האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

סיכום

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

תקציר

הגבלה endonuclease (ושהה) ההנדסה הספציפיות היא קשה מאוד. כאן נתאר פרוטוקול רב-שלבים המסייע בהפקת משתני ושהה המחמירים יותר מאשר האנזים ההורה. הפרוטוקול דורש יצירת ספריה של קלטות בחירת ביטויים (ESCs) עבור משתנים של ושהה, באופן אידיאלי עם שינויים במיקומים הצפויים להשפיע על איגוד ה-DNA. ESC מוקף בצד אחד על-ידי רצף עבור פעילות אתר ההגבלה הרצויה ותגית ביוטין ובצד השני על-ידי אתר הגבלה עבור הפעילות הבלתי רצויה ואתר ריפוי מתחל. ESCs משועתק ומתורגם ב תחליב מים בשמן, בתנאים הופכים את הנוכחות של יותר ממולקולה DNA אחת לכל droplet סביר. לכן, ה-DNA בכל מולקולה קלטת נתון רק לפעילות של האנזים מתורגם, מקודד. ושהה משתנים של הספציפיות הרצוי להסיר את תג ביוטין אבל לא את האתר ריפוי פריימר. לאחר שבירת אמולסיה, מולקולות ה-DNA הם חשופים ביוטין הנפתח, ורק אלה בסופרנטנט נשמרים. שלב זה מבטיח כי רק ESCs עבור משתנים שלא איבדו את הפעילות הרצויה נשמרים. מולקולות הדנ א האלה. נתונים לתגובת ה-PCR הראשונה המחשוף ברצף הבלתי רצוי חותך את אתר הכריכה הפריימר עבור אחד התחל. לכן, ה-PCR מגביר רק מטיפות ללא פעילות בלתי רצויה. תגובת ה-PCR השנייה מבוצעת לאחר מכן כדי להציג מחודש את אתר ההגבלה עבור הפירוט הרצוי ואת תג ביוטין, כך שניתן יהיה לשוב ולשוב בשלב הבחירה. מסגרות קריאה פתוח שנבחרו יכול להיות מבוטא יתר על התאים חיידקי כי גם לבטא את קנצוני מתילאז של ושהה הורים, כי התפתחו החדש ושהה מטרות רק תת קבוצה של אתרי היעד מתילאז.

מבוא

הנדסת הסדרה ספציפיות מאתגר מאוד עבור class II מרינרס. בכיתה זו של end, הכרה רצף ומזרז הם שזורים היטב, כנראה כהגנה אבולוציונית מפני יצירת endonucחכירה של ספציפיות יותר מאשר קנצוני מתילאז, אשר נזק DNA מארח. האבולוציה בבימויו של בתאי המינים החדשים בתאים הוא מסובך יותר על ידי הצורך להגן על הדנ א מארח נגד פעילות endonuclease החדש הנדסה. לכן, יש רק כמה ניסיונות מוצלחים של ושהה הנדסה דיווחו וכולם לנצל את התכונות הייחודיות של אנזים מסוים^{1,2,3,4,5,6,7}.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הנדסה ספציפיות שניתן להשתמש בהם כדי ליצור משתנים endonuclease כי יש ספציפיות יותר מאשר אנזים הורים המבוסס על הנדסה מוצלחת שלנו endonuclease⁸. עבור כל אנזים כזה עם רצף הכרה שרירותי, ניתן להציג ספציפיות נוספות עבור בסיסים באגפים. עבור אנזימים הורים המכירים רצפים מנוונת חלקית (כגון NlaIV עם היעד שלה GGNNCC), פרטים נוספים יכולים גם להיות מוצגים בתוך רצף ההוקרה. כמו ספציפיות יותר סביר להניח שידרוש אנטי-DNA חלבונים, הבסיסים שזוהו לאחרונה צריך לשקר בתוך טביעת הרגל של endonuclease הורים ב-DNA. בעיקרון, ניתן להגדיר סכימות בחירה עבור כל התמחות רצויה של רצף ההוקרה. עם זאת, רוב הקצאה כי מזהה palin, וכמעט palin, רצפים היעד הם דימרים פונקציונלי המכירים רק חצי האתר של הפאלאינדרום. מכאן, מבחר של הקשר החדש שמפר את סימטריה של אינטראקציות גרעין החלבון סביר לעבוד. עבור dimeric NlaIV, למשל, את הרצף GGNNCC יכול תיאורטית להיות מצטמצם כדי GGATCC אבל צמצום ספציפיות למטה GGAACC צפוי להיות קשה יותר. המזימה שלנו כרוכה בבחירה חיובית ושלילית.

התהליך יעיל יותר כאשר בחירה שלילית משמש גם כדי להסיר את specificities מסוגל לקליב את כל הרצפים מלבד ספציפיות צר המועדף. לדוגמה, בחירה עבור GGATCC יכולה להיות משולבת עם בחירה בניגוד ל-GGBVCC (כאשר B הוא כל בסיס אחר מ-A, ו-V הוא כל בסיס אחר מ-T). כאשר חלק מרצפי היעד האפשריים אינם מכוסים, תוצאת ניסוי הבחירה תלויה באפקטיביות של בחירה חיובית ושלילית. בעבודה NlaIV שלנו, בחרנו GGATCC, ו נגד GGSSCC (כאשר S הוא G או C), והשיג ספציפיות, התעלמות מטרות שבירת סימטריה, ניתן לתאר כ-GGATCC (כאשר W הוא A או T), הרומז כי במקרה מסוים זה, בחירה שלילית היה יותר חשוב מבחירה חיובית.

הגישה שלנו מתחילה ביצירת קלטת בחירת ביטוי (ESC). ESC מובנה במקטעים. בחלק הליבה הפנימי, יש משתנים של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של ושהה, תחת T7 פקד יזם. אזור ליבה זה של ESC אינו יכול להכיל כל אתר קנצוני עבור ושהה הנדסה. הליבה דחוקה בין שני אתרי קנצוני לסוג פראי ושהה: אתר מחשוף לפעילות בלתי רצויה (מונה הרצף שנבחר, ggsCC בדוגמה זו) ואתר מחשוף עבור הפעילות הרצויה (רצף נבחר, ג 'טאלידיעהבדוגמה). השלב האחרון של הכנת ESC ב-PCR מוסיף ביוטין קרוב לפעילות הרצויה בסוף 5 ' ויוצר מגוון של רצפים שנבחרו מונה (ggsscc בדוגמה). אסטרטגיית הבחירה מתבססת על השימוש בעיצוב התחל בקפידה בפרוטוקול ESC לאחר הגברה בפרוטוקול שעתוק/תרגום/בחירה (איור 1א). ספריית ESC מתבטאת בתרגום שעתוק מחוץ למים ב-תחליב שמנים,^9,10,11. בתוך כל droplet, הספציפיות של האנזים המבוטא משפיעה על מצב ה-ESC (איור 1ב, שלב I). עבור ההסדר המתואר, פעילות המחשוף הרצוי של החלבון המתורגם מסיר את תג ביוטין של ה-DNA, אך אינו משפיע על הקצה השני של ESC עם המונה ברצף שנבחר. כאשר אמולסיה שבורה, שברים biotinylated מוסרים על ידי streptavidin זיקה היורד, כך רק שברי מתוך טיפות עם הפעילות הרצויה להישאר (איור 1B, צעד שני). שלב זה מסיר משתני ושהה לא פעילים. חלק הסופרפוזיציה של השלב המתעלה מוגבר על ידי ה-PCR. ב-PCR הראשון תגובת התחל F2 ו R1 משמשים (איור 1A, B, שלב III). פריימר F2 מאגד את המקטע ESC בין מונה שנבחר לבין סוף המולקולה. לכן, ESCs מביע משתנים המסוגלים לעזוב את הדלפק ברצף שנבחר (ולכן, להפריד את אתרי הכריכה עבור התחל F2 ו R1 לשתי מולקולות DNA שונות) אינם מוגבר ומוסרים כך מהספריה. R1 פריימר נקשר בין האתר שנבחר לבין הליבה של ESC כך שהוא לא מושפע ממצב המחשוף של האתר הנבחר ומשחזר את אתר המחשוף עבור הפעילות הרצויה (GGATCC). המחזור סגור על ידי ה-PCR השני (עם התחל F1 ו-R2) המוסיפה ביוטין בקצה 5 הקרוב לאתר שנבחר ומשחזרת וריאציה מעוצבת באתר שנבחר הדלפק קרוב לקצה הנגדי של ESC (איור 1ב, שלב IV). תערובת ה-DNA שתיווצר מוכנה לסיבוב נוסף של בחירה.

הצלחת פרוטוקול הבחירה תלויה מאוד בבחירה הנכונה של רצף זיהוי המטרה החדש והקפדני ביותר ובתכנון קפדני של אסטרטגיית המוטגנזה ויישומו האפקטיבי. מכיוון שזה הרבה יותר קל לשפר את ההעדפות הקיימת מראש ושהה מאשר להתגבר עליהם, אנו ממליצים להתחיל עם מחקר קינטי של כל ההעדפות הקיימים. הצורך בעיצוב מוטארסיס קפדני נובע מהגודל המוגבל של ספריית מוטציות שניתן לעבד על-ידי הפרוטוקול המוצג (10⁹ שיבוטים בניסוי אחד). משום כך ניתן לבדוק ביעילות את כל 20 ההחלפות של חומצת אמינו בכמה תנוחות (ראה דיון). מוטגנזה אקראית, כגון ה-PCR הנוטה לשגיאות (EP-PCR) המוצג כשיטה חלופית, יוביל לחשיפה מעמיקה של המורכבות הקיימת. אם מידע כלשהו על משרות חומצות אמינו פוטנציאליות המעורבים במגעים עם ה-DNA (או אפילו ממוקם בסמיכות לנוקלאוטידים מנוונת ברצף קנצוני) זמין, זה בהחלט צריך לשמש כדי לבחור כמה חומצות אמינו עבור oligen, הגאות מונחה מוטאוזיס רוויה (שלבים 1.6-3.10).

פרוטוקול

1. הכנת ESCs

1. שיבוט מתילאז של מערכת שינוי ההגבלה להיות מהונדס מספר עותק נמוך פלמיד (למשל, pACYC184 או pACYC174 או נגזרות שלהם).
   הערה: זן מארח חיידקי חייב להיות מסוגל לסבול מתילציה הציג על ידי האנזים משוכפל ולספק inducible ביטוי של T7 RNA פולימראז. מומלץ להשתמש בER2566 המאמץ (הנושא בממסים, McrBC ומוטציות Mrr).
2. לאשר את ה-DNA רקומביננטי באמצע מוגן מפני המחשוף על ידי endgnate החוזה על ידי טיפול 0.5 μg של ה-DNA באמצע עם 10 יחידות קנצוני ושהה במאגר ובטמפרטורה מומלץ על ידי ספק האנזים עבור 2 h.
3. להכין תאים מוכשרים של זן זה.
   הערה: ניתן להשתמש בכל שיטה. פרויקט ההנדסה NlaIV השתמש בשיטת סידן כלוריד פשוטה¹².
4. בניית רקומביננטי פלמיד עם ORF עבור ושהה תחת שליטה של היזם T7 מקבוצת הדרה שונה עם סמן בחירה שונה מאשר אחד המכיל את הגן מתילsferase בשלב 1.1. וקטורים pET28 ו-pET30 ניתן להשתמש.
5. הסר את כל אתרי הזיהוי עבור האנזים הנדסה מתוך הקטע של הרקומביננטי פלבין T7 היזם ולהפסיק קודון של האנזים orf על ידי החדרת מוטציות שתיקה (איור 2, טבלה 1a).
   הערה: אם יש להסיר יותר מאתר אחד כזה, מספר סיבובים של מוטציות יהיו נחוצים (שלבים 1.5.1 – 1.5.7).
   1. השתמש בתגובת PCR מבפנים המגבירה את הפלביניים באורך מלא עם וריאציות מעוצבות שהוצגו בקצה 5 של התחל (שולחן 2A).
   2. הסר את ה-DNA של התבנית על-ידי הוספת 10 U של DpnI endonחכירה ל-50 μL של תגובת ה-PCR, ו-הדגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
   3. לפתור את המוצרים על ידי אגנה ג'ל אלקטרופורזה. חותכים את הלהקה המתאימה לפלבאמצע באורך מלא ומטהר אותה בערכה מסחרית.
   4. הוסף מאגר הקשר של 10x (לריכוז של 1 x) והוסף עם ATP (עד 1 מ"מ). הוסף 10 U של T4 polynucleotide קינאז ו הדגירה עבור 20 דקות ב 37 ° c. הפוך את האנזים על ידי חימום ב 70 ° c עבור 10 דקות.
   5. הוסף פג 4000 כדי 5%, תוספת שוב עם ATP (כדי 1 מ"מ), ולהוסיף 5 U של T4 ligase DNA. דגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר (RT).
   6. להפוך זן חיידקי מוסמך נושאת קנצוני מתילאז (שלב 1.1).
   7. בודד את ה-DNA הפלמיד בקנה מידה קטן ולאשר את המבוא של שינויי רצף על ידי רצפי dideoxy.
6. הצגת אתרי הגבלה ייחודיים בקרבת הרצף (ים) המיועדים להגבלת מוטאוזיס (איור 2, טבלה 1b). בצע את השלבים 1.5.1 – 1.5.7 עבור כל אתר.
   הערה: שלב זה מבוצע רק כאשר נעשה שימוש במוטגנזה ממוקדת. אם ביצוע מוטזיס אקראי, דלג על שלבים 2-3 והמשך לסעיף 3 במקום. בדוגמה המוצגת, כל האתרים הוכנסו במעלה הזרם של האזורים המיועדים, אך ניתן להציג אותם גם במורד הזרם.
7. עיצוב התחל עבור הגברה של ESC (שולחן 1C).
   1. לעצב כריכה לאחור הכריכה של orf endonuclease, אשר יציג את אתר הזיהוי הנבחר (R1) ואת הגירסה הקצרה שלה (R2) הנקשר מחוץ לרצף nlaiv שנבחרו ומכיל ביוטין בסוף 5 ' (ראה איור 1).
   2. עצב כריכת תחל (F1) לתוך ESC במעלה הזרם של מקדם T7. פריימר זה צריך גם להציג משתנים שנבחרו נגד (s) של רצף הזיהוי המקורי (כלומר, את המקסימום של וריאציות רצף מזוהה על ידי האנזים המקורי למעט רצף הפוכה שנבחרו).
      הערה: גרסה קצרה יותר של פריימר זה (F2) כי מכסה את הרצף של הרצף הבחירה הנבחרת יהיה להשתמש מאוחר יותר ב-PCR סלקטיבי (שלב 5.9).

2. הסינתזה המפוצלת והמיקס של הכוונת התחל

הערה: שלב זה משמש רק עבור פרוייקטים המחייבים מוטארזיס תת-רוויה ביותר מאתר אחד. דרוש סינתיסייזר עם מספר עמודות סינתזה. הקצאת עמודות עבור סינתזה של nns אקראי שלישיות ו סוג פראי קודון שלישיות על פי תדרי מוטגנזה. לדוגמה, אם מדובר בשבעה עמודות שוות לסינתזה של אמצעי אחסון, וקצב מוטארסיס של 0.3 רצוי באתר נתון, הוסף מרכיבי NNS אקראיים בתוך ~ 0.3 x 7 או 2 עמודות, ומסוג פראי של מרכיבי הכתב ב ~ 0.7 x 7 או 5 עמודות (איור 3).

1. החלט אודות אתרים עבור מוטארסיס לרוויית משנה. בחר בתדרי מוטזיס בהתאם לחשיבות ההיפוזתית של האתרים (דהיינו, ככל שהאתר חשוב יותר, כך התדירות גבוהה יותר), שמירה על מגבלות על המורכבות הכוללת של הספרייה (ראה דיון).
2. סינתזה של מחלת היתר בכל העמודות, עד לתחילת הטריזתן מייד לפני האתר השני של מוטאוזיס שונה בספירה של 3-end. אין להסיר את ההגנה של 5 '-טריטיל במחזור הסינתזה האחרון (השתמש באפשרות trityl על הסינתיסייזר). קבוצת ההגנה תוסר בתחילת מחזור הסינתזה הבא (שלב 1 באיור 3).
3. פתח את עמודות הסינתזה. לאסוף זכוכית נקבובית מבוקרת (ה-CPG) תמיכה סינתזה לתוך צינור יבש 1.5 mL ומערבבים על ידי vortexing. למחיצות מחדש את שרף ה-CPG המעורב לתוך עמודי סינתזה חדשים. הימנע להציג לחות, כי היא תפחית את התשואה הכוללת (שלבים 2 ו-4 באיור 3).
4. המשך בסינתזה, החל מהמוטאוזיס שלישיה באתר. הקצאת עמודות שלישיות NNS אקראי או שלישיות סוג פראי בהתאם לתדר מוטארסיס הרצוי (ראה הערה לעיל). אם קיימים אתרי רוויית משנה נוספים, המשך רק לנקודת הכשל לפני האתר השני של מוטבי הרוויה הבאה. שוב, להשאיר קבוצה של 5 '-טריטיל על בסוף (5 '-טריטיל על הסינתיסייזר) (שלב 3 באיור 3). לאחר מכן המשך בשלב 2.3.
5. אם אין יותר אתרי הרוויה מופיע במורד הזרם, להשלים את הסינתזה, להשאיר קבוצה 5 '-trityl בסוף (5 '-הטריטיל-על הסינתיסייזר) (שלב 5 באיור 3).
6. הגנה על הספריה וטיהור הספרייה על פי הוראות יצרן מחסנית הטיהור.
   הערה: מחלת הלחות של ה-CPG ניתן גם לטהר את השלב ההפוך ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (בדיקות) עם טריטיל-מופעל ואחריו הסרת קבוצת טריטיל ידני (1 h טיפול עם 80% חומצת חומץ ב-RT) וטיהור שנייה.
7. בדוק את איכות הספרייה הנוספליונואומית בג עמוד שתנן.

3. יצירת ספריות משתנה

הערה: השתמש ברקומביננטי פלמיד משלב 1.6.

1. צור את הספריות על-ידי הפעלת מוטאוזיס מכוון.
   הערה: לחלופין, השתמש בפרוטוקול EP-PCR (שלב 3.2).
   1. הגבר קטע מיזם T7 לאתר האנזים ההגבלה הייחודי החוצה את הרצף המיועד עם מוטגנזה (במקרה של NlaIV: סאלי, EcoRI, או Eco52I) (שולחן 1b-C, שולחן 2b, איור 4). הקצה את החלק השני מאתר האנזים ההגבלה הייחודי לסוף ה-3 של ESC.
   2. מערבבים בנפרד 5 μL של תגובות ה-PCR (משלב 3.1.1) עם 8 μL של מים, 1.5 μL של מאגר אנזים הגבלה של 10x, ו-5 יחידות של אנזימי הגבלה מתאימים (סאלי, EcoRI, או Eco52I) ו-דגירה בטמפרטורה המתאימה עבור 2 h.
   3. לפתור את המוצרים של שתי התגובות באמצעות האלקטרופורזה ג'ל אגנה. חותכים את הרצועות בגודל המצופה ומטהרו את הערכה המסחרית.
   4. לרוץ עד 1/3 של מוצרים מטוהרים בג agarose ולמדוד את הריכוז של כל להקה מטוהרים על ידי densi, try.
   5. להגדיר את הקשר של שני חלקים של escs ביחס טוחנת 1:1 עם מאגר ליגאז 1x ו-1 U של T4 ליגאז ה-DNA ו-דגירה עבור 2 h ב RT.
   6. לפתור את מוצרי התגובה של ג'ל agarose. גזור את המוצרים בגודל הצפוי ולטהר עם ערכה מסחרית.
   7. מגבירים את המוצרים המטוהרים בתגובת PCR עם התחל F1 ו-R2 (שולחן 1C ושולחן 2a). אין להפעיל יותר מ-20 מחזורי הגברה.
   8. אנגיופלסטיקה את התגובות ה-PCR בג'ל שנוצר. גזור את המוצרים ולטהר עם ערכת מסחרית.
   9. הפעל 5 μl סדרת מחלקים של הספרייה מטוהרים מהשלב הקודם של agarose ג'ל ולמדוד את הריכוז על ידי densi, try.
   10. שיבוט מדגם קטן של הספרייה (עד 5 μL) ורצף > 15 שיבוטים כדי לבדוק את תדר מוטציה והפצה (שולחן 3). . המשך לשלב 4
       הערה: לחילופין, ניתן להשתמש ברצף התפוקה הגבוהה של המדגם הקטן של ה-ESCs.
2. בצע EP-PCR.
   1. להגביר את ESC מתוך הפלס1 שהתקבל בשלב 1.5.7 עם התחל F1 ו R1. הפעל 20 מחזורים עם Taq I פולימראז (שולחן 1B).
   2. ג'ל מטהר את מוצר ה-PCR.
   3. הגדר את EP-PCR עם 2 מוצרים של מוצר PCR מטוהר מהשלב הקודם והפעל 15 מחזורים של EP-PCR (טבלה 1C) עם התחל F1 ו R1.
   4. ג'ל לטהר את המוצר ולכמת אותו על ידי ג'ל densi, try.
      הערה: בשל ריכוז נמוך של השימוש מוצר EP-PCR מטוהרים על 1/3 לכמת.
   5. שיבוט מדגם קטן של הספרייה (עד 1/5) ורצף > 15 שיבוטים כדי לבדוק את תדר המוטציה והפצה (שולחן 4).
      הערה: לחילופין, בצע רצף תפוקה גבוהה של המדגם הקטן של ESCs.

4. ביצוע מידור בתמלול חוץ גופית-תגובת תרגום

1. בדיקת הביטוי endonuclease ופעילות אנזימטית ב תמלול, תרגום.
   1. להכין המצע קצר (200-500 bp) עם אתר זיהוי יחיד עבור endonuclease הממוקם קרוב למרכז המולקולה כך תגובת המחשוף ניתן לזהות בקלות.
      הערה: הדרך הקלה ביותר להכין את המצע היא על ידי PCR הגברה של שבר מתאים של כל מולקולה DNA. המצע יכול להיות רדיויניום או מסומן בצורה מסודרת כדי לפשט את זיהוי המחשוף.
   2. הגדר את 50 μL של תגובת תמלול-תרגום עם 0.5 μg של בחור סוג של ESC בהתאם להמלצות של היצרן. להוסיף מלח מגנזיום (MgCl₂, mgcl₄, ואצטט מגנזיום ניתן לבדוק) כדי 1.5 mM ואת הכמות המתאימה של מצע מהשלב הקודם (לפחות 0.5 ΜG במקרה של DNA ללא תווית).
      הערה: כל שעתוק/ערכת תרגום שאינו מכיל נוקלאז המופעל על ידי מגנזיום ניתן להשתמש. חלק מספקי הקיט משתמשים בנוקלאוסים כדי להסיר את זיהום ה-DNA במהלך ההפקה ולאחר מכן להוסיף כבדים כמעכבי נוקלאז. ערכות כאלה אינן תואמות לשיטה זו.
   3. מודמת את תגובת התרגום לפי הוראות היצרן. ואז להעביר את תערובת התגובה לטמפרטורה אופטימלית עבור אנזים ההגבלה עבור 2 h.
   4. לנתח את המחשוף של המצע ב-agarose ג'ל ואחריו זיהוי מתאים (למשל, כתמים DNA, הדמיית זריחה, או אדיגרפיה אוטומטית) (איור 5).
      הערה: לפחות מחשוף חלקי של המצע הכרחי לפני שתמשיך עם מידור. אם זה לא מושגת, אופטימיזציה נוספת של הצורה הכימית מגנזיום או הריכוז שלה הוא הכרחי.
2. להכין תערובת שמן surfactant על ידי הוספת 225 μL של Span 80 ו 25 μL של רצף ה80 כדי 5 מ ל של שמן מינרלי ב 15 מ"ל צינור חרוט. מערבבים ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור 15x.
3. עבור כל העברת ספריה 950 μL של תערובת שמן surfactant ל 2 mL עגול התחתון בקבוקון הקריוגני, תווית עם שם ספרייה, ולהעביר לקרח. שים אחד קטן לערבב גליל פס (5 x 2 מ"מ²) לתוך כל בקבוקון.
4. להכין שעתוק מחוץ למבחנה-תגובת התרגום תערובת (50 μL עבור כל ספריה) על פי הצעות היצרן. מוסף את התערובת עם מגנזיום כלוריד לריכוז הסופי של 1.5 מ"מ (ראה שלב 4.1.4).
5. מדבקות 50 μL למטה לתוך 1.5 מנורות mL על הקרח.
6. הוסף 1.7 fmole של הספרייה (מסעיף 3) לתערובת התגובה על קרח.
   הערה: אין להשתמש בכמות גדולה יותר של ספריית ביטויים ליעילות בחירה. חשוב למזער את התדירות של טיפות מימית המכילות יותר ממולקולה DNA אחת.
7. הכינו תחליב מים בשמן ברציפות לכל ספריה.
   1. שים בגביע קטן (או גביע גדול בקבוק) מלא קרח על מערבב מגנטי עם מהירות ערבוב להגדיר ב 1,150 rpm.
   2. העבר בקבוקון קריוגני עם 950 μL של תערובת שמן surfactant, בר ערבוב קטן משלב 4.3 לגביע קר קרח על מערבב מגנטי. בדוק כי בר ערבוב מסתובב.
   3. הוסף 5 10 μL ali, s של ספריית מבחנה-שעתוק-תרגום תערובת על ידי תקופה של 2 דקות במרווחי זמן של 30 ולהמשיך ערבוב לדקה נוספת. העבר את המבחנה עם אמולסיה למיכל קרח. המשך בספריה הבאה המתחילה בשלב 4.7.2.
   4. לאחר שכל הספריות מעובדות, התחל את הדגירה של כל הספריות בהתאם להמלצות של יצרן הערכה.
8. העבר את הבקבוקונים לטמפרטורה אופטימלית עבור endonuclease הנדסה עבור 2 h נוספים ולאחר מכן לשים אותם על הקרח לפחות 10 דקות.

5. המשך עיבוד הספריות והבחירה

1. העבר את האמולסיות מצלוחיות הקריוגניים לצינורות הקרים 1.5 mL, להוסיף 1 μL של 0.5 M EDTA ו צנטריפוגה אותם ב 13,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. להסיר את שלב הנפט העליון עם פיפטה. אם השלב הפנימי של מי הנפט אינו גלוי, הרכבת התחתית עבור לפחות 5 דקות ב-20 ° c כדי להקפיא את השלב מימית, ואז מיד ללטף את שלב הנפט הנוזלי.
3. הוסף 100 μL של 10 mM הHCl Tris pH 8.0 ומיד לבצע החילוץ עם 150 μL של פנול: כלורופורם (1:1 v/v) על ידי vortexing קצר ואחריו הפרדת הפאזה על ידי 30 s צנטריפוגה ב 13,000 x g. לאסוף את השלב העליון מימית.
4. מזרז את ה-DNA על ידי הוספת 0.1 vol (15 μL) של 3 M אצטט נתרן (pH = 5.2), 2.5 – 5 μg של גליקוגן ו 2.5 vol (375 μL) של אתנול. דגירה ב-20 ° c עבור 1 h ו צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 13,000 x g, 4 ° c. להיפטר supernatant ולשטוף בקצרה את הגלולה עם 1 מ ל של הצטננות 70% אתנול.
5. יבש את ה-DNA/כפות הגליקוגן ב speedvac או באוויר יבש עבור > 5 דקות.
6. לפזר את הגלולה ב 50 μL של 10 מ"מ טריס-HCl (pH = 7.5). הוסף 5 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin שהוכנו על פי הוראות היצרן ולערבב עבור 1 h ב RT, רצוי במיקסר קרוסלה או על ידי וורטקנג עדין.
7. הפרידו את החרוזים על דוכן מגנטי ואספו את הנוזל המועשר ב-DNA ללא biotin.
8. רכז את הדנ א על ידי משקעים אתנול (שלבים 5.4 – 5.5).
9. לפזר את ה-DNA מרוכז מהשלב הקודם ב 5 μL של מים ולהשתמש כתבנית ב-PCR התגובה עם F2 ו R1 התחל (שולחן 1A).
   הערה: כדי למנוע בעיות עם זיהום התבנית ולמזער את הממצאים החזותיים להשתמש Taq פולימראז (לא Pfu או Phusion) ולהפעיל 18 – 20 מחזורים עם זמן הארכה פרופורציונלי לגודל התבנית (1 kb = 1 דקות) (ראה טבלה 2B).
10. האנגיופלסטיקה את מוצר ה-PCR בג והוציא את מוצר הגודל הצפוי. חלק מהפסולת מצביעה על כך שישנם מוצרים בגדלים שונים (ראו איור 6). לטהר את ה-DNA מלוח הג עם ערכת מסחרית.
11. הפעל תגובת PCR שנייה עם עד 50 ng של ה-DNA משלב 5.10 התחל F1 ו-R2 באמצעות אותו פרוטוקול כמו בשלב 5.9. המשך עם טיהור המוצר כפי שמתואר ב-5.10. דנ א מטוהרים לאחר כימות על ידי agsi, ג'ל הדנטונסה (לא ספקטרוסקופיית UV) ניתן להשתמש בסיבוב הבא של בחירת מבחנה (שלב 4.6).

6. משתני מסך עבור שינויים ברצף ספציפיות

1. שיבוט משתנים שנבחרו.
   1. לעכל את המוצר משלב 5.10 עבור 2 h עם 10 U של אנזימים הגבלה מתאים שיבוט של ORF לתוך וקטור הביטוי (עבור NlaIV: Nlaiv ו XhoI) בטמפרטורה ומאגר מומלץ על ידי ספק האנזים. לפתור את המוצרים עם אלקטרופורזה ג'ל agarose ולבודד את מקטע הגודל הצפוי.
   2. הכינו את וקטור הפלמיד (למשל, pET28) על ידי מחשוף כפול עם אנזימים זהים כמו בשלב 6.1.1 ו ג'ל לטהר את המוצר עם ערכת הטיהור ג'ל מסחרי של ה-DNA.
   3. להעריך את ריכוזי וקטור ולהוסיף על ידי densi, try עם agarose ג'ל אלקטרופורזה.
   4. הגדרת הקשר עם 1 – 5 של T4 לליגאז DNA ו וקטור: להוסיף יחס טוחנת 1:3 – 1:5 במאגר 1x ליגאז מומלץ על ידי ספק האנזים. דגירה עבור 2 h ב RT ולהציג לתוך חיידקים מארחים המתאים (משלב 1.3) על ידי שינוי או אלקטרופורציה¹².
   5. בחר extransformants על לוחות LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (50 μg/mL של kanamycin עבור pET28 או pET30 וקטורים) ו 1% גלוקוז.
2. . משתני חלבון מהירים
   1. אינומאז מושבות יחיד מן השינוי (עד 24 שיבוטים ניתן לעבד בקלות בריצה אחת) לתוך 2 מ ל ליברות עם kanamycin (50 μg/mL) ו 1% גלוקוז ולצמוח לילה ב 37 ° צ' עם רעד.
   2. האיחסן 15 מ ל חם (37 ° c) ליברות המכילה 100 μg kanamycin ולא גלוקוז עם 0.75 mL של התרבות לילה ו הדגירה ב 37 ° צ' עם טלטול נמרץ.
      הערה: או 50 mL שפופרות צנטריפוגה או 100 mL מבחנות Erlenmayer ניתן להשתמש.
   3. הוסף 176 μL של גליצרול עד 1 מ ל של תרבות לילה (ריכוז סופי של גליצרול = 15%) לערבב היטב ולהקפיא ב-70 ° c.
   4. לאחר 2 – 3 h תוספת של 15 מ ל של התרבות (משלב 6.2.1) עם IPTG ל 1 מ"מ ותרבות עבור תוספת של 5 h.
   5. לאסוף את הגלולה חיידקים על ידי צנטריפוגה (10,000 x g, 4 ° צ', 10 דקות) ו להקפיא ב-70 ° c.
3. . טהר את משתני החלבון
   1. העברה 20 μL של ניקל מתלה שרף הבולם לתוך 200 μL של מאגר B1 בצינור 1.5 mL עם טיפ רחב מנשא פיפטה, לערבב בעדינות, צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c). הסר את הסופרנטנט על ידי מלטף והשאר את השפופרת על הקרח.
   2. השהה מחדש את הגלולה החיידקית משלב 6.2.5 ב-300 μL של B1 על-ידי vortexing נמרץ. להעביר את ההשעיה לתוך צינור 1.5 mL.
   3. הוסף 3 μl של קוקטייל מעכב פרוטאז 100x ופתרון ליזוזום ב B1 (הריכוז הסופי של 1 מ"ג/mL). לפירוק התאים על ידי sonication עם הלווין מצויד המכשיר. השימוש 6 10 s צרורות לכל מדגם עם > 15 s זמן קירור בקרח בין. . לשמור על השעיות בקרח כל הזמן
   4. גלולה פסולת תא על ידי צנטריפוגה (2 דקות, 12,000 x g, 4 ° c) ו העברה 250 μl של סופרנטאנט שרף משלב 6.3.1.
   5. מערבבים עבור 15 דקות בחדר קר, רצוי במיקסר קרוסלה או על ידי הורטקנג עדין.
   6. צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c) ומכה את הסופרנטאנט עם פיפטה.
   7. הוסף 500 μL של מאגר W והשהה מחדש בעדינות את השרף. צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c) ומכה את הסופרנטאנט עם פיפטה.
   8. חזור על שלב ה6.3.7.
   9. הוסף 20 μL של מאגר E, השהה מחדש בעדינות את השרף, והשאר את המדגם על קרח עבור 2 – 5 דקות. צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c). ותאסוף את הסופרנטאנט
   10. חזור על שלב ה6.3.9. . בריכת-על
   11. ניתוח דגימות חלבונים ב-SDS-עמוד (5 – 10 μL) (איור 7).
4. מסך עבור משתנים עם ספציפיות משתנה.
   1. שיטת מחשוף פעילות על בקטייאג DNA למדא. דגימת החלבון יכולה להוות עד 10% מנפח התגובה הסופי. סך של 2 μL של דגימת חלבון לכל 0.5 μg של ה-DNA ו 2 זמן התגובה היא נקודת התחלה טובה.
   2. לנתח את מוצרי התגובה על ידי אגקם אלקטרופורזה ג'ל יחד עם המוצרים שנוצרו על ידי האנזים סוג פראי. בחר את המשובטים היוצרות דפוסי המחשוף להבדיל בבירור מן האחד שנוצר על ידי אנזים סוג פראי לניתוח נוסף (איור 8).

תוצאות

פרוטוקול זה הוא רק כלי כדי להגדיל את התדירות של הגרסאות הרצויות של ושהה הנדסה על ידי מכלה (אך לא חיסול) שתי מחלקות לא רצויות: אנזימים לא פעילים והטיות בלתי משתנה עם סוג פראי הרצף ספציפיות. מצד שני, כי שינוי ספציפיות ושהה הוא מאוד קשה, מציאת אפילו אחד כזה גרסה להפקת דפוס המחשוף כי הוא שונה מן האנזים סוג פראי בהקרנה אחת של 24 שיבוטים צריך להיחשב הצלחה. בידינו המסכים הטובים ביותר יכולים לזהות עד 20% מווריאנטים המבטיחים (איור 8א).

התוצאה החיובית תלויה באיכות הספרייה (כלומר, תדירות מוגבלת של החלפות וההפצה האקראית שלהם) ולכידה יעילה של האוכלוסייה הביוטימית של חברי הספרייה (שלבים 3.6 – 3.7). ניתן לזהות את שתי הבעיות. איכות הספרייה יש לבדוק לפני הבחירה על ידי רצף כמו שיבוטים רבים ככל האפשר (> 15) או על ידי רצף ישיר של הספרייה על ידי רצף תפוקה גבוהה (שלב 3.10, שולחן 3). אם רוב המשובטים שנבחרו אינם פעילים, זהו אינדיקציה ברורה של כישלון של בחירת לכידת streptavidin. השפעה דומה נצפתה במקרה של ספריות העוברות מחזורי בחירה רבים, כיוון שספריות כאלה שלטו כנראה במשתנים לא פעילים שנמלטו משלב הבחירה הstreptavidin (איור 8ב). לכן, מומלץ להריץ הקרנה אחרי כל מחזור בחירה ולפתח משתנים מבטיחים שנבחרו ידנית ולא להסתמך על איטרציה בחירה.

איור 1: בחירה בתחום החוץ של הרצף החדש המבוסס על הנדסת NlaIV. (א) הארגון של הביטוי/קלטת הבחירה (ESC) כולל שני אתרי זיהוי עבור ושהה, 1) הרצף הנבחר (GGATCC) קרוב לקצה הימני ו-2) המונה הנבחר (GGSSCC) קרוב לקצה השמאלי, כמו גם את T7p ו T7t-T7 יזם ו T7 שליחות קטלנית. אתרי הכריכה הפריימר מוצגים להלן. פצילות מסוג פראי ומשתני NlaIV נבחרים מוצגים כמשולשים אדומים וירוקים בהתאמה. (ב) צעדי מחזור בחירה: I) אמולסיה של שעתוק-תרגום-מחשוף מתערבב עם ספריית ESC; II) כל ה-DNA biotinylated נלכד על חלקיקים מגנטיים מצופה streptavidin והוסרו, ובכך הסרת קידוד לא פעיל משתנים; III) הקידוד הקצאה מראש עם פעילות מסוג פראי (כלומר, אלה המסוגלים לקליב רצף GGSSCC) מסולקים משום שהמחשוף של הרצף מפריד בין אתרי הכריכה לבין התחל הקדמי והפוך. לכן, אין הגברה של ESCs אלה מתרחשת; IV) הכניסה לסיבוב הבחירה הבא נוצרת על-ידי הוספת ביוטין בקצה הימני ומציגה מחדש את הווריאציה של רצפי המונה שנבחרו בקצה השמאלי. הודפס מתוך Czapinska ואח '⁸ עם אישור משאר וייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הכנת ESC. קטע שנגזר מהבנייה המקורית בווקטור ביטוי המכיל את NlaIV ORF תחת שליטה במקדם T7 השתנה כדי להתאים לביטוי/בחירה. האתר NlaIV במורד מתוך NlaIV ORF הוסר ואתרים ייחודיים (סאלי, EcoRI ו Eco52I) ששימשו מוטציות מיקומים נבחרים הוצגו NlaIV ORF כמוטציות שקט. המבנה הסופי היה מוגבר עם היסוד האגפים שהציג שני אתרי NlaIV מאגפים: המונה הרצף שנבחר (GGSSCc) בצד שמאל וברצף שנבחר (Ggב-cc) בצד ימין. ההילוך ההפוך הציג גם biotin. צבעי היסוד המשמשים ליצירת ECS מוטציה מוצגים כחיצים כחולים ומסומנים להלן (ראו טבלה 1B, C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ערכת הסינתזה של פיצול וערבוב. הדוגמה מתייחסת ל-MutB פריימר סינתזה שבו רצף NNS הוצג בתדר 0.8 בארבע עמדות (ראה גם שולחן 3). שימו לב כי סינתזה כימית מבוצעת מ 3 ' כדי 5 ' אבל כל הרצפים מוצגים הקאנוני 5 ' -3 ' כיוון (כלומר, הוא ממשיך מימין לשמאל בערכה זו). רצפי סוג פראי בתנוחות מוטנטים מוצגים בירוק בעוד רצפי מוטנטים NNS הם באדום. אתר הזיהוי של סאלי, המשמש מאוחר יותר להחדיר מוטציות ב-ESCs, מסומן בקו תחתון. נקודות ערבוב ושלבים מתפצלים (2 ו-4) מצוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שימוש באתרי אנזים של הגבלה ייחודית בשימוש באתרים המיועדים להגבלת הזרם. האסטרטגיה של הקדמה מוטציה מוצגת בדוגמה של בניית ספריות A-C (ראה שלבים 3.1 – 3.7). הודפס מתוך Czapinska ואח '⁸ עם אישור משאר וייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מחשוף מפני חרדה באמצעות שעתוק מחוץ למבחנה-תרגום. (א) פצילות של מצע מבחן במאגר ושהה אופטימלי: 1) מצע, 612 bp PCR המוצר עם אתר NlaIV זיהוי יחיד; 2) מוצרי הפצילות, 355 bp ו 257 bp. (ב) הפצילות ב תמלול שעתוק-תרגום התגובה (המכיל 0.5 μg של ESC): 1 – 2) 15 μl התגובה של תרגום מחוץ לתחום של תמלול ללא מצע (קו 2: תגובת בתוספת עם 1.5 MM MgCl₂); 3 – 4) 15 μL של שעתוק מחוץ למבחנה-תרגום עם 1 μg של מצע הבדיקה; (קו 4: התגובה שיושלם עם 1.5 mM MgCl₂). S-DNA סמן גודל (pBR322 מתעכל עם MspI). הדגימות נפתרו ב-6% מקורי הדף. הדנ א היה מוכתם. באתידיום ברומיד אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: המוצרים של ה-PCR הראשון במחזור הבחירה. ראה איור 1B, שלב III; שלב 5.10 הפרוטוקול. מערכות העמודות 1 ו-2 הן שגרות של שתי ספריות שונות הטעונות בטרילקאט. S-DNA גודל סטנדרטי (למדא DNA מתעכל עם HindIII ו EcoRI). חץ מציין את מיקומו של ESC באורך מלא (1,050 bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: משתני NlaIV מטוהרים להקרנה נוספת בקנה מידה מיני. ראה שלב 6.3.11. כל שורה מכילה 10 מיקרומטר μL של משתנה אחר. משקל מולקולרי S-חלבון. מסה מולקולרית של ושהה יחידת המשנה NaIV הוא 29.9 kDa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: דוגמאות להקרנה של משתני NlaIV עבור שינוי ספציפיות של רצף. ראה שלב 6.4.2. (א) הקרנה מוצלחת עם תדירות גבוהה של גרסאות מבטיחות. S = דנ א בגודל סמן, DNA למדא ביקבד עם HindIII ו EcoRI; פראי סוג (wt) = למדא DNA ביקבד עם סוג פראי NlaIV; λ = למדא DNA מצע, לא ביקע; עמודות אחרות = משתנים בעלי פעילות נמוכה מאוד. משתנים מתויגים! = גרסאות מבטיחות המייצרים דפוס מחשוף נבדל מן האנזים סוג פראי;? = משתנים שייתכן גם ששינו את העדפת הרצף. (ב) הקרנה לא מוצלחת, עם רוב המשתנים לא פעילים וגרסה אחת עם דפוס מחשוף לכאורה ללא שינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: בחירה חלופית באמצעות הארכה. ניתן להשתמש בחלופה זו עבור כל הקצאות משוב היוצרות קצוות דביקים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לדוגמה עבור ערכת בחירה עבור האנזים MwoI (לא פורסם). I) רצף נבחר (הממוקם בקצה הימני של ESC) עם שאריות מוגדרים המופיעים בווריאציה האדומה והנבחרת של רצף הקנצוני המוצג בכחול. בסוגריים מתחת לרצף הנבחר של המונה להיות ממוקם בקצה השמאלי של ESC מוצג; II) מוצר של מחשוף MwoI; III) לאחר סיום הביצוע בתמלול/תרגום מחוץ לרשת, המוצרים מטוהרים ומתבצעים באמצעות מתאם עודף. רק מוצרי המחשוף שהיו ביקכו ברצף הנבחר יכולים להשתתף בהארכה. לכן, משתנים לא פעילים מסולקים, והצעד הנפתח אינו נחוץ. מוצר המחשוף ברצף הנבחר של המונה (בקצה השמאלי של ESC, לא מוצג) אינו יכול להשתתף בפעולה זו מאחר שהקצה הבולט של המתאם אינו משלים את הרצף הנבחר של המונה; IV) ה-PCR הסלקטיבי משתמש באותה אסטרטגיה כמו בפרוטוקול העיקרי כדי למנוע משתנים בעלי סוג פראי של רצף מנוון (מחייב F1 הכריכה מעבר לאתר שנבחר) ואילו משתנים בלתי פעילים מסולקים על ידי פריימר הפוכה סלקטיבית שאינה יכולה לאגד את הבלתי ניתן לביטול (ולכן לא שונה על ידי מתאם במחזור הבא ניתן לחזור על-ידי שימוש במתאם הזהה למוצר המחשוף של השלב הקודם (כלומר, "קלטת הברתה" בלוח III), והיפוך בררני סלקטיבי מתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שולחן 1: תחל בשימוש בהנדסה NlaIV. רצפים של אתרי ההגבלה שהוזכרו בהערות מסומנים בקו תחתון. אותיות קטנות מציינות רצפים שאין להם משלים בתבניות ה-DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

טבלה 2: תנאים של תגובות ה-PCR לשימוש בפרוטוקול. T_m = פריימר טמפרטורת ההיתוך (אם T_m שונה עבור התחל, את T_m התחתון צריך לשמש). אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

שולחן 3: תוצאות בדיקת איכות של שני מוטניים התחל מסונתז עם אסטרטגיה מפוצל ומיקס. בעלי מוטניים מסומנים באמצעות [XXX]. מספר אינדקס נמוך יותר מציין את מיקומו של חומצת אמינו מקודדת. הותאם מ-Czapinska ואח '⁸ באישור מאחר וייה. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

שולחן 4: תוצאות EP-PCR. הפרמטרים העיקריים נגזר ניתוח רצף של 22 שיבוטים של ECS. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

דיון

פרוטוקול הבחירה המתואר כאן נבדק עבור NlaIV⁸, a dimeric-(D/E) רצף זיהוי קיפול xk המכיר אתר היעד palindromic עם בסיסי nn מרכזי ומזרז לחתוך קצה קהה בין בסיסי nn. NlaIV נבחר כי המחשוף בין בסיסי NN מציע כי בסיסים אלה קרובים לחלבון במתחם. בעיקרון, הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל מגבלה מסוימת ההגבלה endonuclease, monomeric או dimeric, של כל קבוצה לקפל, לזרז הפסקות הגדיל כפול של כל היתקלות, ללא קשר אם מחשבים קטליטיים וספציפיות חופפים (כמו בדוגמה NlaIV) או נפרדים (למשל, FokI). יתר על כן, הפרוטוקול בעיקרון הוא שימושי לא רק עבור הדור של הפרט החדש, האנזים הצר יותר, אבל יכול לשמש גם כדי לחסל את הפעילות כוכב, או כדי ליצור מחדש בנאמנות באיכות גבוהה. עם זאת, כל זה עדיין לא נבדק. בפרט, חיסול ממוקד של פעילות כוכב עשוי להיות מסובך, כי אותו שאריות חומצות אמינו יכול להיות מעורב בכריכה לבסיסים הרצוי ולא רצויים. בצעדי החוץ-מבחנה המתוארים בפרוטוקול זה אינם מוגבלים לבחירה של מצמצמי הצורה, אך ניתן להשתמש בה גם לבחירת משתנים ששונו אחרת. עם זאת, יש אז בעיה עם משתנה endונוקלסים: אם הספקטרום של מצעים כולל מטרות הרומן לא ביקע על ידי endonucחכירה הורים, יש בכלל אין דרך טובה להגן על התאים מפני ההשפעות המזיקות של פעילות זו. לעומת זאת, אם endonuclease ספציפיות רק לצמצם, המטרות הן תת-קבוצה של מטרות סוג פראי, ולכן הזמין כבר קנצוני מתילאז צריך להיות מגונן לחלוטין.

הפרוטוקול שלנו שונה בכמה כבוד מפרוטוקולי אבולוציה מכוונים רבים. מסגרת קריאה פתוחה מגוון מופק פעם אחת בתחילת הניסוי, לא בכל איטרציה. כמו-כן, היא נוצרת על-ידי סינתזה מפוצלת ומיקס, ולא על-ידי EP-PCR. עבור החלפות NNS של codons, כמו בשימוש בעבודה זו, יש (4 x 4 x 2)⁶ ~ 1.07 x 10⁹ שילובים עבור שישה מיקומים. לכן, כל משתנה נתון קיים בממוצע פעם אחת ב-1.7 שומות של ESC. קיבולת זו יכולה להיות מוגברת לשבעה תנוחות באמצעות סינתזה עם תערובת של 20 מקדמי טריאוקלאואות מראש כי הוא מוצע על ידי גלן מחקר או על ידי הפחתת תדר מוטציה בתנוחות פחות מבטיח עם מפוצל ו-mix הסינתזה של מיקס. במידת האפשר, מומלץ להגביל את מידת הווריאציה לשישה תנוחות. כמובן, מיקוד כזה דורש ידע מראש על לפחות האזורים של ושהה המעורבים בכריכה מצע. הפרוטוקול המפוצל והמיקס להפקת גיוון הוא בעל יתרונות ברורים בהשוואה ל-EP-PCR. באמצעות EP-PCR, הצלחנו להשיג משתנים ורצפים ללא שינוי הנושאים שמונה החלפות עבור NlaIV ESCs באותו EP-PCR (שולחן 4). הספרייה מ-EP-PCR מכילה חלקיק משמעותי של שיבוטים שיש להימנע מהם (רצפים סוג פראי, החלפות מרובות, מוטציות frameshift ושטויות, ומוטציות במקומות סביר להשפיע על הספציפיות הרצף).

הפרוטוקול שלנו גם שונה מפרוטוקולים רבים אחרים של אבולוציה מכוונות על ידי נוכחות של שני שלבי בחירה רציפים. בחירה חיובית מוודא שהפעילות הרצויה נשמרת, אחרת התג ביוטין אינו מוסר, וניתן להסיר את רצף הקידוד על-ידי משיכה למטה. זה אפשרי מבחינה טכנית כי הופעתה של רומן, ספציפיות לא חופפים (g., gcatgc) יכול להוביל לניתוק של תג ביוטין גם, אם אתר מחשוף מתאים נמצא ליד המחשוף הרצוי, אבל לא במקום אחר. עם זאת, זה צריך להיות מאוד לא סביר. בחירה שלילית מסירה מסגרות קריאה פתוחות הקוד עבור אנזימים שעדיין יש להם פעילות בלתי רצויה. צעד זה אינו חובה בלבד, כי הפרוטוקול עדיין להעשיר את ספריית הפלט עם משתנים כי הם מסוגלים לדבוק רצף הבחירה אבל לא מסוגל לקליב במקום אחר ב ESC, ולכן הרינדור זה לא מתאים הגברה PCR. עם זאת, יעילות הבחירה צפויה להיות נמוכה יותר משום אנזימים עם ספציפיות הרצף המקורי לא יוסרו מן הפלט ויהיה להתמודד עם משתנים מבטיחים עם ספציפיות שונה, אבל גם ירידה פעילות אנזימטית. שים לב כי ברמת האוכלוסייה, שניהם הרצוי ובלתי רצויות רצפי היעד יכול, אבל לא צריך להיות, מנוון. בדוגמה NlaIV, האנטי-מטרה היה מנוון והמטרה לא מנוונת. גם כאשר יש התנוונות ברמת האוכלוסייה, ב-droplet אחת בלבד (לא מנוונת) יעד או אנטי יעד קיים. בפרוטוקול שלנו, רצפי היעד והאנטי-יעד מוצגים מחדש בכל חזרה על צעדי הבחירה. לכן, מסגרת הקריאה פתוח חייב לקודד אנזים מסוגל לעזוב את כל המטרות האפשריות, ולא יכול לדבוק כל האנטי מטרות, כדי לשרוד סיבובים בחירה מרובים. שים לב כי הצורך להציג מראש את היעד האנטי-בחירה בכל איטראציה של הפרוטוקול כופה שני בדיקות רציפים. ה-PCR הראשון משתמש בפריימר המספח מחוץ למטרה, כך שמחשוף האנטי-מטרות ימנע את תגובת ה-PCR. ה-PCR השני דורש כיוון שמגיע מעבר ליעד, ומציג מחדש את אנטי-היעד, כדי לוודא שבמהלך מספר סבבים של בחירה, כל מסגרת קריאה פתוחה נבדקת כנגד כל המשתנים של האנטי-מטרות.

עבור אנזימים היוצרים קצוות דביקים, פרוטוקול חלופי קשור המבוסס על שיטה שתוארה בעבר לבידוד של ושהה ORF¹⁰ ניתן להשתמש. דלדול של משתנים לא פעילים על ידי לכידת ביוטין המשמש בניסויים שלנו מוחלף בפרוטוקול האלטרנטיבי על ידי הארכה של מתאם תואם עם רצף המשמש כאתר כריכה פריימר ב-PCR סלקטיבי (איור 9). רק ESCs שמייצרים אנזימים עם הספציפיות שנבחרו יוצרים קצוות בעלי יכולת הארכה ולכן ייבחרו. יש לתכנן את הרצף של הקצה הדביק של המונה שנבחר באמצעות מונה באופן שאינו יכול להשתתף במתאם עם מתאמים. איטרציה של תהליך הבחירה ניתן להשיג בקלות על ידי מעבר בין שני מתאמים שונים וכתוצאה מכך שני התחל הפוכה שונה ב-PCR סלקטיבי.

אפילו עם פרוטוקולים חדשים, המשימה של הנדסת רומן הנדסה בתוך מבחנה עדיין מאוד מאתגר. עבור הקצאות מסוג II, ספציפיות לרצף ופעילות למען המין הרגיל תלויות באותם אזורי חלבון. לכן קשה לשנות אחד מבלי להשפיע על האחר. הצלחה היא הסבירות יותר על ידי אסטרטגיה הלוקחת בחשבון את טביעת הרגל של האנזים, מכבדת את הסימטריה של אינטראקציות חלבונים-DNA, ובונה על העדפות אנזימטיות קיימת, אשר צריך להיקבע מראש בניסויים ביוכימיים, כפי שנעשה עבור NlaIV דוגמה⁸.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1000 וארינג; תמיכת CPG (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	ניתן להשתמש גם בספקים אחרים
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
ערכת מיצוי ג'ל GeneJET Thermo	Scientific	K0691	ניתן להשתמש בכל ערכה אחרת
מחסנית טיהור DNA Glen-Pak	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
pET 28a וקטור			ניתן להשתמש במקום זאת בכל וקטור אחר עם מקדם T7 במעלה הזרם של אתר הפליקלינג
זאת ניתן			להשתמש בכל פולימירס תרמופילי אחר בנאמנות גבוהה ועיבוד גבוה
פלדה נקבובי	Biosset	40-063
מערכת תרגום מהיר RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
הגבלת אנדונוקלאזות	תרמו סיינטיפיק		ברור שספקים אחרים, אנזימים יכולים לשמש
סטרפטווידין חרוזים מגנטיים	ניו אינגלנד ביולאבס	S1420S	ניתן להשתמש גם בספקים אחרים. בדקנו באופן חיובי מיטות
מכימיקלים של סיגמא סינתזה כולל זרחנים	קארל רות'		ניתן להשתמש גם בספקים אחרים עמודות
סינתזה (גדלים שונים)	Biosset
T4 DNA ligase	Thermo Scientific	EL0011	ניתן להשתמש בכל ליגאז אחר