרט-butanol (^tbuoh) ומים (1:1 v/v, 25 מ ל כל לממול azide).
   2. הוסיפו את הפלואורוורידים-אלאלקין המוכנים בשלב 1.1 (3 eq) והחום את התגובה ל 50 ° c. ואז להוסיף נחושת סולפט (100 mM במים, 0.6 eq.) לתגובה, ואחריו חומצה אסקורבית (500 mM במים, 2.4 eq.).
   3. מערבבים את התגובה ב 50 ° c עבור 1 h, או עד ניתוח על ידי LCMS לציון השלמת התגובה (הצריכה המלאה של התחלת azide).
   4. מגניב את התגובה ולטהר לפי הצורך לגרדום אנטיביוטיקה ולהמשיך לטיהור או על ידי שלב 2.3 או 2.4.
      הערה: מספר שיטות טיהור שונות אפשריות, בהתאם לקוטביות וליציבות הגרדום.
3. לחץ על הליך התגובה B
   הערה: בצע הליך זה עבור אנטיביוטיקה מבוססת פפטיד, כדי לספק תנאי תגובה חזקים יותר (עבודה שלא פורסמה, פצאנג, 2019).
   1. מניחים את פפטיד azide-אנטיביוטי בבקבוקון התחתון עגול ולהוסיף מספיק DMF (750 mL/mmol azide) כדי להמיס.
   2. הוסיפו את הפלואורופור-אלאלקין המוכנים בשלב 1 (5 eq) והחום את התגובה ל-50 ° c עבור 1 h.
   3. הוסף נחושת (I) יודיד (20 eq.), ואז DIPEA (120 eq.), ואז חומצה אצטית (240 eq.).
   4. מערבבים את התגובה ב 50 ° c עבור 1 h, או עד הניתוח של LCMS מציין השלמת התגובה (כלומר, הצריכה המלאה של הפעלת azide). לצנן את התגובה ולהמשיך לטיהור על ידי שיטה 1 (ראה שלב 2.3).
4. שיטת טיהור 1 (משמש עבור ציפרופלוקסאצין, מתיונין ושינזוכסה)
   1. הכנס את תגובת הקליק המקורר ישירות אל עמודת מחסנית MPLC סי18.
   2. שילוב שלב ארוך לשטוף (בערך 10 דקות) בתחילת הפעלה (100% ממס A), ולאחר מכן להפעיל מעבר הדרגתי עד 100% ממס B, ואחריו חזרה ממיס A.
      הערה: ממיס ניתן לבחור מתוך מים, 0.05 – 0.1% החומצה פורמית (הפא) במים, 0.05-0.1% trifluoroacetic חומצה (tfa) במים, בהתאם מסיסות, יציבות, ואת הרזולוציה הטובה ביותר של פסגות. ממס B ניתן לבחור מ acetonitrile (ACN), 0.05 – 0.1% פא ב ACN, 0.05 – 0.1% TFA ב ACN, כדי להתאים את הממס A. אם הימנעות מוכיחה קשה, מתנול עשוי לשמש במקום ACN.
   3. לאסוף ולשלב שברים מתאימים, כפי שמצוין על ידי LCMS וצבע (המסה הנכונה נראה, שיא ייחודי), ואז ליסטליז לתת את (למחצה) אנטיביוטיקה פלורסנט טהורה.
   4. לטהר את המוצר במידת הצורך. הערכת טוהר על ידי NMR ו/או LCMS וכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות), תוך שימוש בטור ובשיטה המתאימה לגרדום.
5. שיטת טיהור 2
   הערה: אם מסיסות מאפשר, ניתן לבצע טיהור מחודש על ידי בדיקה מימית (משמש עבור macrolides, עבודה שלא פורסמה, סטון 2019).
   1. לדלל את תגובת לחיצה מקורר עם מים Et₂O (1:1 v/v, בערך 10-קיפול דילול מנפח התגובה הראשונית), העברת משפך הפרדה בגודל כראוי.
   2. הפרידו את השכבות ושטפו את השלב המים פעמיים עם Et₂O.
   3. רוחצים את השלבים האורגניים המשולבים 2x עם מים (נפח שווה עם שלב אורגני), ולאחר מכן יבש מעל Na₂SO₄.
   4. מסננים את שלב אורגני מיובש ולהתרכז תחת לחץ מופחת.
   5. טהר את המוצר הגולמי על-ידי המPLC ו/או ה2.4.4 כמתואר בשלב הפעולה.
      הערה: ראה איור 2 לדוגמאות של שלמות, שלמה ומטוהרים לחץ על עקבות lcms התגובה. התשואות טיפוסי מטוהרים עבור אנטיביוטיקה-fluorophore לחץ על טווח התגובות מ 30-80%.
      התראה: רוב הכימיקלים המשמשים בסינתזות אלה מחזיקים בסכנות בטיחות ספציפיות. יש לקחת את הזהירות בכל עת, כולל שימוש בציוד הגנה אישי. Et₂O, ^tbuoh, פא, חומצה אצטית, PE, EA, THF, ACN, Dmf, אטוה, dipea, propargylamine, ו-htu הם דליקים; להימנע ממגע עם מקורות חום או ניצוץ. THF, propargylamine, DIPEA, ^tBUOH, הפא, dmf, ו PE רעילים כולם; להימנע מחשיפה. Propargylamine, CsCO₃,_לב2, LIOH-H2O, Dipea, cui, הפא, חומצה אצטית, ו-HCl כולם מאכל; להימנע ממגע ולהיות מודע למגע פני השטח. האוכל_השני, קוסו₄, CUSO ו-PE מציגים סכנות סביבתיות; היות מודעים לתנאי סילוק. THF יכול ליצור מטעני נפץ; לטפל בתנאי אחסון. אזידים אורגניים הם חומר נפץ; לדאוג במיוחד עם ייצור בקנה מידה גדול.

3. הערכה של פעילות מיקרוביאלית

הערה: כל העבודה הכרוכה בחיידקים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום של השיטת או המעבדה. כל המדיה צריכה להיות אוטומטית לפני השימוש, ו פלסטלינה וציוד כגון פיפטות חייב להישמר עקר. מומלץ לבצע את העבודה בכיסוי ביולוגי (סוג 2).

1. פס גליצרול מניות של זנים חיידקיים המתאימים לגרדום אנטיביוטי על ליבסואז מרק אגר (LB, מוכן לכל הוראות היצרן), ולצמוח לילה ב 37 ° c.
   הערה: הבחירה של חיידקים כדי לבדוק את הפעילות אנטיבקטריאלי חייב להתבצע על בסיס הגרדום אנטיביוטי בשימוש. יש לבחור בטווח המייצג של 5 – 10 חיידקים מהזן הידוע כפגיע לאנטיביוטיקה, בהתחשב ביכולות הלוגיסטיות של המעבדה. אם אפשרי, חיידקים עמידים צריך גם להיבדק. הפרוטוקול שניתן להלן יעבוד על רוב החיידקים, אבל בדוק אם תנאים מיוחדים נדרשים (למשל, CO₂, מדיה מיוחדת) ולבצע שינויים לפי הצורך. החיידק הצליח להשתמש בתנאים האלה כוללים את סטייהילוקוצ'י, סטרפטוקוצ'י, באקל, אי קולי, קלבסילה דלקת ריאות, פסאודומונס aeruginosa, ו בידור faecium.
2. בחרו מושבה אחת מלוחית הרישוי, והתרבות שבין לילה ב-5 מ ל של ציר מילר-הינטון (CAMHB), שהוכן לפי הוראות היצרן ב-37 ° c.
3. לדלל את התרבויות לילה ~ 40-קיפול ב CAMHB ולצמוח לשלב באמצע יומן, צפיפות אופטית ב 600 nm (OD₆₀₀) = 0.4 – 0.8, כרך 5 מ ל).
4. הכנת פתרונות מניות של כל אנטיביוטיקה פלורסנט ב 1.28 mg/mL במים סטריליים, ו פיפטה 10 μL של אנטיביוטיקה לעמודה הראשונה של 96 צלחת הבאר.
5. הוסף 90 μL של CAMHB לעמודה הראשונה ו 50 μL לכל הבארות האחרות. לאחר מכן, בצע דילול של 2 בקיפול סדרתי על פני הצלחת.
6. לערבב ביסודיות, ולאחר מכן לדלל את התרבויות באמצע הפאזה כדי ~ 10⁶ המושבה ויוצרים יחידות (cfu)/mL ולהוסיף 50 μl לכל הבארות, כדי לספק ריכוז סופי של ~ 5 x 10⁵ cfu/mL.
   
   נפח של תרבות (ml) = (אמצעי אחסון מדיה ב-ml)/(OD₆₀₀ x 1,000)
   
   לדוגמה, עבור OD₆₀₀ = 0.5 תרבות בנפח המדיה הרצוי של 12 מ"ל, להוסיף (12/(0.5 x 1,000) = 0.024 mL של התרבות עד 12 מ ל של מדיה
7. לכסות את הצלחות עם כיסוי והדגירה ב 37 ° c עבור 18 – 24 שעות בלי לרעוד.
8. לבדוק חזותית את הצלחות, עם מיקרופון להיות הריכוז הנמוך ביותר ללא צמיחה גלויה.
   הערה: ראו טבלה 1 לקבלת מספר דוגמאות לאנטיביוטיקה פעילה ובלתי פעילה של פלורסנט.

4. ניתוח הצטברות בדיקה על ידי ספקטרופוטומטר וזרימה

הערה: צנטריפוגה פעמים אלה כבר אופטימיזציה עבור E. coli, כך שינויים קלים עשויים להיות נחוצים עבור מינים אחרים. נתונים מייצגים עבור הצטברות בדיקה מדווחת על הבדיקה המסומנת ב-NBD ציפרופלוקסאצין.

1. פס גליצרול מניות של זנים חיידקיים על LB אגר ולצמוח לילה ב 37 ° c.
2. בחרו מושבה אחת מלוחית הרישוי והתרבות לילה ב-LB ב-37 ° c.
3. לדלל תרביות לילה ~ 50-קיפול במדיה ולצמוח לשלב באמצע היומן (OD₆₀₀ = 0.4 – 0.8).
4. צנטריפוגה את התרבויות ב 1,470 x g עבור 25 דקות ו decant התקשורת.
5. להשעות את החיידקים ב 1 מ ל של מלוחים מאגור פוספט (PBS), אז צנטריפוגה ב 1,470 x g עבור 15 דקות.
6. Decant התקשורת ולהשעות מחדש את כדורי שנשטפו ב-PBS ל-OD הסופי₆₀₀ = 2.
7. במידת הצורך, הוסף 10.1 μL של קרבוניל ציאניד 3-כלורלוההידרהידרט (CCCP, 10 מ"מ ב-PBS) ל 1 מ ל של חיידקים (ריכוז סופי 100 μM) ו-דגירה ב 37 ° c עבור 10 דקות.
   הערה: CCCP ס היא מעכבי משאבה מהאפלוקס. תוספת של CCCP ס תאפשר את בחינת ההשפעה של אפלוקס.
8. צנטריפוגה את התרבויות ב 18,000 x g עבור 4 דקות ב 20 ° c ו decant התקשורת.
9. הוסף 1 מ ל של פתרון אנטיביוטי פלורסנט (10-100 μM ב-PBS) אל הגלולה, ו דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות.
10. צנטריפוגה את התרבויות ב 18,000 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c ו decant התקשורת.
11. . וחזור על שלב 4.9
12. חזור על שלב 4.10 כולל של 4x.
13. במקרה הצורך, חיידקים lyse על ידי הוספת 180 μl של מאגר הליזה (20 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, ו 2 מ"מ נתרן edta) אז 70 μl של ליזוזים (72 mg/mL ב H₂O).
14. מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות, ואז להקפיא להפשיר 3x (78-c ° צ' עבור 5 דקות, אז 34 ° c עבור 15 דקות).
15. Sonicate את הדגימות 20 דקות, ואז חום 65 ° c עבור 30 דקות.
16. צנטריפוגה את דגימות lysed (18,000 x g, 8 דקות), ואז לסנן דרך ממברנה 10 kda מסנן.
17. שטוף את הפילטר 4x עם 100 μL של מים.
18. להעביר את ליפוסט כדי שטוח למטה התחתון שחור 96 צלחת היטב ולמדוד את עוצמת הזריחה על קורא צלחת עם עירור ואורכי גל פליטה מתאים fluorophore (כלומר, DMACA: λ_ex = 400 ננומטר, λ_em = 490 nm; NBD: λ_ex = 475 ננומטר, λ_em = 545 nm).
    הערה: ראה איור 3 עבור דוגמאות של ניתוחים spectrophotometric של חיידקים באמצעות הניאון nbd התווית ציפרופלוקסאצין אנטיביוטיקה.
19. לניתוח על ידי הזרימה cy, לנסות את הצמיחה ואת התנאים כתמים ניתן להשתמש (צעדים 4.1 – 4.17), עם שינויים רק בהכנה הסופית.
    1. הביאו את הנפח הכולל ל-1 מ ל של PBS.
    2. לקרוא דגימות על cytometer זרימה בקצב הזרימה של כ 60 μL/min, באמצעות הגברה לוגריתמי עבור רכישת נתונים (F1 עירור = 488 nm; פליטה = 525/20 nm).
    3. רשום סך של 10,000 אירועים, ולאחר מכן נתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
    4. מתווה את עוצמת הקרינה מ-F1 נגד מספר האירועים הספירות, מעריך את עוצמת הקרינה החציוני מפסגות ההיסטוגרמה לאחר שהחיידק היה מוכתם.
       הערה: ראה איור 4 לדוגמאות של ניתוח cy, בקטריה של חיידקים באמצעות אנטיביוטיקה בעלת תווית nbd.

5. הכנה לאנליזה מיקרוסקופית

1. לגדול תת תרבויות כדי OD₆₀₀ = 0.4, כמו עבור הערכת מיקרופון, ולאחר מכן לחלק לתוך 1 מ"ל ali, וצנטריפוגה ב 18,000 x g עבור 3 – 5 דקות.
2. Decant ולמחוק מדיה, ואז להשעות מחדש את הגלולה חיידקים ב 500 μL של HBSS.
3. צנטריפוגה ב 18,000 x g עבור 3 דקות, לאחר מכן decant ולמחוק מדיה.
4. הכנת פתרונות לבדיקות אנטיביוטי ב HBSS בריכוזים של 1 – 100 μM.
5. להשעות את החיידקים שנשטפו ב-500 μL של פתרון הבדיקה, ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 30 דקות.
6. חזור על שלב 5.3. עבור ניסוי מרובה תיוג, להשעות מחדש את הגלולה ב 500 μL של צבע חומצה גרעין בצבע אורתוגונאלי. עבור ירוק, השתמש Syto9 (5 μM ב HBSS); עבור כחול, השימוש Hoechst 33342 (20 μg/mL ב HBSS). דגירה ב RT עבור 15 – 30 דקות.
7. חזור על שלב 5.3, ואז להשעות מחדש ב 500 μL של FM4-64FX (5 μg/mL ב HBSS) ו-דגירה ב-RT עבור 5 דקות.
8. חזור על שלב 5.3, לאחר מכן השהה מחדש ב 500 μL של HBSS, וחזור על שלב 5.3 פעם נוספת.
9. חזור על שלב 5.8, ולאחר מכן להשהות לבסוף שטף, חיידקים צבועים ב 15 μL של הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים).
10. פיפטה הרכבה בינונית על שקופית מיקרוסקופ ולמעלה עם שובר מכסה ביצועים גבוהים, ולאחר מכן חותם קצוות עם לק ברור ציפורניים.
    הערה: ראה איור 5 לדוגמאות של תמונות מיקרוסקופית מיקרוסקופיה שצולמו באמצעות התווית nbd ואנטיביוטיקה בתלת מימוניים, ובאיור 6 עבור dmaca-מתויג oxazolidinone (לינזוכסה) אנטיביוטיקה.

איור 1 מדגים את המפתח ללחץ כימיהמפתח (א) להכנת אנטיביוטיקה פלורסנט, עם (ב) דוגמאות של מבנים של אנטיביוטיקה שפורסמה שלנו הניאון מבוסס על ציפרופלוקסאצין (קפריסין), מתיונין (TMP), ו-linezolid. אלה בדיקה היו כולם מסונתז אנטיביוטיקה המקביל באמצעות ביניים אזיד. הם היו מצמידים לאחר מכן ל-NBD ו-DMACA fluorophores, כל אחד מהם תפקד עם האלקין.

איור 2 מראה כעקבות lcms של ציפרופלוקסאצין-N3 ו-הפקודה לחיצה על התגובה, שם אזיד להתחמק ב 3.2 דקות ואת המוצר ב 3.8 דקות. השוואת 1 ו- 2 מראה כיצד ההתקדמות של תגובת לחיצה יכול להיות אחריו היעלמות השיא אזיד (על ידי UV או MS גלאי). ספקטרה 3 להפגין את ההשפעה של טיהור, עם פסגות שגויות נעלמים העקבות MS ו UV. התקדמות הטוהר והתגובה יכולה להיות כמותית על-ידי שילוב פסגת המוצר וכל פסגות הטומאה.

איור 3 מדגים תוצאות אופייניות מן ההערכה של הצטברות תאיים על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית בנוכחות והעדר של אפלוקס. בניסוי זה טופלו E. coli עם TMP-nbd עם או בלי התוספת של cccp, אשר מצמצמת את כוח המניע של פרוטון (pmf). הזריחה התאיים של החיידק היה גבוה יותר באופן משמעותי כאשר מטופלים עם CCCP ס, והצביע על כך שאפלוקס הפחיתה את ההצטברות בחיידקים אלה. ניסוי זה חזר על ידי שימוש בחיידקים לקויה Tolc, הצגת היכולת של הספק הזה כדי לבחון את ההשפעה של רכיבים בודדים משאבת משאבה. במקרה זה, למרות שהיתה עלייה בזריחה תאיים בהשוואה לחיידקים סוג פראי, הצטברות CCCP עדיין גדל. ממצאים אלה מצביעים על כך Tolc לוקח חלק intmp אבל הוא לא משאבת pmf כונן הבלעדית מעורב.

איור 4 מראה את התוצאה של אותו ניסוי כמו איור 2, אבל עם ההצטברות שנמדד על ידי הזרימה cy, במקום ספקטרוסקופיה. אותם מגמות הנתונים נצפו, הוכחת כי גם הטכניקה ניתן להשתמש כדי ללמוד את התופעה של הצטברות מתווכת תאיים.

איור 5 מראה מיקרוסקופיה הנציגה בתמונות של גראם חיוביות (S.האורמיות) וחיידקים גראם שליליים (E. COLI) עם התווית TMP-nbd (1) ו קפריסין-nbd (2 +3) פלורסנט בהתאמה. בשני המקרים, צבע הקרום האדום FM4-64FX התווסף כדי להשוות שיתוף לוקליזציה. עבור ה-TMP-NBD, הצבע הכחול של חומצות גרעין Hoechst-33342 שימשו גם. על ידי הנחת התמונות הללו, הלוקליזציה של אנטיביוטיקה בחיידק היה דמיינו. השוואת לוחות 2 ו- 3 מראה כיצד ההשפעה של אפלוקס נבדק, עם המעכב מעכב cccp ס השתמשו ב 2, וכתוצאה מכך הצטברות תאיים. בלוח 3, לא נוספה שום cccp. מכאן, אפלוקס פעיל ולא נראה הצטברות בדיקה.

איור 6 מציג תמונות מיקרוסקופיה של הנציגה האנטי-מיקרוסקופית של גראם פוזיטיב (S. האורדיאוס) בקטריה עם תווית dmaca בעלת תווית של הגשושית לבדיקה. לצבוע את הקרום האדום FM4-64FX נוספה כדי להשוות לוקליזציה שיתוף, ואת הצבע הירוק חומצה גרעין הואכסט-33342 גם נעשה שימוש. על-ידי הנחת התמונות הללו, הלוקליזציה של אנטיביוטיקה בחיידק היה דמיינו, מראה לוקליזציה פנימית נבדל של קרום גרעין חומצה.

טבלה 1 מציגה ערכי MIC עבור שלוש סדרות של אנטיביוטיקה פלורסנט, ציפרופלוקסאצין, ילדים (TMP), ו-לינזוכסה (נקודת נחיתה), עם נתונים המוצגים עבור אנטיביוטיקה אב, nbd ו dmaca נגזרים של כל אחד. מינים מייצגים עבור כל אנטיביוטיקה נבחרו, כולל גראם חיובי ו גראם שליליים. עבור סדרת ציפרופלוקסאצין, שני בדיקה פלורסנט איבד פעילות אנטיביוטי לעומת התרופה ההורה, אבל שמרו על פעילות כנגד כל המינים. באופן דומה, הבדיקות הללו המשיכו לאיבוד בפעילות, אך נשארה בינונית עד לאנטיביוטיקה חלשה. ה-TMP בדיקה איבד כמעט את כל הפעילות נגד חיידקים סוג פראי, אבל היו פעילים נגד לקויה E. coli, המציין כי אובדן של פעילות אנטיבקטריאלי היה עקב חוסר הצטברות.

איור 1: סינתזה ומבנים של בדיקה הנגזרות מאנטיביוטיקה. (א) מערכת התגובה הכללית לסינתזה של בדיקה אנטיביוטית של הפלורסנט מ-azide-אנטיביוטיקה ו-אלקין-fluorophores. (ב) מבנים של הגששים שפורסמו שלנו מבוסס על ציפרופלוקסאצין, מתיונין, ו לינזוכסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מדידה של טוהר בדיקה לאנטיביוטיקה נגזר על ידי LCMS. שאריות LCMS אנליטיים (1) לא מושלמים, (2) השלם, ו (3) מטוהרים מטוהר ציפרופלוקסאצין-N3 + nbd-אלאלקין לחץ תגובות להפגין את היעלמות החומר ההתחלתי על השלמת התגובה, ופסגות שונות על טיהור. A = UV-Vis מעקב (ספיגת ב 250 ננומטר), B = MS מעקב (מצב חיובי ושלילי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: קורא לוחית מדידה של הצטברות בדיקה לאנטיביוטיקה נגזרת. מדידה ספקטרוסקופית פלואורסצנטית של הצטברות תאית של TMP-NBD (50 μM) בסוג פראי (1, ATCC 25922) ו Δ Tolc (2, ATCC 25922) E. coli מודולוציה (A) עם ו (ב) ללא תוספת של cccp (100 μm). משמעות סטטיסטית (* * p ≤ 0.01; * * * p ≤ 0.001) מוצג בין העדר או נוכחות של המק ובין סוג פראי ו-ΔTolcE. coli. נתונים שדווחו הם ממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים. איור זה מותאם מהפרסום הקודם שלנו15, וממחיש את השימוש בספקטרוסקופיה כדי להבהיר את התפקיד של הצטברות בהצטברות תאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מדידת זרימה cy, לנסות של הצטברות בדיקה לאנטיביוטיקה נגזרת. מדידת זרימה cy, מדידה של הצטברות תאית באמצעות TMP-NBD בסוג פראי (1, ATCC 25922) ו ΔTolc (2, atcc 25922) E. coli מודבטים עם ובלי תוספת של Cccp (100 μm). פעילות פלואורסצנטית חציון מוצג מ 10,000 אירועים חיידקיים, משמעות סטטיסטית (* * *, p ≤ 0.001; * * * *, p ≤ 0.0001) מוצג בין העדר נוכחות של המק ובין סוג פראי ו-ΔTolcE. coli. נתונים שדווחו הם ממוצע ± SD עבור שלושה ניסויים. איור זה מותאם מהפרסום הקודם שלנו15, וממחיש את השימוש של cy, לנסות להבהיר את התפקיד של אפלוקס על הצטברות תאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית של הלוקליזציה של בדיקה באמצעות NBD. תמונות מיקרוסקופית הקונסקופיה של 1) חיים S האורלנו עם תווית עם Hoechst-33342 (כחול, חומצת גרעין), TMP-nbd (ירוק), FM4-64fx (אדום, קרום), ו מצופה; 2) חיים E. coli מטופלים עם cccp (מעכבי אפלוקס) עם קפריסין-nbd (ירוק), FM4-64fx (אדום, קרום), ומצופה; 3) חיים E. coli מתויג עם קפריסין-nbd (ירוק), FM4-64fx (אדום, קרום), ו מצופה. איור זה מותאם מפרסומיו הקודמים15,16, וממחיש את השימוש במיקרוסקופיה לבדיקת לוקליזציה של בדיקה, כולל ההשפעה של אפלוקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית של DMACA-בדיקה לוקליזציה. תמונות מיקרוסקופית הקונקמיות של האורמות החיים בעלי תווית של כחול (בכחול), בדיקת רעלים ירוקה (ירוק, חומצת גרעין), ו-FM4-64fx (אדום, ממברנה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

. שולחן 1 פעילות אנטיביוטית של בדיקה אנטיביוטית בהתבסס על ציפרופלוקסאצין, trimethoprim, ושינזוכסה נגד זנים בקטריאליים המתאימים קלינית, כפי שנמדד על ידי מיקרודילול מיקרו מיקרופון assays. ברוב המקרים, הבדיקות איבדו פעילות בהשוואה לסמים ההורה, אבל שמרו על מספר מדידה של אנטיביוטיקה (מספיק כדי להיות שימושי במחקרים נוספים).

. למחברים אין מה להצהיר