הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

המסה ספקטרומטר מודרמטריה מונחה הגנום ככלי לחשוף מוצרים טבעיים הרומן

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60825

⸱

12 במרץ 2020

 ,  ,  , 
1Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, University of Campinas (UNICAMP), 2Center for Natural and Human Sciences, Federal University of ABC (UFABC)

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול הכרייה ההמוני-מונחה הגנום מבוסס ומתואר כאן. הוא מבוסס על מידע רצף הגנום ו-LC-MS/MS ניתוח ומטרתו להקל על זיהוי של מולקולות מחיידקים מורכבים ותמציות צמחים.

תקציר

המרחב הכימי המכוסה על-ידי מוצרים טבעיים הוא עצום ובלתי מוכר באופן נרחב. לכן, מתודולוגיות נוחות לביצוע הערכה נרחבת של התפקודים שלהם בטבע והטבות אנושיות פוטנציאליות (לדוגמה, עבור יישומים של גילוי סמים), רצוי. פרוטוקול זה מתאר את השילוב של כריית הגנום (GM) ורשת מולקולרית (MN), שתי גישות עכשוויות התואמות גנים מקודד אשכולות ביאורים כל רצף הגנום עם חתימות מבנה כימי מתמציות מטבולית גולמי. זהו הצעד הראשון לקראת גילוי של ישויות טבעיות חדשות. מושגים אלה, כאשר מיושם יחד, מוגדרים כאן כריית הגנום MS-מונחה. בשיטה זו, הרכיבים העיקריים מיועדים קודם לכן (באמצעות MN), ומועמדים חדשים הקשורים באופן מבחינה מבנית קשורים ביאורים רצף הגנום (באמצעות GM). שילוב GM ו-MN היא אסטרטגיה רווחית כדי למקד מולקולה חדשה שדרות או לקצור פרופילים מטבוליים כדי לזהות אנלוגיות מן התרכובות ידוע כבר.

מבוא

חקירת חילוף החומרים המשני מורכבת לעתים קרובות מסינון תמציות גולמי לפעילות ביולוגית מסוימת ולאחריה טיהור, זיהוי ואפיון של המרכיבים השייכים לשברים פעילים. תהליך זה הוכיח כיעיל, ומקדם את הבידוד של מספר ישויות כימיות. עם זאת, כיום זה נראה בלתי אפשרי, בעיקר בשל שיעור גבוה של גילוי מחדש. כמו תעשיית התרופות מהפכה ללא ידיעת תפקידים ופונקציות של מטבוליטים מיוחדים, הזיהוי שלהם בוצע בתנאי מעבדה שלא מייצגים במדויק את הטבע1. כיום, יש הבנה טובה יותר של השפעות האיתות הטבעי, הפרשה, ואת הנוכחות של רוב היעדים בריכוזים נמוכים באופן בלתי סביר. בנוסף, התקנת התהליך תסייע לקהילה האקדמית ולתעשייה הפרמצבטית לנצל את הידע הזה. זה יהיה גם ליהנות מחקר הכרוך בבידוד ישיר של מטבוליטים הקשורים אשכולות גנים ביולוגיים שקטים (BGCs)2.

בהקשר זה, ההתקדמות ברצף גנומית יש עניין מחודש בהקרנה מיקרואורגניזם מטבוליטים. זה בגלל ניתוח מידע גנומי של אשכולות ביולוגיים חשף יכול לחשוף גנים קידוד תרכובות הרומן לא נצפתה או מופק בתנאי מעבדה. פרויקטים רבים של הגנום מחיידקים או טיוטות זמינים היום, ואת המספר גדל מדי שנה, מתן סיכויים מסיבי לגילוי מולקולות אקטיביים הרומן דרך כריית3הגנום 3,4.

האטלס של ביוסינתטי אשכולות גנים הוא האוסף הנוכחי הגדול ביותר של כבוש באופן אוטומטי אשכולות גנים כרכיב של פלטפורמת חיידקים משולבים Genomes של הגנום משותף המכון (JGI IMG-ABC)2. לאחרונה, את המידע המינימלי עבור אשכולות גנים Biosynthetic (MIBiG) היוזמה לקדם את הביאור הידני של BGCs, מתן התייחסות באופן מאוד משמעותי לערכת נתונים5. כיום, שפע של כלים זמינים כדי לאפשר כרייה חישובית של נתונים גנטיים ואת הקשר שלהם הידוע מטבוליטים משני. אסטרטגיות שונות פותחו גם כדי גישה מוצרים טבעיים אקטיביים החדש (כלומר, ביטוי הטרוולוגי, מחיקת גנים היעד, באופן מתורבת החוקה, רצף גנומית, איזוטופ מונחה ההקרנה [genomisotopic גישה], מניפולציה של ורגולטורים מקומיים וגלובליים, התנגדות מבוסס היעד הכרייה, תרבות הכרייה עצמאית, ו, לאחרונה, MS-מונחה/קוד גישות2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).

כריית הגנום כאסטרטגיה יחיד דורש מאמצים כדי להוסיף קבוצה אחת או קטנה של מולקולות; לפיכך, הפערים בתהליך נותרים, בהם תרכובות חדשות מעדיפות לבידוד ומבנה. בעיקרון, גישות אלה מתמקדות רק מסלול ביו-סינתטי אחד לכל ניסוי, ובכך התוצאה היא שיעור גילוי איטי. במובן זה, שימוש ב-GM יחד עם גישה לרשת מולקולרית מייצג מקדמה חשובה עבור מחקר המוצר הטבעי14,15.

רב-תכליתיות, דיוק, ורגישות גבוהה של הספקטרומטר כרומטוגרפיה נוזלי (LC-MS) להפוך אותו שיטה טובה לזיהוי מורכב. כיום, מספר פלטפורמות השקיעו אלגוריתמים וחבילות תוכנה עבור טבולומיקס ממוקדות16,17,18,19,20. הליבה של תוכניות אלה כוללת זיהוי תכונות (שיא איסוף)21 ויישור שיא, אשר מאפשר התאמה של תכונות זהות על גבי קבוצה של דגימות וחיפוש דפוסים. MS מבוססי דפוס אלגוריתמים22, 23 להשוות23 דפוסי פיצול אופייני ולהתאים MS2 קווי דמיון יצירת משפחות מולקולריות שיתוף תכונות מבניות. תכונות אלה יכולים להיות מודגשים ומקובצים באשכולות, הענקת היכולת לגלות במהירות מולקולות ידועות ובלתי ידועות מתוך תמצית ביולוגית מורכבת על ידי זוגשני MS,24,25. לכן, במקביל MS היא שיטה רב-תכליתית כדי לצבור מידע מבני מספר כימוסוגים הכלולים בכמות גדולה של נתונים בו זמנית.

האלגוריתם הגלובלי של מוצרים טבעיים (GNPS)26 משתמש בעוצמה המנורמלת של יוני השבר כדי לבנות וקטורים רב-ממדיים, שבהם ההשוואה משולה באמצעות פונקציית קוסינוס. הקשר בין יוני הורים שונים מותווים בייצוג בדיאגרמה, בו כל פיצול מוגדר כצומת (עיגולים), והשוליים החוזרים של כל צומת מוגדרים על-ידי קצה (קווים). ההדמיה הגלובלית של מולקולות ממקור אחד מוגדרת כרשת מולקולרית. מולקולות מתבשמות שרסיס באופן ייחודי יוצרות את האשכול או קבוצת הכוכבים הספציפיים שלהם, ואילו מולקולות קשורות מצרר יחד. סוגי כימוא של האשכולות מאפשר חיבור היפותטי של תכונות מבניות דומות למקורות הביוסינתטיים שלהם.

שילוב הן כימוסוג-אל-גנוטיפ וגישות גנוטיפ-אל-כימוסוג היא רבת עוצמה בעת יצירת קישורים בביואינפורמטיקה בין BGCs ומוצרים קטנים שלהם מולקולה27. לכן, MS-מונחה הגנום הכרייה היא שיטה מהירה והאסטרטגיה הנמוכה צורכת חומר, והוא מסייע בגשר יוני הורים מסלולים biosynthetic שנחשף על ידי WGS של אחד או יותר זנים תחת מגוון תנאים סביבתיים מטבולית.

זרימת העבודה של פרוטוקול זה (איור 1) כוללת האכלה של נתוני wgs לתוך פלטפורמת ביאור לאשכול גנים ביוסינתטיים כגון antismash28,29,30. זה עוזר להעריך את מגוון תרכובות ומעמד של תרכובות מקודד על ידי הגנום. אסטרטגיה כדי למקד את האשכולות גנים biosynthetic קידוד ישות כימית של עניין חייב להיות מאומץ, ותמציות התרבות מתוך זן סוג פראי ו/או זן הטרוולוגי המכיל את bgc ניתן לנתח כדי ליצור יונים מקובצים בהתבסס על קווי דמיון באמצעות gnps26,31. כתוצאה מכך, ניתן לזהות מולקולות חדשות המשייכים למוקד ה-BGC המיועד ואינן זמינות במסד הנתונים (בעיקר מקבילים לא ידועים, המיוצרים לעתים בפתיתים נמוכים). זה רלוונטי לשקול כי משתמשים יכולים לתרום פלטפורמות אלה וכי הזמינות של ביואינפורמטיקה ו-MS/MS נתונים גדל במהירות, נהיגה לפיתוח קבוע ושדרוג של כלים חישוביים יעילים ואלגוריתמים כדי להנחות התקשרויות יעילות של תמציות מורכבות עם מולקולות.

figure-introduction-1
איור 1: מבט כולל על זרימת העבודה כולה. מוצג הוא איור של שלבי ביוטכנולוגיה, שיבוט, והתקשורת המולקולרית מעורבים גישה מונחה הגנום MS-מודרך כדי לזהות מטבוליטים חדשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מהירה ויעילה כדי לשלב את כריית הגנום ואת הרשת המולקולרית כנקודת התחלה של צינור גילוי המוצר הטבעי. למרות יישומים רבים מסוגלים להמחיש את הרכב ומחדש של מולקולות לזיהוי MS ברשת אחת, מספר מאומצים כאן כדי להמחיש באופן מבנית מולקולות באשכולות דומים. באמצעות אסטרטגיה זו, מוצרים cyclodepsipeptide הרומן נצפתה בתמציות מטבולית של Streptomyces SP. CBMAI 2042 מזוהים בהצלחה. מודרך על ידי כריית הגנום, כל האשכולות גנים biosynthetic כל הקידוד עבור valinomycins הוא מוכר ומשוכפל לתוך זן המפיק Streptomyces co olor M1146. בסופו של דבר, בעקבות רשת מולקולרית המבוסס על תבנית MS, המולקולות שזוהו על ידי MS הם בקורלציה עם BGCs אחראי על biogenesis32שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. כריית הגנום לאשכולות גנים ביוסינתטיים

  1. לבצע רצף הגנום כולו (WGS) כצעד הראשון בחירת אשכול גנים biosynthetic (BCG) עבור כריית הגנום MS-מונחה. את הטיוטה של הגנום כולו של המתח של עניין (חיידקים) ניתן להשיג על ידי טכנולוגיית המאייר MiSeq באמצעות הבאים עם DNA באיכות גבוהה גנומית: רובה TruSeq PCR-הכנה ספריה ללא מערכת הכנה Nextera הזוג בספרייה33.
    הערה: לאחר רצפי הרצף, ספריית רובה המאיר וספריית הצמד מוארות המוארים ניתן לשלב באמצעות תוכנית האסמבלר של//ngs.csr.uky.edu/Newbler (רוש, 454) (שנמצאו ב-< https://www.softberry.com/berry.phtml >) ומוערת באמצעות צינור המבוסס על FgeneSB (שנמצא ב< http: בדרך כלל? נושא = fgenesb_annotator & קבוצה = עזרה & תת קבוצות = צינורות >), כמתואר בעבר33. מיקרוביולוגיה הודעות משאב (MRA) הוא יומן גישה פתוח לחלוטין עם מאמרים המפרסם את הזמינות של כל משאב מיקרוביולוגי שהופקדו במאגר זמין (נמצא ב< https://mra.asm.org >). מועמד חלבון קידוד הגנים מזוהים באמצעות הביאור שרת RAST34, ואת רובה הגנום כולו (wgs) הפרויקט מופקד בבית DDBJ/ENA/genbank (נמצא ב < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/>) וזהב (נמצאו ב< https://gold.jgi.doe.gov >) רצף מסדי נתונים.
  2. כדי להשיג במידע סיליקו על מטבוליזם המשני אשכולות גנים ביאורים מתוך הגנום רצף מלאה, לשלוח את קובץ הרצף (GenBank/EMBL או בפורמט FASTA) לפלטפורמה antiSMASH (נמצאו ב < https://antismash.secondarymetabolites.org/>).
  3. בחר את אשכול הגן המעניין מנתוני פלט (איור 2) בהתבסס על האשכול הידוע ביותר.
    הערה: ראשית, זה שגרתי לחקור גן-אחר-גנים ולנהל חיפושים בודדים (בטרם) כדי להעריך אילו פונקציות משויכות לקבוצות הגנים הביוסינטטיות הרצויות. הליך זה יכול גם לסייע לקבוע אילו BGC עשוי להיות משויך לייצור של מתחם רצוי, גם אם הוא אחוז נמוך. חיזוי antiSMASH רואה את כל הגנים בתוך אשכול כדי להפוך את הכיסוי אחוז, אשר יכול לייצג אחוז נמוך כללי של דמיון עבור BGC מכוון. עם זאת, בעת ניתוח גן-אחר-גנים, ניתן להשיג מידע מדויק יותר באמצעות האשכול הידוע ביותר. שנית, antiSMASH יש שתי אפשרויות למקד את החיפוש: 1) הקפדנות זיהוי: מידת הקפדנות שבה אשכול הגן הביוסינתטי חייב להיות נחשב להיט. עבור אפשרות זו, על המשתמש להשתמש בפרמטרים הבאים: a) הקפדניים: מזהה אשכולות מוגדרים היטב המכילים את כל האזורים הנדרשים, בידוד שגיאות לגבי מידע גנטי; b) רגוע: מזהה אשכולות חלקיים חסר אזור פונקציונלי אחד או יותר, אשר עובד גם עבור זיהוי התכונה קפדנית; או c) רופף: מזהה אשכולות ואשכולות מוגדרים היטב, כי כנראה להתאים מטבוליטים ראשוניים, אשר יכול להוביל למראה של תוצאות חיוביות שגויות או מוגדר גרוע BGCs. האפשרות השנייה היא 2) תכונות נוספות: סוג המידע שעל הפלטפורמה לחפש ולהציג בפלט. באופן כללי, שתי אפשרויות אלה יכולות לחסוך זמן לאחר הניבוי. עם זאת, העבודה antiSMASH דורש פרק זמן ארוך יותר.

figure-protocol-1
איור 2: פלט מפלטפורמה antiSMASH. חילוף חומרים משני בניתוח סיליקו מתוך ביאור רצף הגנום כולו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מבוסס על מידע רצף ה-DNA של BGC, עיצוב התחל (20-25 nt) החוצה את אשכול הגנים עבור ESAC (E. coli/Streptomyces כרומוזום מלאכותי) הספרייה ההקרנה.
    הערה: שיטות שונות35,36 ניתן להשתמש כדי ללכוד את מצרר הגנים הביוסינתטיים כולו מ-DNA. כאן, השיטה המשמשת היא בנייה של נציג esac הספרייה37,38 מ Streptomyces sp. cbmai 2042 המכיל שיבוטים עם שברי גודל ממוצע של ~ 95 kb.

2. ביטוי הטרוולוגי של אשכול גנים ביוסינתטי שלם מספריית ESAC

  1. הזיזו את הווקטור ESAC מ -e. coli DH10B ל -e. coli ET12567 על-ידיה32התלת-הורי.
    1. החיידק הקולי ET12567 (camr), TOPO10/PR9604 (carbr), DH10B/ESAC4H (aprr) ב 5 מ ל של לוריא-ברטני (LB) בינונית המכילה כלורמפנקול (25 μg/ml), carbenicillin (100 Μg/ml), ו אפרקמיסינ (50 Μg/ml).
    2. דגירה התרבות לילה ב 37 ° צ' ו 250 rpm.
    3. איחסן 500 μL של תרבות לילה ב 10 מ ל ליברות מדיום המכיל חצי ריכוז של אנטיביוטיקה.
    4. מודאת התרבות ב 37 ° c ו 250 rpm עד להגיע A600 של 0.4 – 0.6.
    5. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 2,200 x g עבור 5 דקות.
    6. שטוף את התאים פעמיים עם 20 מ"ל של מדיום LB.
    7. השהה מחדש את התאים ב-500 μL של מדיום LB.
    8. מערבבים 20 μL של כל זן בצינור מיקרוצנטריפוגה ו טפטוף לצלחת אגר עם ליברות בינונית חסר אנטיביוטיקה.
    9. מודאת הצלחות ב 37 ° c בלילה.
    10. פס את התאים הגדולים על צלחת מחדש LB אגר המכיל אנטיביוטיקה ו-דגירה ב 37 ° c לילה.

3. הStreptomyces/E. קולי הקוניוגציה

  1. כדי להשיג את האורגניזם רקומביננטי הטרוולוגי, לבצעה32 בין E. coli ET12567 המכיל את וקטור esac, עוזר פלמיד pR9604, ו Streptomyces co olor M1146 או אחר מארח נבחר זן39.
  2. יום 1: איחסן מושבות מבודדות של S. coM1146 olor ב 25 מ ל של tsby בינוני 250 ML erlenmeyer אייר בקבוקון מצויד inox-קפיץ ב 30 ° צ' ו 200 rpm עבור 48 h.
  3. יום 2/3: Inoculate/ESAC/pR9604 ב 5 מ ל ליברות בינונית המכילה כלורמפנסול (25 μg/mL), carbenicillin (100 μg/mL), ו-apramycin (50 μg/mL) לילה בשעה 37 ° c ו-250 סל ד.
  4. יום 3/4: הנחסן 500 μL של תרבות הלילה ב-10 מ ל של 2TY (בצינור משנת משנת 50 הגליל) המכיל ריכוזים של חצי עבודה של אנטיביוטיקה. דגירה ב 37 ° צ' ו 250 rpm עד להגיע A600 של 0.4 – 0.6.
  5. צנטריפוגה את התרבויות (ET12567/ESAC/pR9604 ו M1146) ב 2200 x g עבור 10 דקות.
  6. לשטוף את כדורי 2x ב 20 מ ל של בינוני 2X ו-השעיה מחדש ב-500 μL של 2X.
  7. Aliquot 200 μL של S. coM1146 הבולם ההשעיה ו לדלל ב 500 ΜL של 2ty (השעיה A).
  8. Aliquot 200 μL של השעיה A ו לדלל ב 500 μL של 2TY (ההשעיה B).
  9. Aliquot 200 μL של השעיה B ולדלל ב 500 μL של 2TY (ההשעיה C).
  10. Aliquot 200 μL של ET12567/ESAC/pR9604 ההשעיה ולערבב עם 200 μL של השעיה C.
  11. צלחת 150 μL של תערובת הקוניוגציה בצלחת של SFM אגר חסר אנטיביוטיקה.
  12. מודטה ב 30 ° c עבור 16 h.
  13. לכסות את הצלחות עם 1 מ ל של פתרון אנטיביוטי (על פי התנגדות פלמיד). לאחר ייבוש, הדגירה 30 ° צ' עבור 4 – 7 ימים.
    הערה: כאן, פתרון המכיל 1.0 mg/mL thiostrepton 0.5 mg/mL nalidixic חומצה היה מוכן.
  14. Exconjugants ברצף לוחות SFM אגר המכיל thiostrepton (50 mg/mL) ו nalidixic חומצה (25 מ"ג/mL). מודטה ב -30 ° c.
  15. פס הexconjugants על SFM אגר המכיל רק nalidixic חומצה.
  16. בצע ניתוח PCR עם מושבות מבודדות כדי לוודא שאשכול הגנים כולו הועבר למארח ה-S. coM1146 olor .

4. הזנים מטפחים

  1. כדי להשיג את פרופיל חילוף החומרים, האיחסן 1/100 של מקדם התרבות של הנבג באמצעי התסיסה המתאימים ובתנאי התרבות המתאימים.
  2. תרביות צנטריפוגה ב 2200 x g עבור 10 דקות.
  3. בצע את החילוץ בהתאם לכיתה של המתחם של הריבית40.

5. רכישת ספקטרום מסה והכנה לניתוח GNPS

  1. כדי לרכוש נתוני MS/MS, התוכנית מתאימה לשימוש באמצעות התוכנה לבקרת מידע ושיטות ספקטרומטר מסה. ניתן לנתח את הרזולוציה הגבוהה והנמוכה של ניתוח הספקטרומטר מסה התלוי בנתונים (לוד).
    הערה: בדרך כלל, פתרון 1 מ"ג/mL של דגימות גולמי מורכבות לחלץ הוא אידיאלי. דילול נחוצים לתמציות מורכבות פחות. יש לציין כי הרשת MS/MS היא התשתית המולקולרית הניתן לזיהוי תחת תנאי הספקטרומטרי מסה נתון.
  2. המר ספקטרום מסה לתבנית. mzXML באמצעות MSConvert מפרוטאובזארד (נמצא ב-< http://proteowizard.sourceforge.net/>). פרמטרי הקלט עבור ההמרה מומחשים באיור 3. נתונים מתוכנה של כמעט כל החברות תואמים.

figure-protocol-2
איור 3: שימוש ב-MsConvert להמרת קבצי MS לסיומת mzXML. הפרמטר הנכון עבור ניתוח GNPS מוצג. ההוראות הן כדלקמן: להוסיף את כל קבצי MS בתיבה 1 ולהוסיף את מסנן שיא לקטוף בתיבה 2; עבור מסנן זה, השתמש בספק האלגוריתם; לחץ על התחל ותהליכי ההמרה יעברו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. העלה את קבצי LC-MS/MS שהומרו למסד הנתונים של GNPS. קיימות שתי אפשרויות: שימוש בפרוטוקול העברת קבצים (FTP) או ישירות בדפדפן דרך הפלטפורמה המקוונת.
    הערה: מידע מפורט אודות אופן ההתקנה וההעברה של נתונים ל-GNPS זמין ב-< https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/fileupload/>.

6. ניתוח GNPS

  1. לאחר יצירת חשבון ב-GNPS (שנמצא ב-< https://gnps.ucsd.edu/>), היכנס לחשבון שנוצר בחר באפשרות ' צור רשת מולקולרית'. הוסף כותרת עבודה.
  2. אפשרויות בסיסיות: בחר בקבצי mzXML כדי לבצע את הרשת המולקולרית. ניתן לארגן אותם לשישה קבוצות. בחר את הספריות עבור השגרה הdereplication (איור 4).
    הערה: קבוצות אלה אינן מפריעות לבניית רשת מולקולרית. מידע זה ישמש רק עבור הייצוג הגרפי.

figure-protocol-3
איור 4: שימוש בפלטפורמת GNPS מקוונת לביצוע ניתוח רשת מולקולרית. בחירת קבצי mzXML נעשית על-ידי לחיצה בתיבה 1. בתיבת הדו פתיחה, ניתן לבחור את הקבצים מהתיקיה האישית (תיבת 2) או להעלות אותם בכרטיסיה השניה באמצעות הטעינה של קובץ גרור ושחרר (פחות מ-20 MB). ניתן לקבץ את הקבצים לשישה קבוצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בחר את העמידות הבין-מקודמות וסובלנות המסה של יון הקטע של 0.02 Da ו 0.05 Da, בהתאמה.
    הערה: ל-GNPS יש סוגים שונים של קפדנות זמינה בהתבסס על 1) עד כמה מדויקים הנתונים של MS/MS ו-2) עד כמה השיוך חייב להיות מדויק. אפשרויות בסיסיות: בתיקיה זו, ניתן להגדיר את עמידות המוני יון הקודמה ועמידות בפני המוני יונים. פרמטרים אלה משמשים כמדריך כדי לקבוע עד כמה מדויק יון הקודיון והקטע חייב להיות. טולרנסים המסה שנבחרה תלויה ברזולוציה ובדיוק של ספקטרומטר המסה הנמצא בשימוש.
  2. אפשרויות רשת מתקדמות: בחר את הפרמטרים לפי איור 5. פרמטרים אלה משפיעים ישירות על גודל וטופס של אשכול הרשת. פרמטר נוסף במקטע הכרטיסיות הנותרות מיועד למשתמשים מתקדמים; לפיכך, השאר את ערכי ברירת המחדל.
    הערה: ניתן לקרוא פרמטרים מתקדמים במסמכי GNPS (שנמצאו ב-< https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/>).

figure-protocol-4
איור 5: שימוש ב-GNPS לביצוע ניתוח רשת מולקולרי (אפשרויות מתקדמות). מינימום שניים Cos ישפיע ישירות על גודל האשכולות, כאשר ערכים גבוהים יגרמו לשילוב תרכובות הקשורות באופן מקרוב וערכים נמוכים בשילוב תרכובות הקשורות לריחוק. יש להימנע משימוש בערכים נמוכים מדי. יוני חלקים מינימלי התואמים מייצגים את מספר השברים המשותפים בין שני ספקטרום פיצול שיקושר ברשת. יחד, שני הפרמטרים מדריך את תבנית הרשת; הערכים הנמוכים יותר מצרר תרכובות הקשורות רחוקים יותר ולהיפך. השימוש בערכים הנכונים יסייע רבות להסבר המורכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בחר כתובת דואר אלקטרוני כדי לקבל התראה כאשר העבודה מתבצעת ושלח את המשימה.

7. ניתוח תוצאות הגנפס

  1. היכנס ל-GNPS. בחר משימות > עבודה שפורסמה > לבצע כדי לפתוח את המשימה. דף אינטרנט ייפתח כמודגם באיור 6. כל התוצאות שהתקבלו מרשת מולקולרית יוצגו.
  2. בחר להציג משפחות ספקטרליות (בתצוגת רשת הדפדפן) כדי לראות את כל אשכולות הרשת (תיבה אדומה, איור 6).

figure-protocol-5
איור 6: שימוש ב-GNPS להמחיש תוצאות רשת מולקולרית. כל האשכולות הקשורים ניתן לראות משפחות ספקטרליות (תיבת אדום). כדי להמחיש רק את הכניסות לספרייה, יש לבחור באפשרות ' הצג את כל הכניסות לספרייה ' (התיבה הכחולה). לייצוג גרפי טוב יותר של תוצאות רשת מולקולרית, "התצוגה המקדימה ציטוscape ישיר" (התיבה הצהובה) יש להוריד, ואת הגירסה העדכנית ביותר של ציטוסקייפ יש להשתמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. רשימה תוצג עם כל אשכולות הרשתות המולקולריים שנוצרו. אם החיפוש בספרייה נבחר כדי ליצור את הממצאים, זיהוי מולקולות סופי יוצג ב-AllIDs. בחר הצג כדי לדמיין אותם.
    הערה: מנתח הנתונים יכול להיות מונע עבור תוצאות אחרות (כלומר, כריית הגנום, assays ביולוגי, ספריה מולקולות הספרייה, וכו ').
  2. כדי לנתח את אשכול הרשת המולקולרית, בחר באפשרות ' דמיין רשת'.
    הערה: כל אשכול מורכב מצמתים (עיגולים) וקצוות, המייצגים מולקולות ודמיון מולקולרי, בהתאמה. מולקולות Dereplicated יסומנו כצומת כחול באתר התצוגה המקוונת של הדפדפן.
  3. בתיבה תוויות צומת, בחר מסת אב (תיבה אדומה, איור 7).
  4. בתיבה תוויות קצה, בחר קוסינוס או deltamz כדי להתבונן בדמיון בין הצומת או ההפרש ההמוני בין צמתים, בהתאמה (תיבה צהובה, איור 7).
  5. במקרה של ניתוח מרובה קבוצות, לחץ על צייר פשטידות בתיבת צביעה הצומת כדי לראות את התדר שבו כל הצומת מופיע בכל קבוצה (התיבה הכחולה, איור 7).
    הערה: אפשרויות אחרות אפשריות, אך אלה שהוצעו לעיל הן מיטביות להוספת צמתי אשכולות ולפירוק המבנים שלהם.

figure-protocol-6
איור 7: שימוש ב-GNPS להמחיש תוצאות אשכול מולקולרי. לאחר פתיחת האשכולות המולקולריים לצורך הדמיית נתונים טובה יותר, יש לבחור את הפריטים הבאים: "מסת אב" כתוויות צומת (תיבה אדומה); "DeltaMZ" כתוויות קצה (תיבה צהובה); ו "לצייר פשטידות" כמו צביעה הצומת (תיבת כחול). נווט באשכול המולקולרי ונסה להוסיף הערות לכל הצמתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. כדי להציג את כל הכניסות לספריה, בחר באפשרות הצג את כל הכניסות לספריה (תיבה כחולה, איור 7).
    הערה: גם, MNW ניתן להוריד ב "ישירה ציטוקסקייפ תצוגה מקדימה/להוריד" (התיבה הצהובה, איור 7), ואת הקובץ ניתן לפתוח בפלטפורמת ציטוקסקייפ (נמצא ב < https:/mlats.pamnmumen\>) לקבלת אפשרויות נוספות במבנה הגרפי.
  2. יש צורך באישור ידני של תרכובות dereplicated ומבנהו המבהרות של תרכובות קשורות. פתח את fragmentations ספקטרום ישירות בפלטפורמת GNPS או בקבצים גולמיים מקוריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול בוצע בהצלחה באמצעות שילוב של כריית הגנום, ביטוי הטרוולוגי, ו-MS-מונחה קוד גישות לגשת מולקולות מיוחדות valinomycin אנלוגיות מיוחדים. תהליך הגנום למולקולה עבור היעד, valinomycin (VLM), מיוצג באיור 8. Streptomyces SP. CBMAI 2042 הגנום הטיוטה נותחו ב סיליקו, ואשכול הגן של vlm זוהה אז והועבר לפונדקאי הטרוולוגי. הטרוולוגי וזנים מסוג פראי טיפחו בטרילקאט בתנאי תסיסה נאותים, למחיצות עם אצטט אתיל, ומרוכז לייצר את התמצית גולמי. מן המוצר, MS/MS נתונים נרכש כדי ליצור פרופיל מטבוליט MS ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היתרון החזק ביותר של פרוטוקול זה הוא היכולת שלה במהירות dereplicate פרופילים מטבוליים וגשר מידע גנומי עם נתוני MS כדי להבהיר את המבנים של מולקולות חדשות, במיוחד אנלוגיות מבניים2. מבוסס על מידע גנומי, כימוכ מוצרים טבעיים שונים ניתן לחקור, כגון polyketides (PK), פפטידים לא ריבוזומבית (NRP), ומוצרים טבעיים הגליסיטיים (התוצר הטבעי), כמו גם מוזר BGCs. Metabolomic הקרנת הראיות של פרופילי BGC הופעל מגוון כימי המיוצר על ידי לפיכך, BGC ניתן לשכפל לייצור ישיר של תרכובת חדשה או אנלוגית לא ידוע הקשורים BGC יד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

התמיכה הפיננסית עבור מחקר זה סופק על ידי הקרן סאו פאולו מחקר-FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 ו 2014/50249-8 ל-L. G. O; 2013/12598-8 ו 2015/01013-4 כדי R.S.; ו 2019/08853-9 ל-C. f. F. A). B. S. P, C.F.F.A., ו L.G.O. קיבל מלגות מן המועצה הלאומית לפיתוח טכנולוגי מדעי-CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, ו 313492/2017-4). L.G.O. הוא גם אסיר תודה על התמיכה המענק שסופקו על ידי התוכנית עבור נשים במדע (2008, הברזילאי Edition). כל המחברים מכירים בגלימות (תאום לשיפור אנשי ההשכלה הגבוהה) לתמיכה בתוכניות שלאחר הסיום בברזיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוניטרילטדיהAA1120-048HPLC כיתה
אגראוקסואידLP0011NA
אפרמיציןסיגמא אולדריץ'A2024NA
קרבניציליןסיגמא אולדריץ'C9231NA
צנטריפוגהאפנדורףNA5804
כלורמפניקולסיגמא אולדריץ'C3175NA
טור C18Agilent TechnologiesNAZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 מ"מ, 1.8 & מיקרו; M, מגבלת לחץ של 1200 בר P/N 757700-902
KanamycinSigma AldrichK1377NA
Manitol P.A.- A.C.S.SynthNA
NA מיקרוצנטריפוגהEppendorfNA5418
חומצה NalidixicSigma AldrichN4382
NA Phusion Flash High-Fidelity PCR Master MixThermoFisher ScientificF548SNA
Q-TOF ספקטרומטר מסהAgilent technologiesNA6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S.SynthNA
שייקר/אינקובטורMarconiMA420NA
נתרן כלוריSynthNAP. A. - ACS
תמצית סויהNANA
NA NA SucroseSynthNAP. A. - ACS
מחזורים תרמייםEppendorfNAMastercycler Nexus Gradient
ThiostreptonSigma AldrichT8902NA
טריפטוןאוקסואידLP0042NA
טריפטון מרק סויהאוקסואידCM0129NA
UPLCAgilent TechnologiesNA1290 Infinity LC System
תמצית שמריםאוקסואידLP0021NA

מקורות

  1. Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
  2. Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8), 988-1005 (2016).
  3. Zerikly, M., Challis, G. L. Strategies for the Discovery of New Natural Products by Genome Mining. ChemBioChem. 10 (4), 625-633 (2009).
  4. Gomez-Escribano, J. P., Bibb, M. J. Heterologous expression of natural product biosynthetic gene clusters in Streptomyces coelicolor: from genome mining to manipulation of biosynthetic pathways. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 41 (2), 425-431 (2014).
  5. Medema, M. H., et al. Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster. Nature Chemical Biology. 11 (9), 625-631 (2015).
  6. Lautru, S., Deeth, R. J., Bailey, L. M., Challis, G. L. Discovery of a new peptide natural product by Streptomyces coelicolor genome mining. Nature Chemical Biology. 1 (5), 265-269 (2005).
  7. Chiang, Y. -M., et al. Molecular Genetic Mining of the Aspergillus Secondary Metabolome: Discovery of the Emericellamide Biosynthetic Pathway. Chemistry & Biology. 15 (6), 527-532 (2008).
  8. Huang, T., et al. Identification and Characterization of the Pyridomycin Biosynthetic Gene Cluster of Streptomyces pyridomyceticus NRRL B-2517. Journal of Biological Chemistry. 286 (23), 20648-20657 (2011).
  9. Udwary, D. W., et al. Genome sequencing reveals complex secondary metabolome in the marine actinomycete Salinispora tropica. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10376-10381 (2007).
  10. Gross, H., et al. The Genomisotopic Approach: A Systematic Method to Isolate Products of Orphan Biosynthetic Gene Clusters. Chemistry & Biology. 14 (1), 53-63 (2007).
  11. Spohn, M., Wohlleben, W., Stegmann, E. Elucidation of the zinc-dependent regulation in Amycolatopsis japonicum enabled the identification of the ethylenediamine-disuccinate ([S,S ]-EDDS) genes. Environmental Microbiology. 18 (4), 1249-1263 (2016).
  12. Thaker, M. N., Waglechner, N., Wright, G. D. Antibiotic resistance-mediated isolation of scaffold-specific natural product producers. Nature Protocols. 9 (6), 1469-1479 (2014).
  13. Katz, M., Hover, B. M., Brady, S. F. Culture-independent discovery of natural products from soil metagenomes. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 43, 129-141 (2016).
  14. Quinn, R. A., et al. Molecular Networking as a Drug Discovery, Drug Metabolism, and Precision Medicine Strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (2), 143-154 (2017).
  15. Yang, J. Y., et al. Molecular Networking as a Dereplication Strategy. Journal of Natural Products. 76 (9), 1686-1699 (2013).
  16. Lommen, A. MetAlign: Interface-Driven, Versatile Metabolomics Tool for Hyphenated Full-Scan Mass Spectrometry Data Preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
  17. Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
  18. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395(2010).
  19. Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
  20. Kuhl, C., Tautenhahn, R., Böttcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
  21. Katajamaa, M., Orešič, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. Journal of Chromatography A. 1158, 318-328 (2007).
  22. Liu, W. -T., et al. Interpretation of Tandem Mass Spectra Obtained from Cyclic Nonribosomal Peptides. Analytical Chemistry. 81 (11), 4200-4209 (2009).
  23. Ng, J., et al. Dereplication and de novo sequencing of nonribosomal peptides. Nature Methods. 6 (8), 596-599 (2009).
  24. Liaw, C., et al. Vitroprocines, new antibiotics against Acinetobacter baumannii, discovered from marine Vibrio sp. QWI-06 using mass-spectrometry-based metabolomics approach. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  25. Kang, K. B., et al. Targeted Isolation of Neuroprotective Dicoumaroyl Neolignans and Lignans from Sageretia theezans Using in Silico Molecular Network Annotation Propagation-Based Dereplication. Journal of Natural Products. 81 (8), 1819-1828 (2018).
  26. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  27. Doroghazi, J. R., et al. A roadmap for natural product discovery based on large-scale genomics and metabolomics. Nature Chemical Biology. 10 (11), 963-968 (2014).
  28. Medema, M. H., et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acids Research. 39, 339-346 (2011).
  29. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43, 237-243 (2015).
  30. Blin, K., et al. antiSMASH 5.0: updates to the secondary metabolite genome mining pipeline. Nucleic Acids Research. 47, 81-87 (2019).
  31. Watrous, J., et al. Mass spectral molecular networking of living microbial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (26), 1743-1752 (2012).
  32. Paulo, B. S., Sigrist, R., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. New Cyclodepsipeptide Derivatives Revealed by Genome Mining and Molecular Networking. ChemistrySelect. 4 (27), 7785-7790 (2019).
  33. Gonzaga de Oliveira, L., Sigrist, R., Sachetto Paulo, B., Samborskyy, M. Whole-Genome Sequence of the Endophytic Streptomyces sp. Strain CBMAI 2042, Isolated from Citrus sinensis. Microbiology Resource Announcements. 8 (2), 1-2 (2019).
  34. Aziz, R. K., et al. The RAST Server: Rapid Annotations using Subsystems Technology. BMC Genomics. 9 (1), 75(2008).
  35. Nah, H. -J., Pyeon, H. -R., Kang, S. -H., Choi, S. -S., Kim, E. -S. Cloning and Heterologous Expression of a Large-sized Natural Product Biosynthetic Gene Cluster in Streptomyces Species. Frontiers in Microbiology. 8, 1-10 (2017).
  36. Zhang, J. J., Tang, X., Moore, B. S. Genetic platforms for heterologous expression of microbial natural products. Natural Product Reports. 36 (9), 1313-1332 (2019).
  37. Alduina, R., et al. Artificial chromosome libraries of Streptomyces coelicolor A3(2) and Planobispora rosea. FEMS Microbiology Letters. 218 (1), 181-186 (2003).
  38. Jones, A. C., et al. Phage P1-Derived Artificial Chromosomes Facilitate Heterologous Expression of the FK506 Gene Cluster. PLoS One. 8 (7), 69319(2013).
  39. Gomez-Escribano, J. P., Bibb, M. J. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology. 4 (2), 207-215 (2011).
  40. Cannell, R. J. P. Natural Products Isolation. , Humana Press. Totowa, NJ. (1998).
  41. Kersten, R. D., et al. A mass spectrometry-guided genome mining approach for natural product peptidogenomics. Nature Chemical Biology. 7 (11), 794-802 (2011).
  42. Kersten, R. D., et al. Glycogenomics as a mass spectrometry-guided genome-mining method for microbial glycosylated molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (47), 4407-4416 (2013).
  43. Liu, W., et al. MS/MS-based networking and peptidogenomics guided genome mining revealed the stenothricin gene cluster in Streptomyces roseosporus. The Journal of Antibiotics. 67 (1), Tokyo. 99-104 (2014).
  44. Duncan, K. R., et al. Molecular Networking and Pattern-Based Genome Mining Improves Discovery of Biosynthetic Gene Clusters and their Products from Salinispora Species. Chemistry & Biology. 22 (4), 460-471 (2015).
  45. Cao, L., et al. MetaMiner: A Scalable Peptidogenomics Approach for Discovery of Ribosomal Peptide Natural Products with Blind Modifications from Microbial Communities. Cell Systems. , (2019).
  46. Chen, L. -Y., Cui, H. -T., Su, C., Bai, F. -W., Zhao, X. -Q. Analysis of the complete genome sequence of a marine-derived strain Streptomyces sp. S063 CGMCC 14582 reveals its biosynthetic potential to produce novel anti-complement agents and peptides. PeerJ. 7 (1), 6122(2019).
  47. Kim Tiam, S., et al. Insights into the Diversity of Secondary Metabolites of Planktothrix Using a Biphasic Approach Combining Global Genomics and Metabolomics. Toxins. 11 (9), 498(2019).
  48. Özakin, S., Ince, E. Genome and metabolome mining of marine obligate Salinispora strains to discover new natural products. Turkish Journal of Biology. 43 (1), 28-36 (2019).
  49. Trivella, D. B. B., de Felicio, R. The Tripod for Bacterial Natural Product Discovery: Genome Mining, Silent Pathway Induction, and Mass Spectrometry-Based Molecular Networking. mSystems. 3 (2), 00160(2018).
  50. Maansson, M., et al. An Integrated Metabolomic and Genomic Mining Workflow To Uncover the Biosynthetic Potential of Bacteria. mSystems. 1 (3), 1-14 (2016).
  51. Blin, K., Kim, H. U., Medema, M. H., Weber, T. Recent development of antiSMASH and other computational approaches to mine secondary metabolite biosynthetic gene clusters. Briefings in Bioinformatics. 20 (4), 1103-1113 (2019).
  52. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS-NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
  53. Tatsuno, S., Arakawa, K., Kinashi, H. Analysis of Modular-iterative Mixed Biosynthesis of Lankacidin by Heterologous Expression and Gene Fusion. The Journal of Antibiotics. 60 (11), Tokyo. 700-708 (2007).
  54. Helfrich, E. J. N., Piel, J. Biosynthesis of polyketides by trans-AT polyketide synthases. Natural Product Reports. 33 (2), 231-316 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

רשתות מולקולריותרצף גנום מלאמקבצי גנים ביוסינתטייםביטוי הטרו-לוגיאנליזת LC-MS/MSמאגר הנתונים GNPSפענוח מבנה כימי
המסה ספקטרומטר מודרמטריה מונחה הגנום ככלי לחשוף מוצרים טבעיים הרומן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.