Method Article

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לשתק קרו יחיד במכשירים מיקרופלואידים וכביכמת שינויים בקונמציות שלהם תחת זרימת הטיה. פרוטוקול זה שימושי לאפיון המאפיינים הביומכאני והפונקציונלי של biomolecules כגון חלבונים ו-DNA בסביבת זרימה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התנהגות מולקולה בודדת תחת הפרטורציה מכנית התאפיין באופן נרחב בהבנת תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, שיטות כגון מיקרוסקופ של כוח אטומי יש ברזולוציה מוגבלת בזמן, בעוד Förster העברת אנרגיה (לדאוג) רק לאפשר את התצורות להיות משתמעת. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, מאפשר בזמן אמת הדמיה באתרו של מולקולות יחיד בתנאי זרימה שונים. הפרוטוקול שלנו מתאר את השלבים ללכידת שינויים בbiomolecules בודדים תחת סביבות זרימת הטיה שונות באמצעות מיקרוסקופ קרינה. זרימת ההטיה נוצרת בתוך ערוצי microflu, ונשלטת על ידי משאבת מזרק. כמו הפגנות של השיטה, וון וילבלאנד מקדם (vwf) ו-DNA למדא מתויגים עם ביוטין ו fluorophore ולאחר מכן לקיבוע על פני הערוץ. הקונמציות שלהם מנוטרים ברציפות באמצעות הטיה משתנה באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) ומיקרוסקופ מיקרומוקד. הדינמיקה להתיר הפיך של VWF הם שימושיים להבנת כיצד תפקידה מוסדר בדם האדם, תוך היווצרות של DNA למדא מציע תובנות לביופיזיקה של קרו. הפרוטוקול יכול גם להיות מיושם באופן נרחב כדי ללמוד את ההתנהגות של פולימרים, במיוחד biopolymers, בתנאי זרימה שונים לחקור rheology של נוזלים מורכבים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מנגנונים של כמה biomolecules להגיב לגירויים סביבתיים נחקרו רבות. בסביבת זרימה בפרט, הטיה והכוחות הelongational מווסת את השינויים המומסבותית והעלולים לתפקד כbiomolecules. דוגמאות טיפוסיות כוללות להטות המושרה לאחר למבדה DNA ו פון Willebrand פקטור (VWF). DNA למדא שימש כלי כדי להבין את הדינמיקה של הפרט, שרשראות פולימר גמיש ו rheology של פתרונות פולימריים1,2,3,4. VWF הוא חיישן זרימה טבעי כי אגרגטים טסיות באתרי הפצע של כלי הדם עם שיעורי גזירה חריגים דפוסי זרימה. להתיר של VWF חיוני בהפעלת האיגוד של טסיות לתחום A1 וכריכת קולגן לתחום A3. בנוסף, גבוהה המושרה להטות את התחום A2 התגלגלות מאפשר את המחשוף של vwf, אשר מווסת את התפלגות המשקל המולקולרי שלה במחזור5,6. כך, הדמיה ישירה של איך אלה מולקולות להתנהג תחת זרימה יכול לשפר מאוד את ההבנה הבסיסית של הביומכניקה שלהם ותפקוד, אשר בתורו יכול לאפשר אבחון הרומן ויישומים טיפוליים.

מתודולוגיות טיפוסיות לאפיון הקונמציות חד-מולקולות כוללות פינצטה אופטית/מגנטית, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומולקולה חד-שגרתית של העברת אנרגיית תהודה (סריג)7. מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית כוח הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הכוח ואת התנועה הקשורים השינויים הקונפורבית של biomolecules. עם זאת, היא חסרה את היכולת למפות הקונמציות מולקולריות הכולל8. Afm מסוגל הדמיה עם רזולוציה מרחבית גבוהה אבל הוא מוגבל ברזולוציה הטמפורלית9,10. בנוסף, קשר בין העצה לבין המדגם עשוי לבלבל את התגובה הנגרמת על ידי זרימה. שיטות אחרות כמו nanopore וניתוחים לקבוע קיפול חלבון יחיד מולקולה ומדינות התפתחות מבוסס על זיהוי של מרחק מולקולרי מתוך וכולל כמויות. עם זאת, שיטות אלה עדיין בחיתוליו ומוגבלות בהתבוננות ישירה של קונמציות בודדות של מולקולה אחת11,12,13,14.

מצד שני, התבוננות ישירה בקרו באמצעות הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית תחת מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית השתפרה בהבנת הדינמיקה של מולקולה בודדת בתהליכים ביולוגיים רבים15,16. לדוגמה, פו et al. לאחרונה השיגה ויזואליזציה סימולטני של התארכות VWF ומחייב קולטן טסיות בפעם הראשונה. בעבודתם, מולקולות VWF היו מנוכי על פני השטח של ערוץ microflu, באמצעות האינטראקציות biotin-streptavidin והתמונה תחת סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (TIRF) בסביבות משתנות זרימת הטיה17. החלת שיטה דומה כמו פו של, אנחנו כאן להפגין כי קונמציות של VWF ו-DNA למדא ניתן לראות ישירות תחת השני TIRF ו-מיקרוסקופ הקונטמוקד. בדומה למוצג באיור 1, התקנים מיקרופלואידים משמשים ליצירה ולבקרה של זרימת הטיה, וbiomolecules מנודים על פני הערוץ. עם היישום של שיעורי גזירה שונים, תצורות של מולקולה זהה נרשמות למדוד את אורך ההארכה, המוצג גם באיור 1. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לחקור התנהגויות פולימר אחרות מתחת לסביבות זרימה מורכבות עבור מחקרים מרטילוגיים וביולוגיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת VWF

  1. מהווים מחדש את VWF פלזמה האדם כדי להכין אותו לתגובות תיוג. הוסף 100 μL של מים מוהים (DI) כדי 100 μg של VWF ה, והוא ליצור 1 mg/mL פתרון מניות VWF.
  2. Dialyze VWF פתרון מניות על מנת להסיר גליצין עודף, ובכך להגדיל את היעילות ביוטין ו fluorophore.
    1. העברת 50 μL של פתרון מניות VWF לתוך יחידת דיאליזה של 0.1 mL עם משקל מולקולרי של 10,000 לגזור וחותם עם כובע. אחסן את פתרון המניה הנותר ב-20 ° c. מניות VWF יהיה יציב עד 1 שנה ב-20 ° c.
    2. הפעל דיאליזה ב 500 מ ל של 1x סטרילי מואגור פוספט מלוחים (PBS) (0.01 m ניתרן פוספט, 0.0018 מונואוטאסיניום פוספט, 0.0027 m אשלגן כלוריד, 0.137 m נתרן כלוריד, pH 7.4 ב -25 ° c) עבור 1 h ב 4 ° c עם מקצב איטי. חזור על דיאליזה במשך שעה נוספת באמצעות 500 mL של PBS טרי.
  3. . התחילו בתגובת הביוטין לתיוג הכינו פתרון 2 מ"מ של ביוטין4-biotin על ידי המסת מוצק במים DI מיד לפני התגובה. המאפשר לארגוןהחברה להישאר במים למשך זמן ממושך יגרום לקבוצת הביולידזה לhydrolyze, ובכך להקטין את יעילות התיוג.
    1. הוסף 2.5 μL של 2 מ"מ-ביוטין4-biotin ליחידת הדיאליזה המכילה את פתרון המניה vwf. זה יגרום העודף הטוחנת של 20 מקפלים של ביוטין לעומת vwf monomers. אמינים הראשי של vwf יגיב עם הקבוצות של מדינת-אסתר, ובכך מחייב באופן כושל לקבוצות יתד4-biotin באמצעות קישור הגילאים אמיד.
    2. מניחים את יחידת הדיאליזה בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. אטום את יחידת הדיאליזה. עם הכובע המתאים תאבטח את הרכבת הדיאליזה. עם פארפilm לשמור זקוף ולצאת בטמפרטורת החדר עבור 40 דקות.
  4. התחל לתייג את תגובת התיוג. להכין פתרון 2.8 mM של אלקסה 488 הטטרלוקסיל-אסתר (TFP-אסתר) צבען פלורסנט (עירורmax = 498 nm, פליטהmax = 519 nm) על ידי המסת fluoropהור מוצק ב-DI מים. עשה זאת מיד לפני התגובה כדי למנוע את קבוצת TFP-אסתר מהידרוליזינג.
    1. הוסף 2.9 μL של 2.8 mM 488 fluorophore ליחידת דיאליזה. זה יגרום העודפים מתקפל 34 העודף של פלואורואופפור לעומת VWF monomers. אמינים הראשי הנותרים של vwf יגיב עם הקבוצות tfp-אסתר, ובכך מחייב באופן כושל fluorophores באמצעות קישור הגילאים אמיד.
    2. הוסף 2.0 μL של 1 M נתרן ביקרבונט (מומס במים DI) ליחידת דיאליזה. זה מתאים את ה-pH של התגובה קרוב 8.0, אשר מגביר את היעילות של התגובה TFP-אסתר ואת תגובת האמין העיקרי.
    3. אבטח את יחידת הדיאליזה בשפופרת מיקרוצנטריפוגה בדיוק כמו בשלב 1.3.2. חנות בחושך כדי למנוע הלבנה ולצאת בטמפרטורת החדר עבור 1 h ו 30 דקות.
  5. מניחים את יחידת הדיאליזה ב 900 מ ל של 1x מעוקר ו dialyze לילה ב 4 ° c. זה תניב כ 70 μL של שכותרתו VWF בריכוז של 0.71 mg/mL או 2.84 μM (ריכוז מונומר).
  6. העברה מתויג VWF לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום והגנו מפני אור. חנות ב -4 ° c. לאחסון לטווח ארוך, הוסף הסוכן האנטי מיקרוביאלית נתרן אזיד לריכוז הסופי של 0.02% (w/v).
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. הכנת דנ א למדא

  1. בbiotinylate אוחר למדא DNA על ידי מילוי אתרי הקצה המלוכדת שלה (cos אתרים) עם biotin-14-dCTP נוקלאוטידים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, חוזר כאן בשלב 2.118. מלא את שאר אתרי cos עם dATP, Dטרומבוציטופניה ו-dGTP נוקלאוטידים.
    1. להכין פתרונות 1 מ"מ של dATP, Dטרומבוציטופניה, dGTP ו biotin-14-dCTP במאגר התגובה 10x (500 mM נתרן כלוריד, 100 mM טריס הידרוכלוריד, 100 מ"מ מגנזיום כלוריד, 10 מ"מ dithioitol, pH 7.9 ב -25 ° c).
    2. מקום 48 μL של 500 ng/μL למדא DNA בצינור ה-PCR וחום של 5 דקות ב-65 ° c. אתרי cos של ה-DNA למבדה מעגלי יהיה להפריד תחת החום, להפוך את המולקולה ולעשות בודד תקוע החוצה מוכן לביוטילציה. מיד לאחר מכן, המקום על הקרח כדי למנוע מאתרי כי מחדש ריפוי.
    3. הוסף 5 μL מ-1 מ"מ dATP, Dטרומבוציטופניה ו-dGTP ו-4 μL של ביוטין 1 מ"מ-14-dCTP ל-DNA של למדא. גם להוסיף 2.5 μL של 5 U/μL Klenow מקטע (3 ' à5 ' exo-) כדי לזרז את סינתזה ה-DNA.
    4. מודב את תערובת התגובה 1 h ב 37 ° c.
    5. הוסף 1.2 μL של 0.5 M EDTA. ואז לחמם את תערובת התגובה עבור 5 דקות ב 70 ° c. זה יהפוך את הKlenow. לתגובת הביוטילציה
  2. הסרת נוקלאוטידים העודפים מ-DNA למדא באמצעות עמודת ספין שיכולה להכיל 10-70 μL ויש לו משקל מולקולרי 6,000 לגזור.
    1. הצב את הטור בתוך צינורית מיקרוצנטריפוגה של 2 מ ל. צנטריפוגה את העמודה ואת הצינור ב 1000 x g עבור 2 דקות. להיפטר זרימה-דרך זה אוספת בצינור.
    2. החלף את מאגר העמודות בפתרון 1x של אותו מאגר תגובות משלב 2.1.1. עשה זאת על-ידי הוספת 500 μL של מאגר 1x לעמודה. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 1000 x g. . היפטרו מהזרימה חזור על הפעולה 2 פעמים נוספות כך שסכום כולל של 1500 μL נוסף לעמודה.
    3. מקם את העמודה בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הוסף בזהירות את הפתרון משלב 2.1.5 לשכבה העליונה של העמודה. צנטריפוגה עבור 4 דקות ב 1000 x g.
    4. לאסוף את הזרימה-through (40-70 μL) מצינור המיקרוצנטריפוגה והמקום בצינור ה-PCR. זה מכיל את הדנ א. הטהור, הביוטיליס למדא
  3. תווית למדא DNA עם הפלורסנט YOYO-1 צבע (עירורמקסימום = 490 nm, פליטהmax = 509 nm) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, חוזר כאן בשלב 2.3.120.
    1. הכינו פתרון של הצבע YOYO-1 ו-DNA למדא עם צבע כדי הבסיס זוג היחס טוחנת של 1:10. נניח שאף דנ א אבד בשלב הטיהור כדי לחשב את הריכוז זוג בסיס של דנ א למדא. DNA למדא באורך מלא יש 48,502 זוגות בסיס.
      הערה: לדוגמה, אם 50 μL של הפתרון התאושש משלב 2.2.4, הוסף 7.4 μL של 500 μM YOYO-1 צבע.
    2. לחמם את הפתרון 2 h ב 50 ° c בחשיכה כדי להשלים את התגובה.
    3. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום והגנו מפני אור. חנות ב -4 ° c. הפתרון הוא כעת מוכן להיות מוזרק לתוך התקנים microfluidic.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. יצירת בתבניות ערוץ מיקרופלואידידים בסיליקון וופל

  1. השתמש בפוטוגרפיה כדי ליצור ערוצי microflu, עם מידות מתאימות (איור 2) על מאסטר סיליקון וופל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים19.

4. הכנת מכשיר מיקרופלואידיז (PDMS) פולימיקרומיתיל

  1. הוסף 5 חלקים סיליקון אלסטומר בסיס לחלק 1 ריפוי סוכן (על ידי מסה) בסירה שוקלים. מערבבים את התוכן ביסודיות עבור 1 דקות כדי ליצור פתרון מוקדם לריפוי PDMS.
  2. מניחים את המאסטר סיליקון וופל בצלחת פטרי מפלסטיק. יוצקים את הפתרון PDMS על וופל כדי ליצור שכבה 5 מ"מ. לכסות את הצלחת ולהשאיר desiccator תחת ואקום עבור 1 h כדי להסיר בועות אוויר.
  3. דגירה מכוסה צלחת פטרי ב 60 ° c לילה כדי לרפא PDMS לתוך מוצק גמיש. אשפרה תגרום לערוצי המיקרופלואידים היצוקים ב-PDMS בממשק ה-PDMS-וופל.
  4. חותכים 20 x 10 מ"מ מלבנים לתוך PDMS, סביב כל ערוץ מיקרופלואידיג, באמצעות תער. הסר את אבני PDMS מלבני עם מספריים.
  5. השתמש 25 גרם מחט בוטה עם קצוות מחודדים אגרוף חור 0.5 מ"מ בקוטר בקצה אחד של הערוץ, וודא החור עובר לחלוטין דרך בלוק PDMS (איור 2). השתמש מחט דקה אגרוף החוצה PDMS מן החור. חזור על הפעולה בקצה השני של הערוץ. זה יהיה ליצור מפרץ ומשקע לזרום דרך הערוץ.
  6. נקה את פני השטח של לחסום PDMS עם קלטת חדר נקי ויניל. לפוצץ גז חנקן דחוס מעל No. 1 1/2, 22 x 50 מ"מ coverslip כדי להסיר פסולת.
  7. מניחים את הבלוק PDMS עם צד הערוץ למעלה ואת שמיכות לתוך החדר של מכונת מליטה פלזמה. . התחילו את הטיפול
  8. כאשר הטיפול הושלם, במהירות למקם את לחסום PDMS על שמיכות כך הערוץ הוא במגע עם slip. הפעילו לחץ לאורך קצות הבלוק. הצב את ההרכבה coverslip-PDMS על צלחת חמה ב 115 ° c עבור 15 דקות כדי לחזק את הקשר הקבוע.
  9. הוסף 10 ס"מ-ארוך, 0.25 מ"מ בקוטר צינור פנימי לתוך חור השקע בחלק העליון של בלוק PDMS. הדבר מאפשר לנוזלים לזרום בקלות אל מחוץ לערוץ. . המתקן הושלם כעת

5. טיפול במשטח המכשיר המיקרופלואידיג

  1. הכנס < 10 μL של 10 μg/mL סרום ביולוגי חלבון אלבומין (BSA-biotin) הומס ב-1-PBS סטרילי לתוך הפרץ של התקן microfluidic עבור ניסויים VWF. הכנס < 10 μL של 1 מ"ג/mL BSA-biotin עבור ניסויים למדא DNA. מעכב כמה מיקרוליטר של BSA-biotin בקצה הפיפטה לאחר ההזרקה ולאפשר את הקצה להישאר מוטבע בתוך הים.
    1. שמרו תמיד על droplet של. מים מסביב לקצה זה ימנע בועות אוויר להיכנס לערוץ. החל טכניקה זו בכל פעם שפתרון חדש מוזרק לערוץ.
    2. אפשר BSA-biotin כדי דגירה במכשיר עבור 2 h. ה-BSA לא ייאגד במפורש למשטח הכיסויים (איור 3א).
  2. . הסר את קצה הפיפטה הכנס < 10 μL של פתרון לחסימת קזאין לתוך הערוץ ואפשר לו לעבור את המיקון למשך 30 דקות. הקזאין תחסום את כל האתרים החופשיים, ויפחית את הכבילה הbiomolecules לפני השטח (איור 3ב').
  3. הסר את העצה והזרק < 10 μL של 10 μg/mL streptavidin מומס ב-1x סטרילי לתוך הערוץ עבור ניסויים VWF. השתמש 100 μg/mL streptavidin עבור ניסויים למדא DNA. . מודטה למשך 10 דקות הstreptavidin ייאגד לקבוצות הביוטין של bsa-ביוטין (איור 3ג).
  4. הסר את העצה והזרק < 10 μL של פתרון ניקוי של 1 x (0.05% הרצף 20 ב-PBS) לתוך הערוץ כדי לשטוף את עודפי הstreptavidin.
  5. הסר את העצה והזרק < 10 μL של 28.4 ננומטר VWF מדולל בפתרון קזאין או DNA למדא משלב 2.3.3. מודטה VWF עבור 3 דקות. מודונט למדא DNA עבור 45 דקות (איור 3ד).
  6. הסר את העצה והזרק < 10 μl של 5 מילימטר ביוטין מדולל בתמיסה של קזאין. ביוטין חינם יחסום אתרי קשירה streptavidin עודפים על משטח הערוץ (איור 3E).

6. המחשה של VWF ו-DNA למדא תחת מיקרוסקופ קרינה

  1. הכינו 1 מ ל של פתרון לחסימת קזאין עם 2.2 מ"מ protocatechuic חומצה ו 37 nM protocatechuate-3, 4-diחמצון (כדי למזער את הלבנת התמונות). לטעון למזרק ולאבטח. במשאבת מזרק לקחת 30 ס"מ ארוך, 0.25 מ"מ בקוטר צינור פנימי ולצרף קצה אחד למחט המזרק. זרימה בתמיסה כדי להסיר בועות אוויר. הצמד את הקצה השני של הצינורית אל השקע של התקן microfluidic. מומלץ לעשות זאת 3 דקות לאחר שלב 5.6.
  2. בחר את מטרת ההגדלה הגבוהה ביותר (כלומר, 60-100X) של השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) או מיקרוסקופ ממוקד לקרינה פלואורסצנטית. להוסיף טיפת שמן טבילה על המטרה שלו במידת הצורך. מניחים את המכשיר microflu, מיקרופלואידים על הבמה במיקרוסקופ, כך הכיסויים מחליק עם המטרה.
  3. . תתחיל לעשות מיקרוסקופ ברייטפילד כוונן את המיקוד כך שכל התכונות, כגון פסולת ובועות, גלויות. לאחר מכן, כוונן את השלב בכיוון X ו-Y עד שקצה הערוץ המיקרו-פלואידיי גלוי וחוצה את המסגרת.
  4. מעבר לערוץ 488 (FITC). להתאים את רמת Z ואת זווית TIRF לפי הצורך עד בודדים ירוק, מולקולות כדורית ניתן להבדיל. אלה הם או המולקולות של VWF או DNA למדא.
  5. כוונן את זמן החשיפה ואת עוצמת הלייזר כדי להמחיש מולקולות פלורסנט מבלי לצלם אותם מהר מדי. להתאים את הניגודיות גם להמחיש מולקולות באופן ברור יותר.
  6. התחילו לזרום ממשאבת המזרק כך שפתרון חסימת הקזאין יזרום לתוך התעלה ומחוץ לשקע. לעשות את זה בדיוק 5 דקות אחרי שלב 5.6. לעצור ולהתחיל לזרום כדי להתבונן בשינויים ביצירת מולקולות. בעת החלת זרימה, שימוש בתעריפי השימוש בין 5,000 ל-30,000 μL/h. חזור על פעולה זו לאורך האזורים השונים של המכשיר המיקרו-פלואידיג. המשך תהליך זה כדי לאתר מולקולות שיכולות להאריך ולהירגע על מחזורים מרובים של הפסקה והתחלת זרימת.
  7. שים לב כמה זמן לוקח עבור מולקולות להגיע הארכה מקסימלית ולהירגע לחלוטין לתוך globules. הקלטת קטעי וידאו של התנהגות רציפה של מולקולות תחת זרימת הטיה, בחירת זמן החשיפה הטוב ביותר, תדירות חשיפה ומשך וידאו אשר ללכוד את הטווח המלא של התנהגות ההארכה ולמזער photobleaching לבנה.
  8. שמור את הסרטונים בשם. קבצי AVI עם scalebar.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

7. ניתוח תמונה של התאמות שינויים

  1. figure-protocol-1חישוב קצב ההטיה של הקיר () שהוחל על קרו באמצעות קצב הזרימה (Q) והגובה (h) והרוחב (w) של ערוץ המיקרו-פלואידיג המלבני. השתמש במשוואה הבאה כדי לעשות זאת:
    figure-protocol-2
  2. קבע את אורך כל הסמנים תחת שיעורי ההטיה השונים באמצעות קוד MATLAB מותאם אישית (ראה קבצים משלימים). צור תיקייה שכותרתו ניתוח וידאו הכולל את קודי MATLAB הבאים: main. m, save_each_frame מ, get_length. m וget_length תאנה צור תיקיית ממשנה בתוך ניתוח סרטי וידאו שכותרתו ' סרטי וידאו ' והוסף. קבצי AVI שיש לנתח לתוך זה.
  3. פתח את main. m באמצעות MATLAB 2019a ולהפעיל את הקוד. הקלד את שם קובץ הווידאו שיש לנתח בחלון הפקודה תחת נא הזן את קובץ הנתונים לניתוח:.
  4. בממשק המשתמש הגרפי הפתוח (GUI), קבע את הסף (טקסט בתיבה בקצה הימני העליון של החלון) עד 20 ולחץ על לחצן הסף הקבוע כדי לאשר.
  5. השתמשו בסמן נתונים בסרגל הכלים העליון של החלון כדי לבחור פיקסל אחד בכל מקום בסרגל הסרגל. לחץ על נקודת התחלה במקטע סרגל שינוי קנה מידה שבצד החלון. מיקום (x, y) של הפיקסל הנבחר יופיע מימין ללחצן. לחץ על לחצן גודל פיקסל (μm) . גודל הפיקסל צריך להיות נמדד פעם אחת בלבד בכל וידאו.
  6. לבחור פיקסל כלשהו על המולקולה של עניין. לחץ על נקודת ההתחלה בסעיף vwf . לאחר שהמיקום של הפיקסל הנבחר מופיע בתיבת הטקסט שמשמאל, לחץ על קצה שמאלי, קצה ימני ומחרוזת כדי לקבל את האורך המולקולרי בתמונה.
    הערה: ניתן להשתמש בשלב זה כדי לנתח את השינויים הקונספורמציה של כל ביואואלי, למרות הקוד בעל מקטע מסוים בשם Vwf.
  7. בדוק את הקצה השמאלי והימני של המולקולה. התקרבות והשתמש בסמן הנתונים כדי לבדוק את מיקום הפיקסל של הריבית. בחר באופן ידני את הפיקסל כסוף וחשב מחדש את האורך (בפיקסלים) בעת הצורך.
  8. הקלט את גודל הפיקסל ב-יקרומטר ובאורך המחרוזת במספר הפיקסלים לתוך גיליון Excel וחשב את אורך המחרוזת ב-יקרומטר.
  9. חזור על השלבים שלעיל עבור כל תמונה. השתמש אחרון, לחצן הבא בפינה הימנית התחתונה של GUI כדי לעבור בין תמונות באותו קובץ וידאו. לחץ על קרוב כדי לסגור את חלון GUI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צפייה בהתנהגות הדינמית של biomolecules כגון VWF ו-DNA למדא הוא תלוי מאוד במיטוב הכריכה שלהם למשטח המכשיר. הטיפול במשטח המים המומלץ במכשיר המיקרו-פלואידיג חיוני להשגת מחייב עם כמה נקודות מעגן, כך שמולקולות יכולות להאריך ולהירגע על הזרימה המשתנה. אם החלבונים או הדנ א מאוגדים חזק מדי עם קישורים מרובים, הם מתרחבים לאורכים מוגבלים או לא להאריך בכלל. זה מתרחש במיוחד עם vwf כאשר הוא נשאר ללא זרימה על פני שטח המכשיר עבור יותר מ 3 דקות לפני חסימת ביוטין חינם. Vwf ארוך יותר נשאר על פני השטח קפואה, הקבוצות ביוטין יותר vwf לאגד את פ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה של מולקולה בודדת שינויים באמצעות מיקרוסקופ הזריחה כפי שמתואר בשיטה זו, זה קריטי כדי לסקול את המולקולה למשך הזמן המתאים, למזער את האינטראקציות הלא ספציפיות שלה עם פני השטח ולבסס הגדרות מיקרוסקופ הפחתת הלבנת התמונות. היכולת של המולקולה לשנות באופן חופשי את הקשר למספר האינטראקציות הביוטין-streptavidin שנוצרו בין המולקולה לפני השטח. כפי שהוזכר קודם לכן, זה חייב להיות נשלט על ידי הדגירה של המולקולה ללא זרימה למשך הזמן המתאים. בנוסף, חלבון או DNA יכול לאגד באופן ספציפי כדי coverslip אם coverslip ל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע מענק DMS-1463234, המכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL082808 ו AI133634, ואת Lehigh באוניברסיטת מימון פנימי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ערכת תיוג Alexa Fluor 488InvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 עמודות ג'לBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501השתמש כביוטין חופשי בשלב 5.6
ביוטין-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-ביוטיןSigma-AldrichA8549
כיסוייםVWR48393-195מס' 1 ½, 22 x 50 מ"מ
dNTP סטמצופי ציפה Invitrogen10297018
למכשיר מיני דיאליזהThermo Scientific69588
שבר קלנוב (3'→ 5' exo-)New England BioLabsM0212Sהשתמש עבור מאגר תגובה 10X בשלב 2.1.1 ומאגר תגובה 1X בשלב 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
מיני מכשיר דיאליזהThermo Scientific6957010K MWCO, נפח 0.1 מ"ל
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuate 3,4-DioxygenaseSigma-AldrichP8279
חומצה פרוטוקאטכואיתסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-205818
ערכת אלסטומר סיליקון לייצור PDMSחברת Dow Chemical 4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
הפתרון החוסםCANDOR Bioscience110 050השתמש כתמיסה לחסימת קזאין לאורך כל הפרוטוקול
סרט ויניל לחדר נקי פישרסיינטיפיק19-120-3217
פון ווילברנד פקטור, פלזמה אנושיתMillipore Sigma681300
YOYO-1 צבעAAT Bioquest17580
0.25 מ"מ צינורות בקוטר פנימיCole-ParmerEW-06419-00
25 מד מחטתומאס סיינטיפיקJG2505X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles