מטרת שיטה זו היא לקבוע את צפיפות CR1 ב אריתרופוציטים של כל נושא על ידי השוואת עם שלושה נושאים שצפיפות הCR1 של erythrocyte ידועה. השיטה משתמשת cy, לאחר כתמים חיסוני של הנבדקים ' אריתרופוציטים על ידי נוגדן אנטי CR1 שבטיים מצמידים למערכת מוגברת באמצעות phycoארימתרין (PE).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה
במאמר זה
סיכום
תקציר
CR1 (CD35, משלים מסוג הקולטן 1 עבור C3b/C4b) הוא הממברנה מולקולרית משקל גבוה גליקופרוטאין של כ 200 kda כי שולטת הפעלה משלימים, הובלות מתחמי החיסון, ומשתתפת תגובות החיסונית ומוראלית הסלולר. CR1 נמצא על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כולל אריתרופוציטים, ומוצגים פולימריות באורך, מבנה (Knops, או KN, קבוצת דם), וצפיפות. הצפיפות הממוצעת של CR1 לאריתרופואריציט (CR1/E) היא 500 מולקולות לכל אריתרופואריציט. צפיפות זו משתנה מאדם אחד למשנהו (100 – 1200 CR1/E) ומתוך אריתרופואריציט אחד למשנהו באותו אדם. אנו מציגים כאן השיטה החזקה cy, למדוד את הצפיפות של CR1/E, כולל בנושאים המבטא צפיפות נמוכה, בעזרת מערכת חיסונית הגברה. שיטה זו אפשרה לנו להראות את הורדת הביטוי CR1 אריתרופוציטים במחלות כגון מחלת אלצהיימר (AD), זאבת מערכתית שושנה (מיקרו), איידס, או מלריה.
מבוא
CR1 (סוג קולטן משלים 1, CD35) הוא 200 kda הטרנסקרום גליקופרוטאין להציג על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כגון אריתרופוציטים1, B לימפוציטים2, תאים monocytic, כמה תאים T, תאים דנדריטים הזקיקים3, העובר אסטרוציטים4, ו-podocytes מדומה5. CR1 מתערב עם ליגידיים C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, יחידת משנה של רכיב המשלים הראשון, C1q10 ו mbl (mannan-כריכה לקטין)11 מעכב את ההפעלה של המשלים והוא מע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול של איסוף הדם האנושי והטיפול נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה האזורית (CPP Est II), ומספר הפרוטוקול הוא 2011-A00594-37. מכיוון שהפרוטוקול הבא מתאר את הטיפול בדם אנושי, יש לעקוב אחר הנחיות מוסדיים לסילוק חומרים ביולוגיים. יש לענוד ציוד בטיחות מעבדה, כגון מעילי מעבדה וכפפות.
1. שטיפת אריתרופואריציט
הערה: ביום שלפני הטיפול, להכין מאגר PBS-BSA עם מלוחים מואגור פוספט (PBS) המכיל 0.15% של סרום שור פרה (BSA) ולמקם אותו במקרר ב 4 ° c. מאגר זה ישמש כמאגר כביסה וכמאגר דילול.
- פיפטה 20 מ ל של PBS-BSA לתוך שפופרת 50 mL.
- מוצית 250 μL של נתרן ethylenediamine חומצה (EDTA) anticoagulated דם שלם מצינורות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אריתרופוציטים של שלושה נושאים אשר צפיפות CR1 ידועה ("נמוך" נושא [180 CR1/E], "בינוני" נושא [646 CR1/E], ו "גבוהה" נושא [966 CR1/E]), ו של שני נושאים שצפיפות הCR1 שלהם צריך להיקבע היו מוכתם בנוגדן אנטי CR1 מצמידים למערכת הגברה באמצעות הפילוקוארירין fluorochrome. בהתחלה, הצפיפות הCR1 של הנושאים מהטווח הנמוך נקבע על-ידי שיטת המלך-שיטה29 באמצעות נוגדנים רדיקולאבים. הסטנדרטים (נמוך, בינוני, גבוה) נקבע שימשו עקומת כיול ואפשרו לכמת סטנדרטים חדשים או תת סטנדרטים על ידי השיטה שלנו של cyהניסיון
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טכניקות מסוימות זמינות כדי לקבוע את הצפיפות של אריתרופויציט CR1 (CR1/E). הטכניקות הראשונות ששימשו היו התנוצנות של כדוריות הדם האדומות על ידי anti-CR1 נוגדנים31 ואת היווצרות רוזטות בנוכחות של אריתרופוציטים מצופה עם C3b32. טכניקות אלה בסיסי הוחלפו במהירות על ידי שיטות חיסוני באמצעות radiolabeled אנטי CR1 נוגדנים1,33. ניתן גם למדוד את הריכוז של CR1 בתמציות קרום על ידי האנזים מקושר אנזימים הקשורים באותה שיטת (אליסה)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לכל חברי URCACyt, הזרימה cy, בפלטפורמת הטכנית, צוות המחלקה לאימונולוגיה, וצוות המחלקה לרפואה פנימית וגריאטריה, שתרמו למיטוב ולאימות הפרוטוקול. עבודה זו ממומנת על ידי בתי חולים של אוניברסיטת ריימס (גרנט מספר AOL11UF9156).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1000E קצה מחסום | תרמו פישר מדעי , F-67403 אילקירך, צרפת | 2079E | מדגם פיפטינג |
| 1-100 ומיקרו; L משופעת, קצה מסנן | Starlab GmbH, D-22926 אהרנבורג, גרמניה | S1120-1840 | דגימת פיפטינג |
| נוגדן חד שבטי אנטי-CR1 ביוטינילאטית (J3D3) | ייצור ביתי של נוגדן חד שבטי לא מסחרי, באדיבות ד"ר ג'יי קוק | צביעה חיסונית | |
| הגנה על | חולצה | ||
| אלבומין בסרום Bovin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 אילקירש, צרפת | 15260037 | ציטומטריה |
| צנטריפוגה | תרמו פישר סיינטיפיק , F-67403 אילקירך, צרפת | 11176917 | צנטריפוגה |
| פתרון נקי | BD, F-38801 לה פונט דה קליקס, צרפת | 340345 | ציטומטריה |
| Comorack-96 | דומיניק DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | מתלה |
| ציטומטר הגדרה & ערכת חרוזי מעקב | BD, F-38801 Le Pont de Claix, צרפת | 655051 | תמיסת פורמלדהיד ציטומטריה |
| 36.5 | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | קיבוע |
| 10 ומיקרו; L בוגר, קצה מסנן | Starlab GmbH, D-22926 ארנבורג, גרמניה | S1121-3810 | מדגם פיפטינג |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, צרפת | 647788 | ציטומטריה |
| מיקרומן בוכנות נימיות | דומיניק DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | מדגם פיפטינג |
| מיקרוני 1.40 מ"ל צינורות תחתונים עגולים | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - סוג M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 מדגם פיפטינג | |
| פוספט חוצץ מלח (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 אילקירך, צרפת | 10010031 ציטומטריה | |
| פיפטה PS 325 מ"מ, 10 מ"ל | דומיניק DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | מדגם פיפטינג |
| ללא אבקת ניטריל מבחן כפפות | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, ארה"ב | 486802 | הגנת מדגם |
| התייחסות 2 פיפטה, 0,5-10 ומיקרו; L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | פיפטה לדוגמא |
| הפניה 2 פיפטה, 20-100 ומיקרו; L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | פיפטה לדוגמא |
| התייחסות 2 פיפטה, 100-1000 ומיקרו; L | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | מדגם פיפטינג |
| תמיסת שטיפה | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | ציטומטריה |
| צינור תחתון עגול | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | ציטומטריה |
| צינורות נעילה בטוחה, 1.5 מ"ל | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, צרפת | AS-60669 | Immunostaining |
| צינורות צנטריפוגה מחודדים 50 מ"ל | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| וקטור אנטי סטרפטווידין ביוטין | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, צרפת | BA-0500 | צביעה חיסונית |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, בוהמיה, ניו 111716, ארה"ב | תערובת SI-0236 |
מקורות
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
