הפרוטוקול מציג מודל מאומת TNBS המושרה מלאה של מחלת קרוהן ושיטות עבור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות immunofluorescence מקטעים נקודתיים קבוע מוטבע פרפין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרוהן היא הסוג האובחן ביותר של מחלת המעי הדלקתית. דלקת כרונית המתפתחת במעי מוביל להפרעה הפריסטלזיס ולנזק של רירית המעי ונראה להיות משויך לסיכון מוגבר של שינוי המעי הגס הנאופלסטי. צבירת ראיות עולה כי אסטרוגנים וקולטנים אסטרוגן להשפיע לא רק רקמות הורמונלי רגיש, אלא גם רקמות אחרות לא קשור ישירות אסטרוגנים, כגון הריאות או המעי הגס. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעת החיסונית מוצלחת של קולטני אסטרוגן במעי הגס המתקבל ממודל murine של מחלת קרוהן המושרה. פרוטוקול מפורט אינדוקציה של מחלת קרוהן בעכברים והכנה למעיים מסופק, כמו גם צעד אחר צעד אימונוהיסטוכימיקלים הליך באמצעות formalin קבוע-מקטעים המעי מוטבע. השיטות שתוארו הם לא רק שימושי לזיהוי קולטן אסטרוגן החקירה איתות אסטרוגן ב vivo אבל יכול גם להיות מיושם על חלבונים אחרים אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס.
מבוא
קרוהן (CD) היא מחלת מעיים דלקתית (IBD) הנראית כמו דלקת המעי כרונית. האטיולוגיה של תקליטור הוא הבין בצורה גרועה, אבל יש כמה גורמים עיקריים שנראים להיות אחראי על פיתוח תקליטורים, כולל microbiota המעי, וגורמים גנטיים וסביבתיים, כגון דיאטה או מתח1. להבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מחלת קרוהן, מודלים שונים של דלקת במעיים שימשו2,3,4,5,6,7. במאמר זה, אנו מציגים את התוצאות שהתקבלו מ 2, 4, 6-trinitrobenzene נזן חומצה sulfonic (TNBS)-מודל murine המושרה של תקליט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקרי בעלי חיים נערכו בהסכמת הוועדה האתית המקומית (28/ל2016) בהתאם לצו 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי ולמועצת ספטמבר 22, 2010 והמלצות מוסדיים.
1. TNBS המושרה מודל מורטין של מחלת קרוהן
הערה: פרוטוקול זה משתמש בעכברים מסוג BALB/C ששוקל 25-28 g. בעלי חיים שוכנו בטמפרטורה קבועה (22-24 ° c) ו, לחות יחסית 55 ± 5%, ומתוחזק 12 h אור/כהה מחזור עם גישה חופשית כדורי אוכל רגיל ברז מים לחות המודעה.
- הניחו את העכבר לתוך חדר האינדוקציה וסגרו את המכסה בחוזקה. בקיצור העכבר בקצרה עם isofלוריאן (25% O2 עם o2 שיעור זרימה ב 1.5-2 L/דקות).
הערה: קצב הנשימה צריך להישאר קצבי ואיטי מה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המאפיינים המקסקופיים של נקודתיים בעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS
תמונות מייצגות של נקודתיים שנלקחו מהפקד ועכברים שטופלו ב-TNBS מוצגים באיור 2. בעכברים עם מודל TNBS המושרה של מחלת קרוהן, אורך המעי הגס מופחת בעוד רוחב המעי הגס הוא גדל.
איור 2: נקודתיים מייצגים שהתקבלו מעכברי הבקרה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם מודלים רבים של בעלי חיים עבור בדיקה פתופסולוגיה IBD, כולל גנטי, מודלים אימונולוגיים או ספונטנית, כמו גם דגמים המושרה כימית15. בין מספר סוגים של מודלים בעלי חיים של קוליטיס, כימית המושרה מודלים כגון מודל TNBS המושרה המתואר בפרוטוקול זה, הם זולים יחסית וקל להשיג. המודל המושרה TNBS של קוליטיס יש כמה תסמינים קליניים הקשורים בסיס פתולוגי של תקליטור. בעלי חיים בעלי קוליטיס מושרה מאופיינים בהיווצרות צואה לא עקבית, שלשול מדמם ואובדן משקל הגוף. עם זאת, אין זה אומר כי מודל זה ניתן להשתמש כדי ללמוד CD e.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
העבודה פורסמה בזכות התמיכה הכספית של הרשויות באוניברסיטת לודז ': סגן הרקטור למחקר מדעי, סגן הרקטור לשיתוף פעולה לאומי ובינלאומי ודיקן הפקולטה לביולוגיה והגנת הסביבה. דמיאן ז'זניק נתמך על ידי מענקים (2017/24/T/NZ5/00045 ו-2015/17/N/NZ5/00336) מהמרכז הלאומי למדעים, פולין.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברי Animals | |||
| BALB/C | אוניברסיטת לודז' | NA | |
| strong>Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| בלוק קרטון | NA | ||
| NA מיקרוסקופ קונפוקלי - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| מיקרוטום סיבובי אוטומטי לחלוטין - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| שקופית זכוכית | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| מודול הטמעת פרפין מחומם - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| קופסה היסטולוגית | Marfour | LN.138747 | |
| עט הידרופובי | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| איזון מעבדה | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X תוכנה | Leica Biosystems | NA | |
| תבנית מתכת | Marfour | CP.5105 | |
| גזה סטרילית | NA | ||
| NA מספריים סטריליים | NA | ||
| פינצטה סטרילית | |||
| מעבד רקמות NA - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| strong>Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| אלבומין סרום בקר | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 נוגדן משני | Abcam | ab96886 | |
| ERα נוגדן ראשוני | Abcam | ab75635 | |
| ERβ נוגדן ראשוני | Abcam | ab3576 | |
| אתנול | אוונטור חומרי ביצועים פולין | 396480111 | |
| פורמלדהיד | אוונטור פרפורמנס פולינס פולין | 432173111 | |
| GPER נוגדן ראשוני | Abcam | ab39742 | |
| חומצה הידרוכלורית | Avantor Performance Materials פולין | 575283421 | |
| מימן פרוקסידאז | Avantor Performance Materials פולין | 885193111 | |
| איזופלורן (פוראן) | בקסטר | 1001936040 | |
| סרום עיזים רגיל | Gibco | 16210064 | |
| פרפין | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer מלח | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| תמיסת מלח פיזיולוגית | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| פרימוצין (אנטיביוטיקה) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant עם DAPI (נוזל מבוסס גליצרול עם DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| נתרן כלורי | Chempur | WE/231-598-3 | |
| נתרן ציטראט | אוונטור חומרי ביצועים פולין | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials פולין | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance חומרים פולין | BA0860119 |
מקורות
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
