Method Article

יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יציבה, בידול יעיל מאוד עבור הדור של נוירונים האוהדים הסימפתטית של האדם בתאי גזע בעלי עוצמה גבוהה. מודל זה יעשה הנוירונים זמינים לשימוש במחקרים של הפרעות אוטונומיות מרובות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) הפכו כלי רב עצמה למידול מחלות ולחקר התפתחות עובריים אנושית בתחום החוץ. בעבר הצגנו פרוטוקול בידול לנגזרת של נוירונים אוטונומית עם אופי סימפטי שהוחל על חולים עם נוירופתיה אוטונומית. עם זאת, הפרוטוקול נבנה על החלפת סרום החוצה (KSR) ומאכיל מבוססי תנאי התרבות, ועל מנת להבטיח יעילות גבוהה בידול, מיון התא היה הכרחי. גורמים אלה גורמים לשונות גבוהה, עלות גבוהה והשתנות נמוכה. יתרה מזאת, תכונות סימפטיות בוגרות, כולל פעילות חשמלית, לא אומתו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב שבו תרבות PSC ובידול מתבצעים בתנאי תרבות המוגדרים ללא מאכיל וכימית. סמנים גנטיים מזהים את ציצה. העצבים העצבית מזוהים בידול נוסף לתוך הנוירונים הסימפתטית הפוסט מושגת לאחר 20 ימים ללא צורך מיון התא. הקלטה אלקטרופיסיולוגית מראה. את זהות הנוירונים התפקודית הירי זוהה מן הנוירונים שלנו הבדיל יכול להיות משופר על ידי ניקוטין מדוכאים על ידי היריב קולטן אדרפרוכולינרגיות propranolol. ושלתי עצבי ביניים אוהדים בפרוטוקול זה ניתן לשמור כספרואידים עצביים עד 2 שבועות, אשר מאפשר הרחבה של התרבויות. בסכום, הפרוטוקול המעודכן שלנו הבחנה הקוד מראה יעילות גבוהה בידול, מיותר להתגלות, גמישות יותר, והתבגרות עצבית טובה יותר לעומת הגירסה הקודמת. פרוטוקול זה יספק לחוקרים את התאים הנחוצים לחקר הפרעות אנושיות המשפיעות על מערכת העצבים האוטונומית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנוירונים הסימפוניים הסימפתטית (סימטריות) שייכים למערכת העצבים האוטונומית (ANS) ויש להם תפקידים חשובים מרובים בתגובה ויסות הומאוסטזיס של הגוף ללא תלות של התודעה. לדוגמה, המתח מעורר סימטריות ומעורר את תגובת הקרב או הטיסה שמובילה לעלייה בקצב הלב, לחץ דם והזעה. סימטריות מושפעים בהפרעות אנושיות מרובות בשל גנטיקה, רעילות/פציעה, או כמו לוויה למחלות אחרות. דוגמה של נוירופתיה גנטית היא הפרעת ילדות Dysautonomia (FD), שם חוסר התקנה חמורה של סימטריות גורמת משבר dysautonomia, ברור על ידי הזעה, blotching של העור, הקאות התקפות, יתר לחץ דם, וחרדה1. דוגמה של רעילות היא טיפול כימותרפיה, אשר דווחה יש תופעות לוואי רעילות על נוירונים אוטונומית2. ידוע כי הדבציה אוטונומית ו-hyper-אינבציה יכול להוביל, או ללוות, מחלות כגון מחלת פרקינסון או מחלת כליות יתר לחץ דם3,4. לפיכך, היכולת לערוך מחקר ולהבין את המנגנונים של הביולוגיה הסימטרית ופגמים בהקשר של מחלות, מועילים לחיפוש אחר טיפולים חדשניים ויעילים.

אנטומיה
מערכת העצבים ההיקפית מסתעף לחטיבות חושיות ואוטונומיות. עצבי הגוף של מערכת העצבים החושית אחראים לתחושת הכאב והמגע, ואילו ה-ANS אחראי לממסר מידע מכל האברים למוח. ה-ANS מחולק למערכת העצבים המעית, מinnervating במערכת העיכול, מערכת העצבים הפאראסימפתטית, החשובה להרפיה ומערכת העצבים הסימפתטית (SNS), החשובה להפעלה/לוויסות איברים. מערכת ההגירה מתאימה. למערכת דו-תא5 האקסון העצבי הסימפתטית מקדם בחוט השדרה הראשון בעמוד השידרה לגנגוליה הסימפתטית, שם ממוקמות הגופים הסלולאריים של תאי הדואר הנכנס. נוירונים אלה ולאחר מכן לשלוח התחזיות הארוכות כדי לinnervate את רקמות היעד של כל איבר בגוף. אותות ששודרו על ידי נוירונים טרום-הפרה הם cholinergic, ואילו הסימטרי הפוסט הם אדרלירגיות ובכך לבטא נוראדרנלין (NE) כמו מוליך עצבי הראשי שלהם. ישנם מספר חריגים בולטים של postganglionic, הנוירונים הסימפוניים כי הם cholinergic, כולל אלה innervating כלי הדם. הנוירונים באנגנגלייונים מביעים את אנזימי טירולך הידרוקסילז (TH), חומצה אמינית לחומצות אמינו (AAAD), דופמין β-הידרוקסילז (DBH), ומונואמין אוקסידאז (מאו-א), האחראים להפקת ולחילוף חומרים NE. יתר על כן, הם מבטאים את הטרנספורטי מיחזור מחזור ו/או קולטני α-אדרארדירגיות קולטן (ADRA2), β-אדרארדירגיות קולטן (ADR2B), נוראדרנלין טרנספורטר (NET1), ו-והמשלח מונואמין (VMAT1/2).

פיתוח
במהלך התפתחות מעובריים מופק הרכס העצבי (NC), אשר עולה בין הצינור העצבי והנחת העור העליון6, והוא יכול להבדיל לתוך שורה של תאים מרובים, כולל מלנוציטים, אוסטאופתית, adipocytes, גליה, נוירונים בידור, נוירונים חושים, ונוירונים אוטונומית7. התאים ציצה עצבית (NCCs ') הם תאים נודדים מאוד כי לנקוט מספר נתיבים דרך העובר. בשלב זה מוקדם של התפתחות NC, התאים לבטא את סמנים SNAIL1/2, FOXD3, ו SOX108,9,10,11. תוואי ההעברה יחד עם מיקום הציר שהם מאמצים קובע את תת-הסוג של NC שאליו הם יתפתחו. אלה תת-סוגי NC יכול להיות מכובד על ידי הביטוי הספציפי שלהם hox גנים: nccs הגולגולת לא לבטא גנים hox, אגל nccs ק express hox 1 – 5, טרונק nccs ק express hox 6-9, ו-nccs ' ו-n-לבטא hox 10 – 1112. ביניהם, NCCs טרונק מזוהים כמקור העיקרי של סימטריות. סימון מקדים מבטא את גורם התמלול MASH1/ASCL113, אשר מקדם את הביטוי של PHOX2B14 ו INSM115. משפחת טה של גורמי התמלול באה לידי ביטוי במהלך התפתחות אוהדת מאוחרת. GATA2 ו GATA3 מבוטאים באופן סימטרי, אשר בתורו מפעיל DBH16. התמלול גורם HAND2 חשוב גם לביטוי ותחזוקה של DBH ו-TH17.

HPSCs (למשל, עובריים והמושרה מושרה בתאי גזע) הם כלי רב עוצמה18 כדי תבניות התפתחותיות לכידה וליצור סימטריות כי ניתן לאחר מכן להיות מועסק עבור דוגמנות המחלה של הפרעות אנושיות שונות. כך, תוך יצירת סימטריות מ hPSCs, זה חיוני לעקוב אחר הנחיות התפתחותיות להעריך את הביטוי של סמנים המתאימים לאורך תהליך הבידול.

פרוטוקול סימטרי קודם
מספר קבוצות מחקר דיווחו בעבר על הדור של סימטריות מ hPSCs19,20,21. ההשוואה הישירה של הפרוטוקולים האלה אחד לשני ושלנו נבדקה לאחרונה22. בשנת2016,פרסמנו פרוטוקול בידול לדור הנוירונים האוטונומית עם תו סימטרי (איור 1a). פרוטוקול זה השתמש במדיום מבוסס KSR, ששימש הן בתחזוקת hPSCs מובחן ובידול התא. יתר על כן, hPSCs היו שמרו על העכבר מעובריים מתחלקים (ממזין MEF תאים). אנו המועסקים בפרוטוקול זה ו PSCs מחולים עם FD כדי לדגמן את ההפרעה23. בשנת 2019, תיארנו גרסה מפורטת יותר של הפרוטוקול הישן הזה24. לסיכום, הגורל העצבי המושרה על ידי עיכוב SMAD כפול25 לחסום tgf-β ו-BMP איתות ב 2 הימים הראשונים. הפעלת WNT באמצעות CHIR99021 ושלתי העצבית הקודמת להפוך לתאי NC. ביום 11, התאים היו ממוינים על ידי facs עבור CD49D+ או SOX10+ אוכלוסיות26,23, אשר הניב כ 40% NC הדור יעילות. לפיכך, היה צורך במיון כדי להבטיח את היעילות והטוהר לשלבים הבאים של בידול. ה-NCCs ' היו מתוחזקים ומוחזקים כספרואידים עם הטיפול המשולב של FGF2 ו-CHIR. לאחר 4 ימים, spheroids NC של תחזוקה היו מצופים וניתנה BDNF, GDNF, ו NGF לסיים את ההבשלה סימטרי. למרות הסימטריות הללו הביע סמנים הסימטרי החזקים כגון ASCL1, TH, dbh, ו PHOX2A, סמנים עבור סימטריות בוגרת יותר, כולל ביטוי של קולטן אצטילכולין ניקטימית (CHRNA3/CHRNB4) ו-שלפוחית טרנספורטר (VMAT1/2), היו נמוכים גם לאחר 70 ימים של בידול. גנים HOX בפרוטוקול זה לא נבדקו רשמית, ותכונות עצביות בוגרת, כולל פעילות אלקטרופיזיולוגית של התאים, לא אומתו.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב ליצירת סימטריות (איור 1B). HPSCs נשמרים בתנאים ללא מאכיל, ב vitronectin (VTN) מנות מצופות, באמצעות Essential 8 (E8) מדיה27. הנוסחה של מדיית הבידול השתנתה בכל שלב ובכך מגבירה את אחוז האוכלוסיה ב-NC28. את ההבשלה הסימטרי ניתן לעשות על CD49D+/Sox10+ מיון או ממוין אוכלוסייה ncc בצובר. שניהם מציגים רמות גבוהות של ביטוי סמן ביום 30. יתר על כן, הסימפנים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מגיבים להקלטה אלקטרופיזיולוגית ולטיפולים עם סימטריות activator ותרכובות מעכבי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: קו הכתב הH9 PHOX2B: GFP מסופק על ידי הו ואח '19. כמה התחל qpcr בשימוש בנייר זה התקבלו מטכנולוגיות origene, בעוד רצפים מעטים מתקבלים מן frith et אל.20,30.

1. הגדרת ציפוי הכלים, הכנת המדיה ותחזוקת hPSC

  1. ציפוי מכלים
    1. ציפוי ויטרואקטין (VTN)
      1. מניחים בבקבוקונים של VTN באמבטיה מים 37 ° c עד מלא הופכה, ואז לערבב ביסודיות.
      2. עבור צלחת פטרי 100 מ"מ, מערבבים 7 מ ל של מלוחים באגירה של 1 x פוספט (PBS) עם 0.5 mg/mL VTN, להוסיף פתרון VTN לצלחת, ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 h.
    2. ציפוי מטריצות ממברנה של מרתפים
      1. הפשרת מבחנות של מטריצת קרום המרתף (ראה טבלת חומרים) על הקרח ב -4 ° c בלילה.
      2. עבור אחד טוב של 6 צלחת הבאר, לערבב 2 מ ל/F12 עם 20 μL של מטריקס קרום 100x מטריצות, להוסיף מרתף ממברנה פתרון מטריקס לצלחת, לעטוף את התבשיל עם סרט פרפין, ולאחסן במיכל נקי ב 4 ° c לילה. עבוד במהירות האפשרית. ניתן לאחסן מנות מצופות ב -4 ° c עד 2 שבועות.
    3. פוליונילך (פו)/למינציה (LM)/fibronectin (FN) ציפוי
      1. ביום הראשון, עבור הבאר אחת של 24 צלחת הבאר, לערבב 15 μg/mL של PO עם 1 מ ל של 1x PBS, מודקת ב 37 ° c, 5% CO2 לילה. הפשרת הן LM ו-FN ב-20 ° c בלילה, והחנות ב -4 ° c עד שהיא הופפה במלואה.
      2. ביום השני, מטפי את הפתרון PO, לשטוף את הבארות 2x עם 1 x PBS, להוסיף 1 מ ל של 1x PBS המכיל 2 μg/mL של LM ו-2 μg/mL של FN ו-דגירה ב 37 ° צ' ב 5% CO2 לילה. בשלב זה הצלחת עם פתרון LM/FN ניתן לשמור בחממה במשך חודשים, כל עוד היא אינה מייבשת. הוסף עוד 1x PBS כדי למנוע את הצלחת מתייבש.
  2. הכנת מדיה
    1. להכין את Essential 8 בינוני (E8) על ידי היפליד בקבוק אחד של תוספת E8 ב 4 ° c בלילה. מערבבים את התוספת עם 500 mL של E8 בינוני ואנטיביוטיקה במידת הצורך.
      הערה: יש להשתמש בפתרון E8 עבודה בתוך שבועיים.
    2. להכין את ההקפאה hPSC בינוני על ידי ערבוב 90 Ml של E8 בינוני מלא עם 10 מ ל של dmso עבור נפח כולל של 100 ml. סינון מחטא.
    3. להכין את היום 0 ליום 1 בידול בינוני על ידי ערבוב 100 mL של החיוניות 6 (E6) בינונית עם 10 ΜM SB431542, 1 Ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021, ו 10 Μm Y27632 עבור נפח כולל של 100 mL.
    4. להכין את היום 2 עד יום 10 הבדלה בינונית על ידי ערבוב 100 ML של E6 בינונית עם 10 ΜM SB ו 0.75 ΜM CHIR99021 עבור נפח כולל של 100 mL.
    5. להכין את היום 10 עד יום 14 ספרואיד בינונית על ידי ערבוב מדיום נוירוסיס עם 2 מ ל של B27 (50x), 1 מ ל של N2 (100x), 2 מ"מ L גלוטמט, 3 ΜM CHIR99021, ו 10 Ng/mL FGF2 עבור נפח כולל של 100 mL.
    6. להכין את היום 14 עד יום 28 בינוני עבור תחזוקה לטווח ארוך ספרואיד על ידי הוספת 0.5 ΜM של רה טרי ליום 10 עד יום 14 בינונית ספרואיד עבור כל האכלה.
      הערה: יש לשמור תמיד RA ב-80 ° c.
    7. להכין את ההבשלה בינונית התבגרות על ידי ערבוב בינונית נוירוסיס עם 2 מ ל של B27 (50x), 1 מ ל של N2 (100x), 2 מ"מ L-גלוטמט, 25 Ng/ML gdnf, 25 Ng/ML BDNF, 25 Ng/ML ngf, 200 μm חומצה אסקורבית, ו 0.2 MM dbcamp עבור נפח 100 כולל הפתרון צריך להיות בשימוש בתוך 2 שבועות. לפני כל האכלה, להוסיף 0.125 μM טרי RA. פתרון זה משמש מיום 14 (אפשרות 1) או יום 28 (אפשרות 2).
    8. להכין את מאגר FACS על ידי ערבוב dmem עם 2% fbs, 2 מ"מ L-גלוטמט ו אנטיביוטיקה אם יש צורך בנפח כולל של 100 mL.
  3. תחזוקת hPSC
    1. הhPSCs והשמירה
      1. הכן אחד VTN מצופה 100 mm צלחת.
      2. כדי להפשיר בקבוקון של hPSCs ישירות מן החנקן הנוזלי, לשים את המבחנה לתוך מרחץ מים 37 ° c, בזהירות מניף את הצינור במים עד שהוא הופך. העבר את hPSCs המוסדר לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ ל של 1x PBS, ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
      3. השמט את הסופרנטאנט והוסף 1 מ ל E8 בינונית לשפופרת. פיפטה כמה פעמים כדי להשהות לחלוטין את הגלולה ולאחר מכן להוסיף עוד 9 מ ל של E8 בינונית כדי להגיע 10 mL סך הכל.
      4. מנושף את התמיסה של VTN ממנה 100 mm.
      5. העבר את hPSCs למנה 100 מ"מ, טלטל בעדינות (למעלה-למטה ושמאלה-ימינה, לא במעגלים) כדי לוודא שהתאים מופצים באופן שווה במנה
      6. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2.
      7. ביום שלמחרת, האכילו את כל המדיום ומזינים 10 מ ל של E8.
      8. האכילו בדרך זו כל יום במשך 3 – 4 ימים ולאחר מכן היכונו להתפצל.
    2. פיצול hPSCs
      הערה: hPSCs בנקודת הפיצול צריך להיות 80% – 90% שוטפת. יש להקפיד על מושבות גדולות עם קצוות חלקים ובהירים. עם זאת, יש להימנע ממגע בין כל מושבה (איור 2b, יום 0 ואיור 6b).
      1. הכינו מנות 100 מ"מ מצופות מצופי VTN לפי הצורך.
      2. מE8 ושוטפים את התבשיל שצריך לפצל 1x עם 1 x PBS.
      3. משף את ה-PBS 1 x ולהוסיף 4 מ ל של 0.25 M EDTA. מודטה עבור 2 דקות ב 37 ° c, 5% CO2.
        הערה: hPSCs יש לפצל/לציפוי מחדש כמושבות קטנות. אין לטפל ב-EDTA יותר מ-2 דקות כדי למנוע הפרדה לתאים בודדים. התאים צריכים להיות עדיין מחוברים למשטח הכלים לאחר הטיפול 2 דקות.
      4. לאחר מכן, לנתק את המושבות על ידי ליטוף בחוזקה 10 מ ל של E8 בינוני על משטח הצלחת, ולאסוף את כל המדיום ואת התאים בצינור 15 מ ל.
      5. עם hPSCs של 80%-90% שליטה, פיצול מושבות על ידי 1:15-1:20. לדוגמה, כדי לפצל hPSCs על-ידי 1:20 לתוך המנה 1 100 מ"מ, לקחת 500 μL של E8/hPSCs פתרון ולערבב עם 9.5 mL של מדיום E8 טריים.
      6. צלחת hPSCs ב VTN מצופה מאכלים 100 מ"מ.
        הערה: מומלץ להקים את היחס המפוצל האידאלי לכל חוקר ולקו התאים באופן עצמאי.
    3. הקפאת hPSCs
      1. עבור 1 100 מילימטר מנה של hPSCs כי הוא מוכן להתפצל, להכין שלושה קריודיש ו 3.5 mL של הקפאה בינונית.
        הערה: יש לשמור מדיה ומבחנות ב-4 ° צ' או בקרח עד לשימוש.
      2. מE8 ושוטפים את התבשיל 2x עם PBS 1x.
      3. משף 1 x PBS ולהוסיף 4 מ"ל של 0.25 M EDTA, מודטה עבור 2 דקות ב 37 ° c, ב 5% CO2.
        הערה: hPSCs צריך להיות קפוא כמו מושבות קטנות בזמן שהם היו לפצל. אין לטפל בתאים עם EDTA יותר מ-2 דקות כדי למנוע הפרדה לתאים בודדים. תאים צריכים להיות מחוברים עדיין על פני הצלחת לאחר 2 דקות הטיפול.
      4. משמת את EDTA, לנתק את המושבות על ידי ליטוף בחוזקה 10 מ ל של 1x PBS על פני השטח של המנה, ולאסוף את כל בינוני ותאים בצינור 50 mL.
      5. הוסף 20 מ ל של ה-PBS 1 x ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות כדי לשטוף את edta הנותרים.
      6. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב -3 מ ל של קיפאון בינוני.
      7. פזר hPSCs באופן שווה לשלושת הקריובקבוקונים, 1 מ ל כל אחד.
      8. חנות ב-80 ° c לילה בתיבת הקפאה מבוקרת או כריך קלקר כדי להבטיח ירידה בטמפרטורה איטית, ולאחר מכן להעביר למיכל חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

2. זריעת hPSCs כדי להתחיל את הבידול (יום 0)

הערה: hPSCs צריך להיות מוכן לבידול לאחר ייצוב (כלומר, להיות מפוצל 2 – 3x לאחר הפשרה). ודאו שהמושבות בריאות, בקצוות מבריקים וחלקים, ובידול מינימלי (איור 2B).

  1. הכינו מנות מצופות ממברנה למרתף (24 היטב או 6 מנות) יום אחד לפני יום 0 לפי הצורך. הביאו את הכלים ל-RT בתחילת הבידול.
  2. הפוך את היום 0 – 1 בידול בינוני לפי הצורך.
  3. מE8 את הכלים מתוך הכלי, מוכן לפצל את hPCSs, ולשטוף את המנה 2x באמצעות 1x PBS.
  4. הוסף 7 מ ל של 0.25 M EDTA לכל 100 מ"מ צלחת, מודחת ב 37 ° צ', 5% CO2, עבור 15 דקות.
    הערה: בשלב זה, טיפול EDTA ממושך להתפזר לתוך תאים בודדים.
  5. להדוף את כל hPSCs (הם צריכים להיות צפים) ולהעביר לצינור 50 mL. הוסף את אותה כמות או יותר של 1 x PBS כפתרון EDTA כדי לדלל את EDTA.
  6. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
  7. להיפטר supernatant, להוסיף 1 mL של היום 0 – 1 בידול בינוני ו pipet כדי המגון את התאים. לעקוב על ידי הוספת בינוני יותר ולאחר מכן לערבב כדי לדלל את פתרון התא לריכוז אידיאלי כדי לספור את התאים.
    הערה: אל דלל את פתרון התא ביתר מינון. תאים ממנה אחת מלא 100 mm צריך להיות מדולל ב 5 מ ל של בינוני כדי להתחיל.
  8. ספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או הומוציטומטר.
  9. לדלל את הפתרון הסלולרי כנדרש כדי להגיע 125,000 תאים/cm2 בנפח סופי נמוך (למשל, 2 mL לכל טוב עבור 6 היטב צלחת או 500 μl לכל טוב עבור 24 היטב צלחת).
    הערה: אמצעי אחסון נמוך מסייע לתאים להיות מתחברים מהר יותר.
  10. מנושף את כל תמיסת מטריקס ממברנה מתוך מנות מצופות וצלחת פתרון התא לתוך הבארות.
  11. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2.

3. סוללת הרכס העצבי (יום 1 עד יום 10, איור 2A)

  1. ביום 1 האכילו את התאים ביום 0 – 1 בידול בינוני (3 מ ל לכל היותר עבור 6 מנות היטב ו-1 mL לכל טוב עבור 24 מנות היטב).
  2. ביום 2 להאכיל את התאים עם יום 2 – יום 10 בידול בינוני (3 מ"ל לכל טוב עבור 6 מנות היטב ו-1 mL לכל טוב עבור 24 מנות היטב).
  3. מעכשיו, את התאים יש להאכיל כל יום אחר עד יום 10 (כלומר, יום ההזנה הבא יהיה יום 4).
    הערה: החל מיום 6 על, יש לזהות את הרכסים של NC (איור 2B). כדי לבדוק אם הבידול מתרחש, מומלץ לשאת תרבות בידול מקביל בבארות קטנות יותר (כלומר, 24 בארות), כי ניתן לוכתם עבור SOX10/AP2a ומשמש סמן גנים לאורך זמן בידול (איור 2B,C).
  4. אם מיון תאים, המשך לסעיף 4. . אחרת, המשך לאגף 5

4. מיון תא פלואורסצנטית המופעל (FACS) עבור סמן ציצה עצבית CD49D וצובר תאים NC ב spheroids

הערה: לצורך מיון FACS, יש לשמור את הדגימות על הקרח ולא להיחשף לאור לאחר הצביעת עד למיון.

  1. הכן מאגר FACS אם התאים ממוינים.
  2. הכן את היום 10 – 14 ספרואיד מדיום.
  3. ביום 10, להסיר את המדיום, ולשטוף 1x עם 1 x PBS.
  4. הוסף פתרון דיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) ב 2 מ"ל לכל טוב עבור 6 היטב צלחת או 1 ml לכל טוב עבור מאכל 24 היטב, ו דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 20 דקות.
  5. הhPSCs את כל הצינורות. והעבירו אותו לצינור 50 מ ל
  6. למלא את שאר הצינור עם מאגר FACS ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
    הערה: כל צינור 50 mL יכול להכיל עד 20 מ"ל או פחות של פתרון תאים. נפח מאגר ה-FACS צריך להיות גבוה דיו כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה.
  7. השמט את הסופרנטאנט, השהה מחדש את התאים עם הכמות המתאימה של מאגר FACS (~ 2 מ"ל לכל היותר בצלחת של 6 מעלות), וספור כדי לקבוע את מספר התא.
  8. הכן את הדגימות הבאות.
    1. לדוגמה 1 (שליטה בלתי מוכתמת): 1 x 106 תאים 400 μl של מאגר facs. לסנן את התאים דרך כובע מסננת 20 יקרומטר ולשמור את הצינור על הקרח.
    2. לדוגמה 2 (בקרת DAPI בלבד): 1 x 106 תאים ב 400 μl של מאגר facs המכיל 0.5 לארג/ML dapi. לסנן את התאים דרך צינור FACS עם כובע מסננת ולשמור את הצינור על הקרח.
    3. לדוגמה 3 (CD49d-התווית): להשעות את שאר התאים עם מאגר FACS המכיל PE/Cy7-מצוב CD49D נוגדן (5 μL עבור 1 x 106 תאים לכל 100 μl של מאגר facs) ב 15 מ ל שפופרת ו דגירה על הקרח עבור 20 דקות.
  9. למלא את הצינורות עם מאגר FACS ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
  10. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש כל 5 – 10 x 106 תאים 1 מ ל של מאגר facs המכיל 0.5/ML dapi על פי הוראות היצרן.
  11. לסנן את התאים דרך צינור ה-FACS עם כובע מסננת ולשמור את הצינור על הקרח.
  12. הכינו צינורות FACS המכילים 2 מ ל של מאגר FACS.
  13. למיין דרך מכונת FACS עם לייזרים שיכולים לזהות DAPI ו-PE-Cy7 כדי לבודד את CD49D+ אוכלוסיה.
  14. לאחר המיון, ספור את התאים הממוינים.
  15. צנטריפוגה את כל התאים ממוינים ולהשעות מחדש ביום 10 – 14 ספרואיד בינונית לריכוז הסופי של 0.5 x 106 תאים לכל 500 μl של בינוני.
  16. צלחת 0.5 x 106 תאים לכל טוב לתוך מצורף אולטרה נמוך 24 לוחות טוב.
  17. מודאת התאים ב 37 ° c, ב 5% CO2.

5. מצובר תאים NC בספרואידים

  1. אם לא באמצעות FACS כדי לבודד את תאי NC ובמקום זאת צובר אותם לתוך spheroids ישירות, ראשית להכין תאים כמתואר בשלבים 4.2 – 4.5.
  2. מלאו את שאר הצינור עם PBS 1x, ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
  3. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את התאים עם כמות מתאימה של היום 10 – 14 ספרואיד בינונית (למשל, ~ 2 מ ל של בינונית לכל טוב עבור 6 צלחת לוחית), ולספור כדי לקבוע את מספר התא.
  4. לדלל את התאים ביום 10 – 14 בינוני ספרואיד כדי 0.5 x 106 תאים לכל 500 μl של בינוני.
  5. צלחת 500 μL של התא השעיה לכל טוב באולטרה-נמוך אביזר 24 לוחות היטב.
  6. מודאת התאים ב 37 ° c, ב 5% CO2.

6. NC תחזוקה ספרואיד השראה מחולל קדמון (יום 10 עד יום 14, איור 4A)

  1. אפשרות 1: תרבות ספרואיד מינימלית
    1. ביום 11, להוסיף 500 μL של היום 10 – 14 ספרואיד בינונית כדי spheroids NC ללא מתיז מדיום קיים מיום 10. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2.
    2. ביום 12, להטות את הצלחת לצבור spheroids NC בצד אחד של הבארות. בזהירות למחוק ולהשליך כמו מדיום ככל האפשר, ולהאכיל עם 1 mL של היום 10 – 14 ספרואיד בינונית.
    3. תמשיך להאכיל את התאים. כל יום עד יום 14
    4. אופציונלי: אם הרורואידים מצטברים ויוצרים גוש גדול, השתמשו בפיפטה כדי לשבור את הגושים הספרואיד. הדבר מבטיח גם כי הספרואידים בודדים לא לקבל גדול מדי.
      הערה: טווח הגודל האידיאלי של ספרואיד צריך להיות סביב 100 – 500 μm. בתוך טווח זה, גודל המירואידים הבודדים אינו קריטי. עם זאת, המבנה, כגון קצוות חלקים וברורים (איור 3 ואיור 6) חשוב להצלחה נוספת. ביום 14, כל 24 צלחת באופן אידיאלי מכיל כ 50-60 spheroids של גדלים שונים בתוך טווח הגודל הנ ל.
  2. אפשרות 2: תרבות ספרואידית מורחבת
    1. ביום 15, כדי לשמור על spheroids NC, להאכיל עם 1.5 mL של היום 10 – 14 ספרוoid בינונית המכילה 0.5 μM RA. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2.
      הערה: RA יש להוסיף טרי עבור כל האכלה תמיד להיות מאוחסן ב-80 ° c.
    2. מעכשיו, להאכיל כל יום אחר עד יום 28 ולאחר מכן להמשיך עם ציפוי של spheroids (סעיף 7.1).
      הערה: הספירואידים הגדלים מתחלקים כ-1x בשבוע על ידי ליטוף אותם עם פיפטה משנת mL בכדי להפריד ביניהן. הם מפוצלים ביחס משוער של 1:2 – 1:4. בתוך 2 השבוע תקופת ההתרחבות, התאים צריכים להיות מרובעת בערך מספר.

7. סימון בידול והתבגרות (אפשרות 1: לאחר יום 14; אופציה 2: לאחר יום 28)

  1. ציפוי מספרי בצלחות רגילות
    1. הכינו לוחות מצופים ומצופי FM.
    2. הכנת בינונית סימטרית המכילה 0.125 μM RA (להוסיף טרי כל הזנה) ו 10 μM Y27632 (יום 14 בלבד).
    3. ביום 14, להטות את הצלחת לצבור spheroids NC בצד אחד של הבארות. מאכיף בזהירות ולהשליך כמה שיותר מדיום, ולהאכיל עם 1 מ ל של סימטרי בינונית.
    4. הסר LM/FN מלוחות מצופים.
    5. לפצל את הצלחת כל באר מ 24 צלחת לתוך 4 בארות נפרדות של חדש, מצופה לוחית 24 טוב. כל טוב מקורי יהיה 1 מ ל, המכיל ~ 50-60 spheroids. זה תשואות 250 μL, המכיל כ 10 – 15 spheroids עבור כל טוב על הלוח החדש.
    6. הוסף 250 μL של בינוני נוסף בכל טוב.
      הערה: מדובר בפיצול של 1:4; ודא כי הspheroids מופצים כראוי בתוך הפתרון כך הפיצול הוא יחסית אפילו. מספר הspheroids אינו נספר מכיוון שהמספר הסופי אינו משפיע על ההצלחה של יצירת סימטריות.
    7. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2.
    8. ביום 15 (או יום 29 עבור אופציה 2), להאכיל על ידי החלפת כל בינוני עם 1 מ ל של סימטרי בינונית המכילה 0.125 μM RA. מעכשיו, הנוירונים יש להאכיל כל יומיים עד יום 20 (או יום 35 עבור אופציה 2).
    9. לאחר יום 20 (או יום 35 עבור אופציה 2), הנוירונים יש להאכיל על ידי החלפת בזהירות רק חצי של המדיום הקיים (500 μL). מעתה והלאה, האכילו כל שבוע, אלא אם כן המדיום פונה במהירות לצהוב.
    10. המשיכו להאכיל שבועי עד לנקודת הזמן הרצויה.
      הערה: הסימפנים נוטים לצבור מבנים כמו גנגליה ונוטים להתנתק ממאכלי התרבות. כדי למנוע זאת, מומלץ לעשות חצי הארוחות וטיפול מינימלי.
  2. תאי ציפוי להקלטות אלקטרופיזיולוגיות
    1. הכינו את מ96 החשמל לוחות אלקטרופיזיולוגיה של המשרד.
    2. הכנת בינונית סימטרית המכילה 0.125 μM RA (להוסיף טרי כל הזנה) ו 10 μM Y27632 (יום 14 בלבד).
    3. ביום 14, לאסוף את כל spheroids, ואז לצנטריפוגה אותם ב 200 x g עבור 4 דקות.
    4. השמט את הסופרנטאנט, הוסף 2 מ ל של פתרון הדיסוציאציה, והעבר את התערובת חזרה לאחת הבארות של לוחית ההחזקה הנמוכה במיוחד. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2 עבור 20 – 45 דקות.
      הערה: בהתאם לגודל הspheroids, תקופת הדיסוציאציה יכולה להיות ארוכה מ-20 דקות. בדוק את הדיסוציאציה של התא כל 10 דקות עד 45 דקות. באופן אופציונלי, 0.1 mg/mL של DNase ניתן להוסיף עם פתרון הדיסוציאציה כדי למנוע DNA חינם מתאים מתים עושה את הפתרון דביק. אפשרות זו היא אופציונלית בפרוטוקול זה מאחר שה-spheroids לא יצטבר ברגע שהוא לא יהיה מנתק לחלוטין.
    5. Pipet לחלוטין לנתק את spheroids, ואז צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
    6. השמט את הסופרנטאנט, השהה מחדש את התאים עם הכמות המתאימה של המדיום הסימטרי, וספור את מספר התא.
    7. צלחת התאים ב-100,000/ס"מ2 פו/LM/FN-מצופה אלקטרופיזיולוגיה בארות ב 200 μl הכולל נפח לכל הטוב.
    8. ביום 15 (או יום 29 עבור אופציה 2), בצע את אותם תהליכי האכלה כמו בסעיף 7.1. אמצעי האחסון הכולל לאחר יום 15 (או יום 29 עבור אופציה 2) צריך להיות 300 μL לכל טוב.
    9. למדוד את האותות החשמליים באמצעות מחשב מערך רב אלקטרודה לאחר יום 20 (או יום 35 עבור אופציה 2).
      הערה: באפשרות 2, ניתן לציפוי spheroids בכל עת בין יום 14 – יום 28. מדידות אותות חשמליים הראשון ניתן לנהל 1 שבוע לאחר ציפוי spheroids.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מעניקים הוראות כיצד ליצור סימטריות מ hPSCs. תנאי התרבות שהווכחו כאן השתפרו מפרוטוקול23,24 (איור 1a) לתנאים המוגדרים בפני מאכיל וכימיים (איור 1a). שתי אפשרויות מסופקות, אחד שבו סימטריות מיוצרים בתוך 20 ימים, ועוד במקום NCCs ' יכול להיות מורחב עבור 2 שבועות כדי ליצור תאים נוספים שיכולים אז להיות מובחנת לתוך סימטריות (איור 1B, אופציה 1 ו-2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרסמנו לאחרונה שתי חוות דעת, אחד דן בשימוש ב-hPSC-הנגזרות של המחלה עבור מידול מחלות31 , כמו גם השוואה מעמיקה של פרוטוקולי בידול זמין22. כך, כאן אנו מתמקדים בפתרון בעיות הפרוטוקול הנוכחי כדי לעזור חוקר המעוניינים להצליח לעשות סימטריות. במהלך כל תהליך הבידול, על מנת לצבור נתונים עקביים, כמו גם תאים מובחנים בריאים, הזיהום בכל השלבים צריך להיות נשלט בקפידה. בתחזוקת hPSC שגרתית, יש לבצע בדיקות mycoplasma בשבוע או בחודש. אם מיון התאים מבוצע ביום 10, הוספת אנטיביוטיקה למדיום כלשהי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות להיידי אולריצ'ס על קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחות תרבית תאים 100 מ"מפלקון353003
15 מ"ל צינורות תרבית רקמות חרוטיותVWR/Corning89039-664
צלחות תרבית רקמות 24 בארותפלקון353047
24 בארות צלחות חיבור נמוכות במיוחדקורנינג07 200 601 ו-07 200 602
5% CO2/20% O2 חממת תרמופישר/חיים טכנולוגיותHeracell VIOS 160i
50 מ"ל צינורות תרבית רקמה חרוטיתVWR / Corning89039-656
צלחות תרבית רקמה 6 בארותCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500תמיסת דיסוציאציה של תאים
נוגדן Anti-AP2aAbcamab108311מארח: ארנב; דילול
1:400נוגדן נגד Ascl1BD Pharmingen556604מארח: עכבר IgG1; דילול 1:200
נוגדן נגד CD49DBioLegend304313מארח: עכבר IgG1; 5 μ ליטר/מיליון תאים ב-100 μ l נפח
נוגדן Anti-CD49D (איזוטיפ)BioLegend400125מארח: עכבר IgG1; 5 μ ליטר/מיליון תאים ב-100 μ l נפח
DAPI צבעSigmaD95421:1000 דילול
נוגדן נגד DBHImmunostar22806מארח: ארנב; דילול 1:500
נוגדן נגד GFPAbcamab13970מארח: עוף; דילול 1:1000
נוגדן Anti-HOXC9Abcamab50839מארח: עכבר; דילול 1:100
נוגדן Anti-NET1MabNET17-1מארח: עכבר; דילול 1:1000
נוגדן נגד PRPHSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112מארח: עכבר IgG2a; דילול 1:200
נוגדן Anti-SOX10Santa Cruz Biotechnologysc-365692מארח: עכבר IgG1; דילול 1:100
נוגדן Anti-THPel-FreezP40101-150מארח: ארנב; דילול 1:500
חומצה אסקורביתSigmaA8960-5Gריכוז מלאי: 100 מ"מ
תוסף B27Thermo Fisher/Life Technologies12587-010ריכוז מלאי: 50x
BDNFמו"פ & D Systems248-BDריכוז מלאי: 10 μ גרם/מ"ל
BMP4מו"פ D Systems314-BPריכוז מלאי: 6 מ"מ
מונה תאיםThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
שקופיות תא ספירת תאיםInvitrogenC10312
צנטריפוגהEppendorf57021& 5424R
CHIR99021מו"פ D Systems4423ריכוז מלאי: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627ריכוז מלאי: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018ריכוז מלאי: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057ריכוז מלאי: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6בינוני ג'יבקוA15165-01
E8 בינוניג'יבקוA15169-01ריכוז מלאי: 1x
תוסף E8gibcoA15171-01ריכוז מלאי: 50x
EDTASigmaED2SSריכוז מלאי: 0.5 M
לוחות אלקטרופיזיולוגיה (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
מכונת FACSבקמן קולטרCytoFLEX (עבור FACS)
מכונת FACSבקמן קולטרMoFlo Astrios EQ (למיון)
צינורות FACS (מכסה פילטר כחול)צינורות Falcon352235-FACS
(מכסה לבן)Falcon352063
סרום בקר עוברי (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450ריכוז מלאי: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202מטריצת קרום מרתף; ריכוז מלאי: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
פיברונקטין אנושי (FN)VWR/Corning47743-654ריכוז מלאי: 1 מ"ג/מ"ל
L-גלוטמיןתרמו פישר/גיבקו25030-081ריכוז מלאי: 200 מ"מ
מיכל LNמערכות ביוגניות מותאמות אישיתV-1500AB
קורא MEAAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R& D Systems3400-010-01ריכוז מלאי: 1 מ"ג/מ"ל
תוסף N2Thermo Fisher/Life Technologies17502-048ריכוז מלאי: 100x
Neurobasal בינוניgibco21103-049ריכוז מלאי: 1x
NGFPeproTech450-01ריכוז מלאי: 25 μ גרם/מ"ל
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Gibco14190-136ריכוז מלאי: 1x
פולי-L-אורניתין הידרוברומיד (PO)SigmaP3655ריכוז מלאי: 15 מ"ג/מ"ל
פרימוצין (אנטיביוטיקה)InvivoGenANTPM1ריכוז מלאי: 50 מ"ג/מ"ל
מכונת qPCRBio-Rad LaboratoriesC1000 צלחות qPCR מגע
Bio-Rad LaboratoriesHSP9601
FGF2 רקומביננטי D Systems233-FB/CFריכוז מלאי: 10 μ גרם/מ"ל
חומצה רטינואיתSigmaR2625ריכוז מלאי: 1 מ"מ
SB431542Tocris/R& D Systems1614ריכוז מלאי: 10 מ"מ
טריפן כחולקורנינגMT-25-900-CI
ויטרונקטין (VTN)תרמו פישר/לייף טכנולוגיותA14700ריכוז מלאי: 0.5 מ"ג/מ"ל
אמבט מיםVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254ריכוז מלאי: 10 מ"מ
מו"פ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

Related Articles