התאמה מגנטית של מטען אחרי ברקמות הלב מהונדסים

Benjamin Becker; Marita  L. Rodriguez; Tessa  R. Werner; Justus Stenzig; Thomas Eschenhagen; Marc N. Hirt

doi:10.3791/60811

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התאמה מגנטית של מטען אחרי ברקמות הלב מהונדסים

5.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60811

⸱

5 במאי 2020

Benjamin Becker^*¹^,² , Marita L. Rodriguez^*¹^,² , Tessa R. Werner¹^,² , Justus Stenzig¹^,² , Thomas Eschenhagen¹^,² , Marc N. Hirt¹^,²

¹Institute of Experimental Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, ²DZHK (German Centre for Cardiovascular Research)

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק שיטות מפורטות המתארות את ייצור ויישום של פלטפורמת כוונון afterload מבוססי מגנטיקה עבור רקמות לב מהונדסים.

תקציר

לאחר העומס ידוע לנהוג בהתפתחות של מצבי לב פיסיולוגיים ופתולוגיים. ככזה, לימוד התוצאות של מצבי העמסה שונה יכול להניב תובנות חשובות למנגנונים השולטים בתהליכים קריטיים אלה. עם זאת, טכניקה ניסיונית לכוונון מדויק של המטען ברקמת הלב לאורך זמן חסרה כעת. כאן, הטכניקה החדשה שפותחה מבוססי מגנטיקה להשגת שליטה זו ברקמות הלב (EHTs) מהונדסים. על מנת לייצר EHTs להגיב מגנטי (MR-EHTs), הרקמות הם רכוב על הודעות סיליקון חלול, כמה מהם מכילים מגנטים קבועים קטנים. קבוצה שנייה של מגנטים קבועים הוא ללחוץ על התאמה לתוך צלחת אקריליק כגון שהם מכוונים עם קוטביות זהה והם מיושרים עם מגנטים פוסט. כדי להתאים את העומס, צלחת זו של מגנטים מתורגמת לכיוון (מטען אחר גבוה יותר) או משם (afterload התחתון) מתוך הפוסט magnets באמצעות שלב פיזואלקטריים מצויד מקודד. תוכנת בקרת התנועה המשמשת להתאמת מיקום הבמה מאפשרת פיתוח של משטרי משתמש מוגדרים על ידי המשתמש בעוד המקודד מבטיח כי השלב מתקן עבור כל חוסר עקביות במיקומו. עבודה זו מתארת את הייצור, הכיול והיישום של מערכת זו כדי לאפשר פיתוח של פלטפורמות דומות במעבדות אחרות ברחבי העולם. תוצאות הנציגים משני ניסויים נפרדים נכללים כדי להדגים את מגוון המחקרים השונים שניתן לבצע באמצעות מערכת זו.

מבוא

Afterload הוא עומס סיסטולי על החדר אחרי זה התחיל להוציא דם¹. במהלך התפתחות הלב, המטען המתאים הוא בחשיבות קריטית עבור התבגרות הקרדיוציט². בבגרות, רמות נמוכות של העומס החדרית (למשל, בחולים למיטה עם פציעה ברמה גבוהה בחוט השדרה³ או במקרים מיוחדים מאוד כמו טיסה⁴) יכול לגרום היפופרס של הלב. לעומת זאת, העומס הגבוה יכול להוביל להיפרפרס⁵. בעוד היפרפרס לב בספורטאים סיבולת או נשים בהריון נחשב מועיל פיסיולוגי, יפרטרופיה הקשורים ביתר לחץ דם עורקים לטווח ארוך או היצרות חמורה של שסתום אבי העורקים הוא מזיק כפי שהוא מקדם אחד להפרעות בקצב הלב וספיקת לב⁶. למרות שיעור התמותה 5 שנים עבור חולים אי ספיקת לב הופחת מ ~ 70%^{בשנות ה-80} ל-40-50%⁷ כיום, יש עדיין צורך גדול אפשרויות טיפול רפואי חדש עבור מצב זה שכיח מאוד (כיום 2.2% האוכלוסייה בעולם המערבי)⁸.

כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של היפרפרס הלב הפתולוגי ולבחון אסטרטגיות מונעות או טיפוליות לטיפול במחלה זו, בvivo מודלים של מטען אחרי פותחו⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². בעוד מודלים אלה הציעו תובנות מועילות לתוך ההשפעות של העומס afterload ביצועים חדרית, הם אינם מאפשרים שליטה עדינה על בהירות העומס afterload לחילופין, במחקרים בלתי מתורבת של afterload שבוצעו על לבבות מוכי ההכנות שרירים לאפשר שליטה עדינה יותר על טעינת רקמות, אבל מודלים אלה אינם מסייעות למחקרים האורך¹³^,¹⁴^,¹⁵.

כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו מודל מבחנה של העומס האחורי ברקמות הלב מהונדסים (ehts)¹⁶^,¹⁷. מודל זה הוא בפורמט תלת מימדי התרבות עבור תאי לב חולדה מוטבע מטריצה פיברוב מושעה בין הודעות סיליקון גמיש החלול. רקמות אלה היכו באופן ספונטני (נגד ההתנגדות של הודעות הסיליקון) ולבצע עבודה הקלה. יש לנו הגדלת afterload להחיל EHTs על ידי גורם של 12 בניסויים קודמים על ידי החדרת של מתכת נוקשה לתוך הודעות סיליקון חלול לשבוע אחד. זה הוביל להמון שינויים, מאפיין של לב פתולוגי היפרפרס¹⁸^,¹⁹^,²⁰: היפראוטוציט היפר, נמק חלקי, ירידה בכוח כריתת העור, ליקוי של הרפיה רקמות, ההפעלה מראש של תוכנית הגן העובר, משמרת מטבולית של חמצון חומצות שומן כדי גליקולוליזיס אנאירובי, ועלייה פיברוזיס. למרות הליך זה הועסק בהצלחה במספר מחקרים¹⁷^,²¹^,²², יש לו כמה חסרונות. יש רק שתי מדינות, נמוך או גבוה מאוד (12 קיפול) afterload, ואת ההליך דורש טיפול ידני של EHTs, אשר מגביל את הגמישות הטמפורלית שלה מהווה את הסיכון לזיהום.

לאחרונה, ליאונרד ואח ' השתמשו בטכניקה דומה לווסת את העומס שאחרי ב EHTs תרבותי על הודעות סיליקון²³. מסולסלים של אורכים שונים הוצבו סביב החלק החיצוני של ההודעות כדי להגביל את התנועה כיפוף שלהם. המחברים של מחקר זה דיווחו כי גידול יחיד קטן בינוני בעומס כוח משופר התפתחות והתבגרות של האדם הנגזר של ה-iPS, בעוד נטען גבוה יותר הביא למצב פתולוגי. עם זאת, בדומה למערכת שלנו, טכניקה זו מאפשרת רק להגברת היחיד בעומס האחר, בסדר הגודל שהוא מוכתב על-ידי אורך הגשר. ככזה, שינויים עדינים ב-afterload, שינויים ב-afterload לאורך זמן, משטרי טעינה מדויקת אינם אפשריים עם טכניקות אלה.

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול עבור מערכת שיכולה לשמש לווסת לאחר ההתנגדות, כלומר, אחרי העומס של EHTs מגנטוסטי²⁴. פלטפורמה זו מקלה על הכיוונון העדין של afterload, מאפשר משטרי משתמש מוגדרים על ידי המשתמש, ומבטיח עקרות EHT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת פלטפורמת הכוונון של Afterload

הערה: השלבים המעורבים בחלק זה של הפרוטוקול אינם תלויי-זמן.

ייצור מתלים ממגנטים הקשובים לסיליקון
הערה: ארונות תקשורת אלה משמשים כפלטפורמת התרבות של EHTs. כל EHT מושעה בין שני הודעות סיליקון, אשר מהקנות לטעון את הרקמה. דרגת afterload קשורה ישירות הנוקשות של הודעות אלה. כדי לאפשר כוונון afterload מגנטי, חלק מההצבות צריכים להגיב באופן ממגנט.
1. השיגו 24 מדפים מתאימים לצלחת של הודעות סיליקון (מידות שניתנו באיור המשלים 1). המדפים המשמשים במחקר זה יוצרו על ידי ספק מסחרי מוצרי סיליקון על פי ממדים אלה באמצעות סיליקון עם קשיות החוף של 40.
2. לקבוע את קוטביות הפוסט מגנטים (למשל, d = 0.5 מ"מ, h = 2.0 מ"מ; ראה טבלת חומרים) על ידי הצבת אותם על מגנט קבוע גדול יותר.
3. לשמור על קוטביות קבועה, לשמן את המגנטים עם מים ולהכניס אותם, אחד בכל פעם, אל העמודים החיצוניים ביותר של ארונות הסיליקון.
  הערה: אם אתה מנסה להוסיף יותר ממגנט אחד בכל פעם, ההתנגדות הנוספת תעשה את זה קשה יותר לדחוף את המגנטים לתחתית ההודעה.
4. השתמש פיסת הקהה של חוט שיניים פלדת אל-חלד (ד ≈ 0.4 מ"מ, ראה טבלה של חומרים) כדי לדחוף אותם בזהירות אל החלק התחתון של חלל post חלול. אתה יכול לערום עד חמישה מגנטים בכל הודעה.
5. שימוש (עגול-אף) צבת לכופף חוט שיניים נירוסטה (ד ≈ 0.4 מ"מ, ראה טבלה של חומרים) לתוך סוגריים מסולסלים 11.25 מ"מ רוחב ו 15 מ"מ אורך. השתמשו בחותכי תיל כדי לגזור את הסוגריים המסולסלים ואת הקובץ כדי להחליק את משטח החיתוך. כדי להבטיח את הממדים הנכונים מושגת, אפשר להשתמש בג עצמית כדי לסייע התיל כיפוף.
  הערה: ניתן להשיג גם בסוגריים מסולסלים שעשויים מחומרים אחרים, כל עוד הם לא-מגנטיים ונוקשים.
6. שדוד את הפלטה במים והכנס אותם לתוך מתלה הסיליקון, מתקן את ההצבה השנייה והשלישית לחיצונית בתהליך (ראה איור 1 עבור התקנה מלאה של מתלה הסיליקון).
  הערה: באופן אופציונלי, כדי להתאים את הנוקשות הבסיסית של הודעות בקרה כדי להתאים את זה של הודעות תגובה מגנזיום, שברי של המוט העגול יריעות (ראה טבלת חומרים) ניתן להוסיף לתוך ההודעות הריקות (אלה ללא סוגר או מגנט).
7. תנו לארונות לעמוד במשך 1 – 2 ימים כדי לאפשר למים הנותרים להתייבש באוויר.
8. כאשר ההודעות יבשות, לאטום את החורים בחלק העליון של הודעות סיליקון חלול המכיל את המגנטים באמצעות טיפה של דבק סיליקון.
התקן הכוונון של הטעינה
הערה: כמו מגנטים במכשיר הכוונון afterload מועברים לכיוון או הרחק מן ההודעות הסיליקון, כוחות מגנטיים אטרקטיביים להגדיל או להקטין בהתאם, והתוצאה היא קשיות שונה של הודעות סיליקון. תנועה זו מושגת באמצעות שלב פיזואלקטריים. בשל אופיו האופייני של התקן כוונון afterload, מפורט הוראות צעד אחר צעד על איך לשכפל אותו לא יסופק. במקום זאת, הנחיות כללית לבניית התקן דומה של כוונון afterload מפורטים להלן.
1. השג מנוע מאוד מדויק ליניארי מאוד פיזואלקטריים כדי לאפשר את התרגום האנכי של הצלחת מגנט לכיוון והרחק ehts (ראה לוח חומרים).
  הערה: הוא הציע מאוד כי מנוע זה להיות מצויד עם מקודד ליניארי לתקן את מיצוב הבמה.
2. מיקום קבוצה של מגנטים קבועים בתוך מחזיק לא מגנטי כזה שהם מיושרים עם מגנטים פוסט כאשר ממוקמים ישירות מתחתם. כאן, מגנטים גליליים גדולים (d = 13 מ"מ, h = 14 מ"מ; ראו טבלת חומרים) היו התאמה לעיתונותבתוך צלחת פלסטיק אקרילי ("מגנט צלחת").
3. לצרף את מחזיק מגנט לשלב פיזואלקטריים באמצעות חומר לא מגנטי. ניתן להשיג זאת באמצעות פיסת אלומיניום בצורת L (ראה איור 2).
4. בנו מסגרת שיכולה לשכן את הרכיבים של התקן הכוונון של המטען. לכל הפחות, מבנה זה צריך להיות מיקום שבו כדי לטעון אנכית את השלב פיזואלקטריים, כמו גם מסגרת נוקשה שעליה למקם את הצלחת 24-באר.
  הערה: הוא הציע כי המיקום של הר זה ניתן לשינוי במישור האופקי כדי לאפשר התאמות יישור צירית בין שני סטים של מגנטים. מערכת של כוננים מכניים שימש להשגת יכולת תמרון זו במערכת המוצגת (איור 3). מכשיר הכוונון של המטען שמתואר כאן נועד להיות תואם למערכת הניתוח של המחשב הפעיל של EHT (ראה טבלת חומרים). ככזה, הממדים שלו היו מוגבלים 29 ס"מ רוחב, 29 ס"מ עומק, ו 16 ס"מ גובה כדי להשתלב במערכת זו.
5. כדי לאפשר ניתוח חזותי של הרקמות, התקן מקור אור בתוך התקן כוונון afterload. כאן, מערך של נוריות הועסק (איור 4) כדי להאיר את ehts מלמטה (איור 5).
מכייל את מערכת כוונון המטען האחורי
הערהעל מנת להגדיל במדויק EHT afterload את הערך הרצוי, את הקשר בין מגנט המרווח ואת הקשיות הפוסט כתוצאה יהיה צורך להיקבע.
1. למדוד את המרווח הקרוב ביותר (d_דקות) ואת הריווח הרחוק ביותר (d_max) האפשרי בהתקנה שלך. המרחקים האלה יכתיב את העומסים. המקסימליים והמינימליים
  הערה: החלק התחתון של לוחית התרבות ימנע מגע ישיר בין הצלחת המגנט והודעות הסיליקון התגובה ממגנטית.
2. ליצור מגוון של משקולות שאינן מגנטיות ולטעון אותם על מחרוזת כדי לשמש עומסים הבדיקה.
3. לקבוע את המשקולות של טעינת הבדיקה באמצעות קנה מידה עדין ולתייג אותם לפי משקל זה. כאן, שישה משקולות זכוכית אקריליק שונים החל 30 מ"ג ל 200 mg שימשו.
  הערה: בחר משקולות מספיק כבד כדי לכופף את ההודעה, אבל לא כל כך כבד שהם לכופף את ההודעה יותר מאשר כמה מילימטרים. שימוש במספר גדול יותר של טעינות בדיקה מבטיח שהכיול יהיה מדויק יותר, אך הוא יהיה גם רב יותר בזמן.
4. הר אחד מארונות הסיליקון במאונך (באמצעות חומרים שאינם מגנטיים), כך הודעות הסיליקון התגובה מגנטית מכוונות אופקית.
5. הר אחד של הצלחת מגנטים ("כיול מגנט") על הבמה ליניארי נע אופקית כך שהוא מיושר באופן מגנטי עם ההודעה תגובה מגנטוטית.
6. הצב את מגנט כיול מרחק מוגדר מפוסט סיליקון מגנטי תגובה באמצעות השלב האופקי (רצוי, להתחיל במרחק שווה מרווח מגנט המרבי השגה על ידי התקן כוונון afterload).
7. מניחים מצלמה (לדוגמה, ראה טבלת חומרים) לצד ההגדרה כדי להיות מסוגל להקליט את הסטיה של הפוסט תחת השפעת המבחנים.
  הערה: הוא הציע כי המשתמש להעסיק מצלמה עם רזולוציה של לפחות 2 מגה פיקסל כדי להבטיח נחישות מדויקת של הטיה פוסט.
8. צלם תמונה של ההודעה בהיעדר משקולות כלשהן לשימוש כהפניה למיקום "ניטרלי" של הפוסט.
9. מבלי לשנות את נקודת המבט של המצלמה, לצרף אחד העומסים עד סוף מאוד של הפוסט סיליקון ולצלם את הפוסט כיפוף תחת השפעת המשקל.
10. חזור על מדידה זו עבור כל המשקולות.
11. באופן optically לקבוע את הסטיה של הפוסט סיליקון שנגרם על ידי כוח הכבידה של כל משקל.
12. גרף הטיה של הפוסט הסיליקון (x, על ציר x) נגד כוח הכבידה של כל משקל בדיקה (mg, על ציר y). זה אמור להניב קשר ליניארי בין כוח והטיה.
  הערה: אם הנתונים הם לא ליניאריים, זה עשוי להעיד כי ההודעה היא מחוץ לטווח הליניארי של הטיה, כלומר, משקולות מנוצל היו כבדים מדי.
13. התווה פונקציית רגרסיה ליניארית העוברת דרך (0, 0) והנתונים שנרכשו (ראה איור 6A לדוגמה). השיפוע של פונקציה זו (mg = ב) הוא הנוקשות k של פוסט סיליקון מגנטי תגובה במרווח מגנט נבדק.
14. חזור על שלבים אלה במספר רווחים בין d_max ו -d_min. כאן, ב 9 תנוחות מגנט שונים הנע מ ~ 31 מ"מ כדי ~ 5 מ"מ נותחו.
15. לקבוע את הקשיחות הבסיסית של פוסט סיליקון מגנזיום תגובה בהעדר מגנט כיול באמצעות אותה טכניקה.
16. כמו כן לקבוע את הנוקשות של הודעה נייד, לא מגנט תגובה בקרת באמצעות אותה טכניקה.
17. להתוות את ערכי k שהתקבל נגד מרחקים מגנט בהתאמה. הדבר אמור להניב קשר מעריכי שלילי.
18. התוויית פונקציית רגרסיה באמצעות ערכים אלה. לדוגמה, השתמש בהתאמה לא-ליניארית | פונקציית ריקבון בשלב אחד בתוכנת הניתוח (עיין בטבלת החומרים). פונקציית רגרסיה זו מתארת את הקשר בין ריווח מגנט לבין עומס שאחרי (ראה איור 6B לדוגמה).

2. EHT דור ותרבות

הערה: דור EHT ותרבות תוארו בפירוט רב בסעיף אחר²⁵. לכן, אנו רק נכסה היבטים אלה בקצרה בפרוטוקול שלנו. נא לבצע את השלבים הבאים תחת תנאים סטריליים, הקפדה על שיטות לתרבות התא הטוב.

דור EHT
1. לטבול את ארונות הסיליקון שהוכנו בעבר במיכל מילא 70% אתנול לפחות 20 דקות.
  זהירות: אל תאוטובים הודעות סיליקון מתכווננת לאחר הטעינה כדי לעקר אותם כמו טמפרטורות גבוהות יכול לפגוע מגנטים קבועים.
2. הביאו את המיכל לתוך ארון הביובטיחות, שטפו את מתלה 2x במים סטריליים, והרשו להם להתייבש באוויר.
  הערה: כדי להפחית את הסבירות של זיהום, תהליך זה צריך להתבצע באותו ארון בטיחות ביולוגית שמאוחר יותר ישמש להטיל את EHTs.
3. לרכוש (ולהפשיר במידת הצורך) לבלב בתאי לב המוח הגוף או היפנוטית (תא גזע הנגרמת על ידי אדם)-הקרדיוציטים הנגזר (גם מסחרית זמין) ולהכין את המיקס EHT החוקה על פי לוח 1.
4. Pipet 1.5 mL של חם 2% agarose פתרון לשמאל 4 בארות של לוחית 24 היטב התרבות ומיד להוסיף טפלון (לראות את הטבלה של חומרים) לתוך הפתרון הנוזלי.
5. חזור על השלב הקודם עבור 20 הבארות הנותרות בתוך לוח התרבות.
6. לאחר שאפשר לחזק את הצמח במשך ~ 10 דקות, הסר בזהירות את המיאכרים.
  הערה: הצמח מתהפך כשהוא מתחזק.
7. הכנס את ההצבות של ארונות הסיליקון הרגישים ממגנטים לחללים המיוצרים על ידי המוספרים.
8. Pipet 100 μl של שילוב החוקה לתוך 3 μl סדרת מחלקים של 100 mU/L תרומבין פתרון. פיפטה למעלה ולמטה פעמיים כדי לערבב ובמהירות להעביר את התערובת לתוך הריק בתוך התבנית הראשונה של הצמח על צלחת התרבות.
9. חזור על השלב הקודם עבור 23 התבניות הנותרות, תוך שימוש בתשר חדש עבור כל EHT.
  הערה: בעדינות לערבב את החוקה לערבב כל 6-8 EHTs כדי למנוע משקעי תאים.
10. אחסן את הצלחת 24-באר באינקובטור (37 ° c, 7% CO₂, 40% O₂) עבור 90 דקות. בינתיים, להכין את מדיום EHT על ידי להשלים את מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום סוסים, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 10 μg/mL אינסולין ו 33 μg/mL aprotinin נין.
11. הוסף 500 μL של המדיום EHT חם לכל טוב.
12. אחסן את הצלחת 24-באר באינקובטור (37 ° c, 7% CO₂, 40% O₂) עבור 30 דקות. במהלך הזמן הזה, להכין צלחת השני 24-באר עם 1.5 mL של מדיום EHT בכל טוב ולמקם אותו בחממה.
13. הסר בזהירות את מתלה הסיליקון מגנט רגיש עם EHTs טרי על אותם מתוך תבניות agarose ולהעביר אותם לצלחת השנייה 24-היטב.
התרבות של EHT
הערה: בעקבות השלכת רקמות, שנה בינונית שלוש פעמים בשבוע: בימי שני, רביעי ושישי.
1. עבור שינוי בינוני, pipet 1.5 mL של בינוני EHT טריים לתוך לוחית חדשה 24-היטב התרבות ומקום צלחת זו בתוך החממה ב 37 ° c, 7% CO₂, ו 40% O₂ עבור לפחות 30 דקות.
2. העבר את מתלה הסיליקון מלוחית הרישוי הישנה לצלחת החדשה שמתחת למכסה המנוע של התאים.
3. אחסן את צלחות EHT סגור בחממה ב 37 ° c, 7% CO₂, ו 40% O_2.

3. ניסויים בשינוי בעומסים

הערה: שלבי הפרוטוקול הבאים הם ספציפיים לפלטפורמת הניתוח האופטי והתנועה האופטית המפורטת בטבלת החומרים.

הכנת מכשיר כוונון afterload לניסויים
1. כדי למדוד את ההשפעות של מניפולציות לאחר העומס על כיוונון EHT, לנתק ולהסיר את מערכת התאורה מהתא הפנימי ביותר של פלטפורמת ניתוח אופטי כוונון ולהכניס את המכשיר הכוונון afterload כולל את מקור האור.
2. התקן את תוכנת בקרת התנועה של הבמה (ראה טבלת חומרים) במחשב שישמש להפעלת התקן כוונון afterload.
3. חבר את מנוע הבמה פיזואלקטריים לבקר התנועה (ראה טבלת חומרים), ואת בקר התנועה למחשב. ודא שבקר התנועה מחובר גם למקור חשמל.
  הערה: יש שני אורות על הפנים. של בקר התנועה עם ההתחברות לעוצמה, שתי הנוריות מהבהבות באדום למשך מספר שניות. במהלך הפעולה, האור העליון נשאר ירוק בזמן שהתחתון צריך להפוך לאדום רק אם מתרחשת שגיאה.
4. מניחים צלחת התרבות הריקה 24 היטב על הר הצלחת בחלק העליון של המכשיר כוונון afterload.
5. ליישר את צלחת התרבות הריקה עם הצלחת מגנט למטה באמצעות מערכת כונן מכני XY המצורפת להר.
הפעלת התקן כוונון אחרי העומס
1. הפעל את תוכנת פלטפורמת בקר התנועה.
2. חבר את התוכנה למנוע הבמה piezo על ידי בחירת היציאה המיועדת כיציאת הבמה במהלך ההתקנה של תוכנת בקרת תנועה ולאחר מכן לחץ על לחצן יציאה פתוחה .
  הערה: לאחר השלמת שלב זה, יש לייעד את היציאה כ"פתוחה" ולהופיע בתיבה ירוקה.
3. עבור אל לוח המערכת . בחר באפשרות ' פתח לולאה ' בתפריט הנפתח לולאה .
4. באופן ידני להעביר את הצלחת מגנט לעמדה הגבוהה ביותר שלו, כלומר, מגנט הקרובים ביותר האפשרי d_דקות. לוחית המגנט צריכה ליצור. קשר עם הר התרבות
5. . לך ללוח התנועה לחץ על לחצן אפס כדי לאפס את המיקום הנוכחי של השלב piezo ל-0 מ"מ.
6. להעביר באופן ידני את הצלחת מגנט למצב הנמוך ביותר האפשרי שלה. כתוב את תנוחת מקודד (המצוין בלוח התנועה על ידיהרכב) כדי לקבוע את טווח התנועה עבור מנוע הבמה פיזואלקטריים.
7. הגדר את מגבלות הנסיעה בלוח המערכת לערכים בטווח התנועה שנקבע בשלב הקודם. זה מונע את הצלחת מגנט להיתקל לתוך לוחית התרבות או התחתון של המכשיר כוונון afterload.
8. שוב, להעביר את הצלחת מגנט למיקומו הגבוה ביותר ולחץ על כפתור אפס .
9. עבור אל לוח המערכת ושנה את מצב לולאת המשוב ללולאה סגורה. פעולה זו מבטיחה כי השלב יהיה מדויק עבור כל שגיאה במיצוב.
10. לחץ על לחצן שמור בתיבה שמור פרמטרים כדי לאחסן הגדרות אלה במערכת.
11. מניחים לוח התרבות 24 היטב המכיל EHTs על מדפים סיליקון מגנזיום תגובה על הר לוחית התרבות.
12. כדי לחשב את מרווח המגנט הדרוש כדי להשיג את העומס הרצוי, לפתור את פונקציית הרגרסיה לינארית משלב 1.3.19 עבור פרמטר המרווח מגנט d. לדוגמה, אם המשוואה היא: , d להיות מרווח מגנט (mm) הכרחי כדי להשיג את הצורך המבוקש המטען k ב-mN/mm, מרווח מגנט של 12.12 מ"מ יהיה צורך להשיג את המטען של 5 mN/mm.
13. חיסור d_דקות מהמרווח המחושב של מגנט d. התוצאה היא מרחק את הצלחת מגנט יש לנסוע מעמדה אפס שלה כדי להשיג את המטען הרצוי.
14. הקלד ערך זה בשדה הקלט ' תנוחת יעד 1 ' בלוח התנועה ולחץ על ' עבור ' כדי לכוונן את הטעינה של הערך של ehts לערכים המחושבים.
אופציונלי: תכנות הבמה עבור משטר מרווח אחרי העמסה
הערה: המקטע הקודם מתאר כיצד לתכנת את הבמה כדי לעבור ולהישאר במיקום יחיד. עם זאת, ניתן גם לשרשר פקודות שונות יחד לתוכנית כדי להשיג רצף של תנועות באופן אוטומטי, שניתן לחזור עליהן בלולאה רציפה. לקבלת הוראות מפורטות יותר בנוגע לתוכנת הפלטפורמה של בקר התנועה, עיין במדריך ההפעלה שסופק על-ידי יצרן הבמה.
1. לאחר הגדרת התקן הכוונון של afterload כמתואר בסעיף הקודם, פתח את לוח הבקרה. הקלד את הפקודה 1Pgm1 והקש Enter כדי להתחיל בהקלטת תוכנית.
2. כדי ליצור תוכנית אשר, למשל, יגרום לשלב פיזואלקטריים לרדת 30 מ"מ מהמיקום אפס (הרחק ehts) ולחזור אחרי 40 s, הזן את שרשרת הפקודות הבאות: 1mva30 → 1wst → 1mva30 → 1mva30 → 1wst
3. השתמש בפקודה 1End כדי להסיק הקלטה של תוכנית ושמירתו.
4. השתמש בפקודה 11 כדי לבצע את התוכנית המוקלטת.
5. כדי להשאיר את התוכנית פועלת בלולאה רציפה, הזן 1Pgl1ולאחריו הפקודה 1, 1 .
6. כדי לסיים תוכנית לולאה, הזן את הפקודה 1Est.
  הערה: טבלה 2 מכילה כמה פקודות שימושיות עבור ניסויים שינוי מטען אחרי עומס. רשימה מלאה של הפקודות הזמינות עבור מערכת זו ניתן למצוא במדריך הייחוס עבור מערכת בקרת תנועה מודולרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מגנט פוסט נוקשות לכמת
מגנטי מונחה אופקית התגובה לפוסט סיליקון הותקן במצב קבוע, ו מגנט כיול מיושר axially הוצב בכמה מרחקים מוגדרים ("מגנט הרווחים") מתוך הודעה זו. העומס מבחן של משקל ידוע הושעו מסוף הפוסט סיליקון, גורם לעמוד לכופף. הטיה זו היתה מקוונטית. מערכת יחסים קווית בין כוח הכבידה של עומס הבדיקה והטיה שלאחר ההודעה נצפתה בכל החללים המגנט (איור 6A). ערכי הנוקשות הנובעים מקשרים ליניאריים אלה פעלו בעקבות מגמה מעריכית שלילית עם הגדלת ריווח המגנט (איור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר להלן מתאר טכניקה חדשה לצורך שינוי מגנטית של העמסה ברקמות הלב. טכניקה זו מסתמכת על השימוש בשלב פיזואלקטריים כדי לתרגם צלחת של מגנטים חזקים כלפי והרחק מארונות מגנזיום תגובה של הודעות סיליקון. ככל ששני סטים של מגנטים, חזקה העומס שחוו על ידי EHTs תרבותי עליהם.

קיימים מספר שלבים קריטיים לייצור ולשימוש מוצלחים במערכת זו. בעוד בדיית לתאי סיליקון מגנזיום להגיב, הוא חשוב באופן מכריע כדי להבטיח כי כל המגנטים בתוך ההודעות מכוונים עם קוטביות זהה. אם מגנט מוצב בכיוון ההפוך, הוא ישמש להחליש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

TE ו-והינם מייסדי משותף של החברה. לכל הסופרים האחרים. אין מה לגלות

תודות

המחברים מודים Jutta Starbatty על התמיכה שלה בעבודת התרבות רקמה, אקסל קירשהוף לצילום, אליס Casagrande סקונטו לעריכת עבודה, ותודות מיוחדת בולנט Aksehirlioglu לתמיכה טכנית בפיתוח של התקן זה. בי בי היה נתמך על ידי DZHK (המרכז הגרמני למחקר לב וכלי דם) המלומד גרנט, M.L.R. על ידי ויטאקר הבינלאומי בתר דוקטורט גרנט ו M.N.H. על ידי קרנות מן DZHK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגנטים לצלחת גלילית	HKCM	9962-55184	h = 14 מ"מ, d = 13 מ"מ
מגנטים לפוסט גלילי	HKCM	9962-63571	h = 2 מ"מ, d = 0.5 מ"מ
חוט שיניים	Ormco	266-1316	d = 0.016 אינץ' (0.406 מ"מ)
GraphPad	GraphPad, לה ג'ולה, קליפורניה, ארה"ב	גרסה 6.00 עבור Windows
תוכנת בקרת תנועה למנוע piezo	Micronix USA		להורדה בחינם בדף הבית של היצרן
בקר תנועה למנוע piezo	Micronix USA	MMC-100-01000
Optical פלטפורמת ניתוח התכווצות	טכנולוגיות EHT	A0001
מנוע ליניארי פיזואלקטרי	Micronix USA	PPS-20-15206	מצויד במקודד אופטי ליניארי, סביבת חממה תואם
Styrene Rod	Plastruct	MR-15	d = 0.015 אינץ' (0.381 מ"מ)
מצלמת USB	Reichelt Elektronik	REFLECTA 66142

תוכנת אופטית

מקורות

Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , Elsevier. (2018).
McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29(2015).
Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309(2015).
Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 4 Pt 2 747-754 (1985).
Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307(2012).
Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9(2016).
Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494(2019).
Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Afterload Control

התאמה מגנטית של מטען אחרי ברקמות הלב מהונדסים