מאמר שיטה

יציבה מנוק של גנים הקידוד מיקתאי מטריקס חלבונים ב C2C12 Myאובלסט התא באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA

DOI:

10.3791/60824

⸱

12 בפברואר 2020

 ,  , 
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים פרוטוקול כדי להפיל גנים מטריקס קידוד מטריצות (ECM) חלבונים ב C2C12 myoblasts באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA. פילוח ADAMTSL2 כדוגמה, אנו מתארים את השיטות לאימות היעילות של הנוק-אין, חלבון, ורמת הסלולר במהלך C2C12 myoblast כדי לאפשר בידול צינור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטריצה מסחטות (ECM) חלבונים חיוניים להתפתחות שריר השלד הומאוסטזיס. הנוק-אין יציב של גנים קידוד עבור חלבונים ECM ב C2C12 myoblasts ניתן להחיל על ללמוד את התפקיד של חלבונים אלה בפיתוח שריר השלד. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לרוקן את החלבון ECM ADAMTSL2 כדוגמה, באמצעות סיכת ראש קטן (sh) ב C2C12 תאים. לאחר הזיהום של הפלמידים מרין, תאים יציבים שנבחרו באצווה באמצעות puromycin. אנו מתארים עוד יותר את התחזוקה של קווי התאים האלה ואת הניתוח פנוטימית באמצעות ביטוי mRNA, חלבון ביטוי, ו C2C12 בידול. היתרונות של השיטה הם הדור המהיר יחסית של אורווה C2C12 מלמטה תאים והבידול אמין של תאים C2C12 לתוך מיוקלנים בחברה על דילול הסרום במדיום תרבות התא. הבידול של תאים C2C12 יכול להיות מפוקח על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר ועל ידי מדידת רמות הביטוי של גנים סמן קאנוני, כגון MyoD, מיוגאין, או רירן שרשרת כבדה (Myod) המציין את ההתקדמות של C2C12 myod חוז בידול לתוך מיוכי. בניגוד הסתרה חולף למטה של גנים עם קטן מתערב (si) RNA, גנים מבוטא בשלב מאוחר יותר במהלך C2C12 בידול או במהלך התבגרות ההבשלה ניתן לפלח ביעילות רבה יותר על-ידי יצירת C2C12 תאים באופן מהיר למדי לבטא שרין. מגבלות השיטה הן השונות ביעילות הנוק-אאוט, בהתאם למרין הספציפי שניתן להתגבר על-ידי שימוש באסטרטגיות הסתרה גנטית המבוססות על CRISPR/Cas9, כמו גם השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה של מרין, כי יש לשקול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים בעלי מטריקס (ECM) מספקים תמיכה מבנית לכל הרקמות, מתווכים בתקשורת תא התא וקובעים את גורל התאים. היווצרות ושיפוץ דינמי של ecm הוא ולכן קריטי כדי לשמור על רקמות ואיברים הומאוסטזיס1,2. משתנים פתולוגיים בקידוד מספר גנים עבור חלבונים ecm להצמיח הפרעות שריר-השלד עם פנוטיפים החל שרירי dystrophies כדי לבנות פסבדו-אקראי3,4. לדוגמה, משתנים פתוגניים ב ADAMTSL2 לגרום מחלת השלד השרירים נדירה ביותר, אשר מציג עם בנייה פסבדו-מולקולרית, כלומר, עלייה לכאורה במסת שריר השלד5. יחד עם ביטוי גנים נתונים בעכבר ובבני אדם, זה מציע תפקיד ADAMTSL2 בפיתוח שריר השלד או הומאוסטזיס6,7.

הפרוטוקול שאנו מתארים כאן פותחה כדי ללמוד את המנגנון שבו ADAMTSL2 שריר השלד פיתוח שרירים ו/או הומאוסטזיס בסביבה תרבות התא. הADAMTSL2 באופן בלתי נשכח. בתוך קו התאים של מורטין C2C12 מיחוז C2C12 myoblasts ואת הבידול שלהם לתוך מיופופרות הוא מתואר היטב בשימוש נרחב מודל התרבות התא לבידול שריר השלד שריר השלד ביו-8,9. C2C12 תאים לעבור שלבים בידול ברורים לאחר הנסיגה סרום, וכתוצאה מכך היווצרות של מיוקליום של החברה לאחר 3-10 ימים בתרבות. אלה שלבים בידול יכול להיות מפוקח באופן אמין על ידי מדידת רמות mRNA של גנים שונים סמן, כגון MyoD, מיוגאין, או רירן שרשרת כבדה (Myod). אחד היתרונות של הפקת הC2C12 גן יציב בתאי התאים הוא כי הגנים באים לידי ביטוי בשלבים מאוחרים יותר של C2C12 בידול יכול להיות ממוקד יותר ביעילות, לעומת הסתרה חולף למטה מושגת על ידי הפרעה קטנה (si) RNA, אשר בדרך כלל נמשך 5-7 ימים לאחר החצייה, והוא מושפע היתרון השני של הפרוטוקול כפי שמתואר כאן הוא הדור המהיר יחסית של אצוות של C2C12 להוריד תאים באמצעות puromycin הבחירה. חלופות, כגון CRISPR/Cas9-בתיווך גנים בנוקאאוט או בידוד של תא ראשי שריר השלד מראש מפני האדם או היעד-גנים לקויה לקוי הם מבחינה טכנית יותר מאתגרת או דורשים את הזמינות של ביופסיות שרירים החולה או היעד-עכברים לקוי המטרה, בהתאמה. עם זאת, דומה לגישות אחרות של תרבות התא, יש מגבלות בשימוש בתאי C2C12 כמודל לבידול תא שריר השלד, כגון הטבע דו מימדי (2D) של הגדרת תרבות התא ואת העדר בסביבה vivo מיקרו כי הוא קריטי לשמור על תאים מובחן שריר השלד מקודמן10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מכינה את ה-DNA של שרין מתוך es, coli

  1. דור של מושבות בקטריאלי של שבטים הנושאים את הפלמידים מרין
    1. להשיג מניות גליצרול של E. coli נשיאת פלמידים ספציפיים היעד, שליטה בפלבין מקורות מסחריים (טבלת חומרים).
      הערה: השתמשו בשלושה פלמידים שונים, מיקוד של אזורים שונים של המורין Adamtsl2 mrna. מרין אחד נבחר כדי למקד את 3 '-אזור untranslated (3 ' UTR) של Adamtsl2 כדי להקל על ניסויים הצלה עם הביטוי פלמידים קידוד רקומביננטי באורך מלא Adamtsl2 או בודדים Adamtsl2 בתחומים של חלבון. בנוסף, שרין מקושקשת היה כלול כפקד שלילי. פרטים של רצפי שרין מסופקים באיור 1א.
    2. הפשרת מלאי בקטריות גליצרול בטמפרטורת החדר (RT). העברה 10 μL של המניה גליצרול בקטריאלי על לוריא ברטני (LB) הצלחת אגר בתוספת עם 100 μg/mL אמפיצילין (LB-Amp).
      הערה: ליברות-Amp צלחות מוכנות על ידי אוטוקלינג 1 L של LB בינונית (עבור 1 L: 10 גרם של טריטונים, 5 גרם של תמצית שמרים, 10 גרם של הלארג, להתאים את ה-pH ל 7.0) יחד עם 12 גרם של אגר. תן את המדיום קריר עד ~ 50 ° צ' ולהוסיף אמפיצילין (פתרון מניות: 50 mg/mL ב מים סטרילי) לריכוז הסופי של μg/mL (LB-Amp אגר). מיד למזוג ~ 20 מ ל של LB-Amp אגר בצלחת 10 ס מ פטרי ולתת את אגר מגבש לפני השימוש. 1 L של LB-Amp אגר מספיק בדרך כלל כדי למזוג כ 40 10 ס"מ מנות פטרי. מנות פטרי המכילות LB-Amp אגר הם יציבים למשך חודש אחד לפחות אם מאוחסנים נעולים ב 4 ° c בחושך.
    3. הפיצו חיידקים עם מרית דריגלסקי סטרילית או כל שיטה מתאימה אחרת להשגת מושבות בודדות בקטריות. . לילה בשעה 37 ° c
  2. הכנה פלסמיד
    1. למחרת בבוקר, להסיר את צלחת פטרי עם מושבות חיידקי בודדים ולאחסן ב 4 ° צ' כדי למנוע צמיחה יתר של מושבות חיידקי והיווצרות של מושבות לווין. אטום את צלחת פטרי אם מאוחסן לילה או יותר.
    2. בשעות אחר הצהריים, הוסיפו 5 מ ל של מדיום ליברות-Amp לתוך צינור תרבות חיידקי פוליפרופילן. בחר מושבה בודדת בקטריאלי מצלחת פטרי ללילה עם טיפ פיפטה ומדיום ליברות-Amp על ידי הוצאת העצה הפיפטה בצינור התרבות החיידקי המכיל את המדיום LB-Amp.
    3. דגירה התרבות החיידקית לילה בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c עם המכסה מחובר באופן רופף כדי לאפשר האנטנה.
    4. לקחת את צינור התרבות החיידקית בבוקר למחרת ולשמור ב 4 ° צ' כדי למנוע התרחבות יתר חיידקי. בשעות אחר הצהריים, להשעות את החיידקים מחדש על ידי vortexing ולהעביר 1 מ ל של התרבות החיידקית לילה ב 50 mL של מדיום LB-Amp ב 250 מ"ל בקבוקון חרוט. דגירה לילה בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    5. בבוקר למחרת, העברת חיידקים 50 mL מנקז חד פעמיות וחיידקים צנטריפוגה ב 6,000 x g ב RT עבור 15 דקות. הסר את המדיום ולהמשיך עם שלב 1.2.6.
      הערה: אם ה-DNA באמצע לא ניתן לבודד מיד, להסיר את המדיום LB-Amp לאחר הצעד הצנטריפוגה ולאחסן את הגלולה חיידקים ב-20 ° c.
    6. בצע את ההוראות של ערכת הכנה פלאמיד (סולם midi) כדי לחלץ את ה-DNA פלמיד מן החיידקים. הערכת באיכות DNA באמצעות מדידת A260/a280 יחס באמצעות ספקטרוסקופיה.
      הערה: A260/a280 היחס של > 1.8 הוא רצוי, המציין טוהר גבוה של הכנת ה-DNA פלאמצע. נמוכה יותר A260/a280 יחס מציע זיהום עם חלבון או הסרה מספיק של ריאגנטים החילוץ. ניתן לקבל שלבי טיהור נוספים בפלמיד.

2. הC2C12 תאים ובחירת Puromycin

  1. C2C12 תרבות התא
    1. הפשרת תאים C2C12 (טבלה של חומרים) במהירות באמבט מים 37 ° c ו לשפוך תאים סטרילי חד פעמי 15 מ ל צנטריפוגה המכיל 8 מ ל של בינונית שונה של הנשר של דולקבקו (dmem) בינוני עם 100 יחידות של פניצילין ואנטיביוטיקה סטרפטומיצין (סרום חינם dmem) במכסה של תרבות התא. תאים צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 160 x g ב RT.
    2. משלחים הסופר ומשלחים את הגלולה בתוך 10 מ ל של הסרום ללא שימוש בסרום (FBS) בתוספת 10%. להעביר תאים 10 ס מ התרבות רקמה מטופלים מנות פלסטיק. התאים הדגירה בתוך מחולל לחות ב-37 ° c באווירה 5% CO2 .
    3. ביום שלמחרת, החלף את המדיום באמצעות DMEM טרי מלאה.
    4. הרחיבו את המעבר הנמוך C2C12 תאים ב-3-4 10 ס מ מנות. כאשר תאי C2C12 מגיעים ל-50-60% למפגש, מוטרים את המדיום ושוטפים תאים C2C12 עם 10 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS).
    5. הוסף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA ו-דגירה עבור 2 דקות ב-RT. הצג ניתוק תאים מתחת למיקרוסקופ והארך את זמן הדגירה במידת הצורך, עד שמרבית התאים ינותקו.
      הערה: בזהירות הקשה על הצלחת יכול לעזור להוציא את התאים.
    6. כאשר רוב התאים מנותקים, להוסיף 10 מ ל של DMEM להשלים את הצלחת, פיפטה את עוצמת הקול למעלה ולמטה מספר פעמים, ולהעביר הבולם התאים לצינור מתכלה סטרילי 15 מ"ל. תאים צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 160 x g בשעה RT. ולהשעות את הגלולה הנייד ב 2 מ ל של הקפאה בינונית (10% diמתיל סולפוקסיד [dmso]/90% fbs).
    7. העברה של 2 מיל 1 ל -10 ס מ בקריובקבוקונים. מיכל ההקפאה בתא מקפיא ממולא בהקפאה של 24 שעות ב-80 מעלות צלזיוס, והתוצאה היא הקפאה של כ-1 ° c לדקה כדי למנוע היווצרות גבישי קרח. לאחסן תאים לשימוש לטווח ארוך בשלב האדים של חנקן נוזלי.
      הערה: הספק ממליץ להשתמש בתאי C2C12 עד למעבר מס ' 15. חוויות המחברים הראו גם כי המעבר התחתון מספר תאים הראה הבחנה עקבית יותר ומהירה לתוך היופופרות. חיוני לשמור על C2C12 תאים בצפיפות תא נמוכה (< 50% המפגש) כדי למנוע התפרצות מוקדמת של בידול. אין אפשרות להפוך תאים מC2C12 או מובחנים למצב myoblast חוז המקורי ויש להיפטר ממנו.
  2. הכנת תאים C2C12 להעברה
    1. תרבות מובחן C2C12 תאים בצלחת 10 ס מ עד שהם מגיעים 50-60% זרימה. מלבין את המדיום, לשטוף תאים C2C12 עם 10 מ ל של PBS, ולהוסיף 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA. דגירה עבור 2 דקות ב RT, לפקח על ניתוק התא מתחת למיקרוסקופ, ולהאריך את זמן הדגירה אם יש צורך, עד רוב התאים מנותקים.
      הערה: בזהירות הקשה על הצלחת יכול לעזור להוציא את התאים.
    2. כאשר רוב התאים מנותקים, להוסיף 10 מ ל של DMEM להשלים את הצלחת והעברת הבולם הנייד לצינור מתכלה סטרילי 15 מ"ל. תאים צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 160 x g ב RT. ומחדש את הגלולה הנייד ב 4 מ ל של dmem שלם.
    3. לשלב 10 μL של השעיה לתא עם 10 μL של טריפי כחול בצינור 1.5 mL, לערבב ידי ליטוף למעלה ולמטה בזהירות מצליף הצינור התגובה, ולהעביר תאים לשקופית ספירה. קבע את מספר התאים/mL באמצעות מונה תאים אוטומטי.
    4. לדלל תאים C2C12 כדי 50,000 תאים/mL ו הזרע 100,000 תאים (2 מ ל) לכל טוב ב 6 צלחת הבאר כדי להשיג כ 40-50% המפגש לאחר הדגירה לילה. התאים הדגירה בתוך מחולל לחות ב-37 ° c באווירה 5% CO2 .
  3. העברה של תאים C2C12 עם הפלגינה באמצעות פוליאתילן (פיי) ובחירת puromycin
    1. הכנת התמיסה של מניות פיי.
      1. התמוססות 16 מ"ג של פיי ב 50 mL של מים מזוקקים סטרילי (ריכוז של פתרון מניות: 0.32 mg/mL) ב 50 mL בקבוק מדיה זכוכית עם כובע בורג. דגירה הפתרון ב 65 ° צ' עבור 1 h ו מערבולת הפתרון במרץ מספר פעמים במהלך תקופת הדגירה כדי לפזר לחלוטין את פיי.
      2. להתאים ל-pH 8 על ידי הוספת 15 μL של הHCl 1N ל50 mL.
        התראה: הHCl הוא מאכל. HCl מרוכז צריך להיות מטופל מתחת למכסה המנוע. החוקרים צריכים ללבוש. ציוד הגנה אישי מתאים
      3. הקפאת הפתרון פיי ב-80 ° צ' עבור 1 h עם מכסה מחובר באופן רופף במהירות ב 37 ° צ' באמבט מים כדי לשפר עוד מסיסות. חזור על מחזור ההפשרה 3 x.
      4. מניות חנות פיי מלאי 0.5 mL לשימוש חד פעמי ב-20 ° c.
    2. העברה של תאי C2C12
      1. שילוב 25.5 μL (8.5 μL/μg באמצע ה-DNA) של הפתרון מניות פיי, עם 100 μL של 25 מ"מ בתוך 1.5 שפופרת התגובה משנת mL ו דגירה של 5 דקות ב-37 ° c. לשלב 3 μg של ה-DNA פלמיד עם 100 μL של 25 מ"מ הנארוג ו-דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
      2. לשלב את הנפח כולו של הכימית פיי מדולל עם פלבאמצע מדולל ולערבב על ידי בעדינות ללטף למעלה ולמטה. דגירה של 25 דקות ב 37 ° c.
      3. בזמן הדגירה, לשנות את המדיום של התאים C2C12 המיועדים לטיפול ב-DMEM ללא FBS או אנטיביוטיקה.
      4. הוסף את המיקס פיי/DNA ערבוב כדי C2C12 התאים ירידה על ידי ירידה ומערבבים כל הזמן על ידי הזזת בזהירות צלחת תרבות התא. מודטה באינקובטור מחולל לחות ב-37 ° c באווירה של 5% CO2 . לאחר 6 שעות, שנה את המדיום כדי להשלים את DMEM.
    3. בחירה Puromycin
      1. 24 שעות לאחר המעבר, מעבר בינוני למדיום בחירה (DMEM מלאה בתוספת 5 μg/mL puromycin). המשך puromycin בחירה עד לקבלת תאי C2C12 puromycin עמידים בפני התאים, אשר בדרך כלל מתקבלים 10-14 ימים.
      2. הרחב puromycin עמידים C2C12 תאים בצפיפות תא נמוכה (< 50-60% המפגש), כלומר, כדי לשמור על המצב מובחן והקפאה של 6-10 מבחנות לניסויים עתידיים כמתואר בשלבים 2.1.4-2.1.7.
        הערה: שמור על C2C12 תאים puromycin עמידים בנוכחות של 5 μg/mL puromycin עבור תרבות תא שגרתית והתרחבות. עם זאת, puromycin הושמט בניסויים בידול.

3. אנליזה פנוטימית של C2C12 בידול

הערה: השיטות המתוארות להלן יכול בקלות להיות מותאם לניתוח פנוטימית כללי של בידול C2C12 myoblast חוז לתוך מיוטוטים על ידי שינוי הנוגדנים הספציפיים המשמשים בלופ המערבי או בצבעי היסוד הגן המשמש את כמותית פולימראז בדיקת תגובת שרשרת (qPCR).

  1. C2C12 מיקרוסקופיה ומיקרוסקופ ברייטפילד
    1. זרע 150,000 תאים/גם בצלחת 12 היטב. Puromycin עמיד בפני תרבות C2C12 תאים יציבים בצלחת של 12 מעלות בינונית בתוך מחולל לחות בחממה ב-37 ° c באווירה של 5% CO2 . תרבות C2C12 תאים בשנת DMEM מלאה עד שהם מגיעים ~ 95% המפגש.
    2. כדי לגרום לבידול של תאים C2C12, החלף את DMEM מלאה עם DMEM ללא סרום (יום 0 של בידול). שינוי בינוני כל יומיים ולאחר היווצרות C2C12 מיושפופרת באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך עם מצלמה.
      הערה: פרוטוקולים רבים להשתמש 2% סרום סוסים להבדיל תאים C2C12 לתוך מיוכי. בידי סופרים, הסרת הנסיוב הייתה לגמרי בעלת השפעה דומה. אינסולין מתואר כתוסף למדיום תרבות התא כדי להאיץ C2C12 בידול. עם זאת, בפרוטוקול הנוכחי, תאי C2C12 מובחנים באופן אמין בתוך 3-5 ימים לאחר מניעת הסרום והוספת אינסולין הייתה מיותרת.
  2. רירן החיסוני הכבד (MyHC) להמחיש מיותמים
    1. Seed 50,000 C2C12 תאים לחדר בתוך 8 שקופית קאמרית היטב ב 500 μL של DMEM מלאה. התאים התרבותיים עד שהם מגיעים 95% המפגש ב-DMEM מלא (כ 24 שעות).
    2. כדי לגרום לבידול, לעבור מ-DMEM להשלים ל-500 μL של הסרום ללא הבחנה (יום 0 של בידול). בזמן הרצוי נקודת (עם), מרוב בינוני ולשטוף את התאים 3x עם 0.5 mL של PBS.
      הערה: בצע את כל השלבים הבאים בשעה RT.
    3. תקן תאים עם 0.2 mL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) מדולל ב PBS עבור 15 דקות. לשטוף את התאים עם 0.5 mL של PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
      התראה: המטה מסוכן. נקוט באמצעי זהירות מתאימים והתעלם מפתרון הפאראפורמלדהיד כפסולת מסוכנת.
    4. כיבוי כדור הראש עם 0.2 mL של 0.5 M גליצין ב PBS עבור 5 דקות. לשטוף את התאים עם 0.5 mL של PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
    5. התאים מודדים עם 0.2 mL של 0.1% שאינם יוניים/חומרי ניקוי (טבלת חומרים) ב-PBS עבור 10 דקות לחדור קרום התא. בלוק עם 0.2 מ ל של 5% בסרום של שור בערוץ הPBS עבור 1 h. לשטוף את התאים עם 0.5 mL של PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
    6. התאים דגירה עם 0.2 mL של הנוגדן MyHC (1:200 ב PBS) עבור 2 h. לשטוף את התאים עם 0.5 mL של PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
    7. התאים מקרין עם 0.2 mL של עז אנטי עכבר מעלה מעלה מעלה מעלה מעלה מצושל (1:200 ב PBS). לשטוף את התאים עם 0.5 mL של PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
    8. לאחר הסרת הערוץ הPBS, להוסיף טיפה אחת של בינוני ההרכבה המכילה 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) לכל חדר. כיסוי ולרפא מדיום הרכבה על פי הוראות היצרן. . חותם עם לק
    9. התבוננו בתאים C2C12 בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטית באמצעות ערכת הסינון המתאימה.
  3. הערכת מפסק יעילות על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (רביעיית PCR)
    1. התרבות C2C12 תאים תחת תנאי בידול ב 12 לוחות היטב כמתואר בסעיף 3.1.
    2. בזמן הרצוי נקודת (עם), להסיר את המדיום בידול, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 mL של PBS, ולהוסיף 0.5 mL של מגיב החילוץ RNA (טבלת חומרים) לכל טוב. Lyse את התאים על ידי ליטוף בזהירות למעלה ולמטה ולהעביר למטה תא לצינור התגובה סטרילי 1.5 mL. לבודד את ה-RNA על ידי בזהירות בעקבות פרוטוקול היצרן.
      התראה: מגיב החילוץ של RNA מכיל פנול. . זה אמור לשמש תחת מכסה המנוע לאסוף את הפסולת הכימית לחילוץ RNA ולהיפטר כמו פסולת מסוכנת. החוקרים צריכים ללבוש. ציוד הגנה אישי מתאים
    3. מפזר את הגלולה הסופית RNA ב 20 μl של דיאתיל פירוקרבונט (depc)-מים מטופלים. לקבוע את הכמות והאיכות של הכנת ה-RNA באמצעות ספקטרוסקופיה ולקבוע את היחס A260/a280 כמדד איכות.
      הערה: תשואה טיפוסית מ 1 טוב של 12 צלחת הבאר היא 5-7 μg של RNA סך עם A260/a280 יחס של 1.8-2.
    4. כדי לעכל שיורית מטוהרים DNA גנומית, לדלל 1 μg של RNA בנפח כולל של 8 μL של מים מטופלים DEPC בצינור PCR. הוסף 1 μL של מאגר התגובה 10x ו-1 μL של DNase I (1 יחידה/μL) (טבלת חומרים) ו-דגירה עבור 15 דקות ב-RT. Add 1 μl של פתרון הפסקה (25 מ"מ edta) ו דגירה ב 70 ° c עבור 10 דקות.
    5. כדי ליצור cDNA, לשלב 10 μL של DNase טיפל ב-RNA עם 10 μL של היפוך 2x הפוך מיקס בסיס לערבב, המכיל את ההמרה הפוכה, התחל אקראית, 4 מ"מ dNTP ערבוב (1 מ"מ כל אחד של dATP, Dnase, Dnase, ו-dCTP), והפוך מודיית את התגובה בתוך באמצעות התוכנית המומלצת על ידי היצרן. לדלל cDNA עם מים ביחס 1:5.
    6. כדי להכין את התגובה של רביעיית ה-PCR, לשלב 5 μL של SYBR מאסטר ירוק בשילוב עם 0.5 μL של גנטי ספציפי קדימה והפוך התחל (מניות: 10 μM), בהתאמה, ו-2 μL של מים מטופלים DEPC לכל תגובה. התגובה של הפיפטה הזאת בבאר אחת של 96 לוחית-PCR של רביעיית היטב ומוסיפה 2 μL של cDNA מדולל. הגדר שלוש משכפל טכני עבור כל שכפול ביולוגי וכלול גן שירות כגון הHprt1או מערכת.
    7. הגבר את מוצר ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 50 ° c עבור 2 דקות (uracil-DNA גליסיקלז [UDG] הפעלה), 95 ° צ' עבור 2 דקות (כפול נעילת DNA פולימראז הפעלה), 40 מחזורים של 95 ° c עבור 15 s, 60 ° c, ו-72 ° c עבור 1 דקות.
    8. התוצאות של רביעיית ככמת-PCR באמצעות שיטת DDCt מנורמליזציה לגנים של משק בית , כגון הHprt1.
  4. הערכת היעילות על ידי בלוק מערבי
    1. זרעים 300,000 C2C12 תאים עמידים לpuromycin בצלחת 6 מטרים לניתוח כתמי אבן מערבית. לאחר 24 שעות, שינוי בינוני ל-DMEM ללא סרום, ליזום בידול (יום 0 של בידול).
    2. בזמן הרצוי נקודת (s), לאסוף 2 מ ל של סרום-בינוני ממוזג חינם בצינור 1.5 mL ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g ב RT כדי להסיר תאים מנותקים ופסולת תא.
      הערה: שלב זה נחוץ רק אם חלבונים של ECM או חלבונים מופרשים אחרים במדיום הממוזג נחקרים. אם חלבון העניין הוא מקומי בציטופלסמה או ממברנה מאוגד, משמת את בינונית תרבות התא ולהמשיך עם צעדים לפירוק התא (3.4.7 ל3.4.12). פירוק התא יש לבצע במקביל המשקעים חלבון מן המדיום ממוזג ללא סרום כדי למזער השפלה פרוטחרדה והשלכות מכוונות אחרות של אחסון ממושך של שכבת התא.
    3. לאחר צנטריפוגה, העבר 1 מ ל של בינוני ממוזג ב חדש 1.5 mL התגובה שפופרת ו מזרז חלבונים על ידי הוספת 0.391 מ ל של תערובת של חומצה אצטית טריכלור (TCA) ו החומרים הבלתי יונית לניקוי/כביסה. בקצרה מערבולת את התערובת ואת הדגירה עבור 10 דקות על הקרח.
      הערה: הכינו את תערובת משקעים החלבון ישירות לפני השימוש על-ידי שילוב 0.252 mL של 55% TCA ו-0.139 mL של 1% מחומר הניקוי הבלתי-יוני/אבקת לפני mL של המדיום הממוזג ומערבולת בקצרה. . הפתרון הופך להיות מבולבל
      התראה: TCA הוא מאכל וחייב להיות מטופל כראוי.
    4. גלולה החלבונים זירז ב > 16000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
      התראה: הסופרנטנט מכיל את TCA ויש לאסוף אותו בנפרד ולהיפטר מחומר מסוכן.
    5. לשטוף את כדור החלבון 3x עם אצטון קר בקרח וצנטריפוגה בכל פעם ב > 16000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    6. האוויר יבש גלולה חלבון עבור 3 לשעה 4 דקות ב RT ו להמיס ב 50 μl של 1 x נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל לדוגמא (sds-PAGE) לדוגמה מאגר (50 mM טריס pH 6.8, 2% sds, 6% גליצרול, ו 0.004% ברומאופנול כחול, שיושלם עם 5% β-mercap מרתיחים את המדגם עבור 5 דקות ב 95 ° צ' ולהשתמש עבור בלוק המערבי כדי לזהות את חלבון היעד הרצוי באמצעות הליכים סטנדרטיים.
      התראה: β-Mercaptoethanol הוא דוקסי ורעיל ויש לטפל בתוך מכסה.
    7. עבור חלבונים תאיים ו קרום מאוגד, לשטוף את שכבת התא פעם אחת עם 2 מ ל של PBS.
    8. הוסף 1 מ ל של PBS ו להוציא תאים על ידי גירוד אותם היטב באמצעות מגרד התא. לאסוף תאים בצינור התגובה 1.5 mL ו צנטריפוגה ב 3,420 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c. לשטוף את הגלולה תא 3x עם 1 mL של PBS ו צנטריפוגה ב 3,420 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c בכל פעם.
    9. כדי lyse את התאים, להשעות מחדש את הגלולה התא ב 0.2 mL של מאגר לליזה (20 mM טריס-HCl pH 7.5, 150 מ"מ היום, 1 מ"מ Na2edta, 1 מ"מ egta, 1% NP40, 1% נתרן deoxycholate, 2.5 mM פירופוספט נתרן, 1 mm β-glycerophosphate, ו 1 מ"מ מילימטר נתרן אורתודואט) שיושלם עם 1X edta ללא מעכב פרוטאז המעכבי מגיב ומודטה עבור 30 דקות על הקרח.
    10. Ultrasonicate עבור 15 s על הקרח עם הגדרת פלט כוח של 10 בתדר הפעלה של 23 kHz.
    11. הסרת פסולת תא על ידי צנטריפוגה ב 13,680 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. לאסוף supernatant בצינור חדש 1.5 mL התגובה ולקבוע את ריכוז החלבון באמצעות שיטת ברדפורד מסחרי או כל שיטה מתאימה אחרת.
    12. עבור כל מדגם, לשלב 100 μg של חלבון עם 5x SDS-מאגר לדוגמה של העמוד בנפח כולל של 60 μL ו לרתיחה עבור 5 דקות ב 95 ° c. לנתח דגימות על ידי הליכים מערביים סטנדרטיים לנוכחות חלבון היעד הרצוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחר של C2C12 עמיד בpuromycin ניתן להשיג ב-10-14 יום לאחר הסרת החצייה עקב חיסול יעיל של לא עמידים, כלומר, תאים בלתי מפוגברים (איור 1B). בדרך כלל, יותר מ-80% מהתאים מתנתק ממנה של תרבות התא ותאים אלה מוסרים במהלך תחזוקת תאים שגרתית. Puromycin עמידים C2C12 תאים המבטאים את השליטה (מקושקשות) מרין לשמור על צורת ציר הצורה, המבנה התאי מוארך בצפיפות התא נמוך ואת היכולת להבדיל לתוך מיותצינורות. C2C12 בידול על הנסיגה סרום יכול להיות מפוקח על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר על ידי כתמים חיסוני ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקול עבור הנוק יציב של חלבונים ECM ב C2C12 myoblasts חזיק ולניתוח פנוטימית של הבידול של C2C12 myoblasts חזיק לתוך מיוכי. מספר גורמים קובעים את תוצאת הניסוי וצריכים להיחשב בזהירות. שמירה על תאים C2C12 בשלב מתרבים הוא צעד קריטי כדי לשמור את התאים C2C12 במצב הקודמי במחוז myoblast. שמירה על היכולת של תאים C2C12 כדי להבדיל בעקביות לתוך מיופופרות תלוי i) מספר המעבר של התאים, ii) צפיפות התאים התרבותיים במהלך תחזוקה שגרתית, ו iii) זמינות מזינים, הדורשת חידוש מלאי תכוף ורגיל של תרבות התא בינונית

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד. ד. נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (המכון הלאומי לדלקת פרקים והשלד ומחלות עור, niams, גרנט מספר AR070748) ומימון זרעים מלני & פיטר W. מיי המחלקה לאורטופדיה, icahn הספר לרפואה ב הר סיני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוןפישר כימיקל191784
אגרפישר ביוריאגנטיםBP1423
אמפיציליןפישר ביוריאגנטיםBP1760-5
מונה תאים אוטומטי Countesse IIInvitrogenA27977
ברדפורד ריאגנטתרמו מדעיP4205987
תאי C2C12 ATCCCRL-1772
שקופיות קאמריותInvitrogenC10283
כלורופורםפישרכימי 183172
DMEMGIBCO11965-092
DMSOפישר ביוריאגנטיםBP231-100
DNase I (דרגת הגברה)Invitrogen18068015
סרום בקר עובריVWR97068-085
GAPDHEMD MilliporeMAB374
גליציןVWR מדעי החיים19C2656013
נוגדן משני נגד עכבר עז (IRDYE 800CW)Li-CorC90130-02
נוגדן משני נגד עכבר עז (רודמין-אדום)Jackson Immune Research133389
HClFisher ChemicalA144S
חממה (שייקר)תאגיד המדע דנוויל1704N205BC105
מרקפטואתנולאמרסקו, VWR מדעי החיים2707C122
ערכת מיצוי פלסמיד MidiprepQiagen12643
מיוזין 4 (שרשרת כבדה מיוזין)Invitrogen14-6503-82
הרכבה בינוניתInvitrogen2086310
NaClVWR מדעי החיים241
חומר פעילי שטח/דטרגנט לא יונייםVWR מדעי החיים18D1856500
פרפורמלדהידMP199983
PBSפישר ביוריאגנטיםBP399-4
PEIPolysciences23966-1
אנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיציןGIBCO15140-122
PetridishCorning353003
צינורות פוליפרופילןFisherbrand149569C
מעכב פרוטאז טבליות קוקטיילRoche33576300
PuromycinFisher ScientificBP2956100
PCR (Real Time)Applied Biosystems4359284
Reaction צינורותEppendorf22364111
Reverse Transcription Master MixApplied Biosystems4368814
RIPA bufferThermo ScientificTK274910
sh control plasmidSigma-Aldrich07201820MN
sh 3086 פלסמידSigma-AldrichTRCN0000092578
sh 972 פלסמידSigma-Aldrich
sh 1977 ספקטרופוטומטר TRCN0000092582סיגמא-אולדריץ'
(Nanodrop)Thermo ScientificNanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master MixApplied Biosystems743566
חומצה טריכלורואצטיתAcros Organics30145369
טריזול ריאגנטאמביון
טריפאן כחולGIBCO15250-061
טריפטוןפישר ביוריאגנטיםBP1421
טריפסין EDTA 0.25%Gibco-Life Technology Corporation2085459
מים (מטופלים ב-DEPC וללא נוקלאז)פישר ביוריאגנטים186163
מכשיר ספיגה מערביBioradMini Protean Tetra Cell
תמצית שמריםפישר ביוריאגנטיםBP1422
TRCN0000092579פלסמיד 254707

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248(2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298(2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11(2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C2C12 MyoblastsshRNA KnockdownExtracellular Matrix ProteinsPuromycin SelectionCell DifferentiationWestern Blot AnalysisMyosin Heavy ChainSerum Free DMEMBright Field MicroscopyGene Expression Analysis

מאמרים קשורים