הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60851

⸱

13 במרץ 2020

 ,  ,  , 
1Research and Innovation, Murdoch University, 2Centre for Digital Agriculture, Curtin University, 3Centre for Integrative Metabolomics and Computational Biology, School of Science, Edith Cowan University, 4Centre for Computational and System Medicine, Health Futures Institute, Murdoch University, 5Department of Primary Industries and Regional Development, 6State Agricultural Biotechnology Centre, Murdoch University

במאמר זה

סיכום

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

תקציר

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה והניהול בפרקטיקה החקלאית עלולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. הנתונים הטבולומיקס מספקים הקראה מתוך האינטראקציות הללו ברגע נתון והיא אינפורמטיבית של הסטטוס הביוכימי של האורגניזם. עוד, מטבוליטים בודדים או פאנלים של מטבוליטים ניתן להשתמש כמו סמנים מדויקים עבור תשואה וחיזוי איכות וניהול. הצמח מטביו צפוי להכיל אלפי מולקולות קטנות עם תכונות פיזיקליות מגוונות המספקים הזדמנות התובנה הביוכימי לתוך תכונות פיסיולוגיים גילוי ביואריקר. כדי לנצל את זה, מטרת המפתח עבור החוקרים טבולומיקס היא ללכוד כמה שיותר מגוון פיזיקליים ככל האפשר בתוך ניתוח אחד. כאן אנו מציגים שיטה טבולומיקס מבוססת על בסיס כרומטוגרפיה, מבוסס על מטרה בלתי ממוקדת לניתוח דגן חיטה מצמח. השיטה משתמשת במנהל הממס של הנוזל chromatograph הנוזלי כדי להציג שלב נייד שלישי ומשלבת מעבר מסורתי שלב היפוך עם מעבר שומנים בהדרגה. הכנת תבואה, הפקת מטבוליזם, ניתוח אינסטרומנטלי וזרימות עבודה של עיבוד נתונים מתוארות בפרוטרוט. דיוק המוני והאותות הטובים נצפו והשיטה הניבה כ-500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל מצב יינון. יתר על כן, המטלוליט שונים באופן משמעותי ואותות תכונה שומנים בין זני חיטה נקבעו.

מבוא

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה ונוהלי הניהול בחקלאות עלולים לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. מטבוליטים צמחיים מושפעים גורמים כגון הגנום, הסביבה (אקלים, כמות המשקעים וכו '), ובסביבה החקלאות, הדרך יבולים מנוהלים (כלומר, יישום של דשן, קוטלי פטריות וכו '). בניגוד הגנום, מטאבולזה מושפע כל הגורמים האלה ולכן טבולומיקס נתונים מספק טביעת אצבע ביוכימית של אינטראקציות אלה בזמן מסוים. יש בדרך כלל אחת משתי המטרות למחקר מבוסס טבולומיקס: ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של ביוכימיה של האורגניזם ולעזור להסביר את מנגנון התגובה הפרטורציה (abiotic או לחץ ביוטי) ביחס הפיזיולוגיה; ושנית, לחבר בסמנים עם הפרטורציה תחת לימוד. בשני המקרים, התוצאה של הידע הזה היא אסטרטגית ניהול מדויקת יותר כדי להשיג את המטרה של גודל תשואה משופרת ואיכות.

הצמח בתוך המפעל צפוי להכיל אלפי1 של מולקולות קטנות עם תכונות פיסיוכימיקלים מגוונים. כיום, אין פלטפורמות טבולומיקס (בעיקר ספקטרומטר מסה וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית) יכולים ללכוד את המטה כולו בניתוח אחד. פיתוח טכניקות כאלה (הכנה לדוגמה, הפקת מטבוליזם וניתוח), אשר מספקים כיסוי גדול של מטאמיטין ככל האפשר בתוך הפעלה אנליטית אחת, היא מטרה מרכזית עבור חוקרים טבולומיקס. ניתוח טבולומיקס הקודם לא ממוקד של דגנים חיטה יש נתונים משולבים הפרדות כרומטוגרפיות מרובות ומכשור הרכישה ו/או מיכשור עבור כיסוי מטאמיאלי גדול יותר. עם זאת, יש צורך בדוגמאות שניתן להכין ולרכוש בנפרד עבור כל מודאליות. לדוגמה, Beleggia ואח '2 הכין דוגמה ללעג עבור ניתוח GC-ms של אנליטים קוטביים בנוסף לניתוח GC-ms של האנליטים הלא קוטבי. Das et al.3 בשימוש הן GC-ו-LC-MS שיטות כדי לשפר את הכיסוי בניתוח שלהם; עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל הכנות לדוגמה נפרדת כמתואר לעיל וכן שתי פלטפורמות אנליטיות עצמאיות. ניתוחים קודמים של דגנים חיטה באמצעות GC-ms2,3,4 ו-LC-ms3,5 פלטפורמות הניבו 50 כדי 412 (55 זיהה) תכונות עבור gc-ms, 409 עבור משולב gc-ms ו-LC-ms וכמה אלפי עבור ניתוח LC-ms lipidomics5. על-ידי שילוב לפחות שני מצבים לניתוח אחד, ניתן לשמור על הכיסוי המוארך באופן מתקדם, ולהגדיל את עושרה של פרשנות ביולוגית תוך הנחה גם חיסכון בזמן ובעלות.

כדי לאפשר את ההפרדה היעילה של מגוון רחב של מינים שומנים בדם על ידי כרומטוגרפיה בשלב הפוך, lipidomics המודרנית מתודולוגיות בדרך כלל להשתמש בחלק גבוה של איזופנול ממיסים6, מתן שיעורי השומנים לכיתות שעשויות להיות לא פתורות על ידי הכרומטוגרפיה. עבור הפרדה יעילה השומנים, השלב ההתחלתי הנייד הוא גם הרבה יותר גבוה בהרכב אורגני7 מאשר שיטות היפוך אופייני כרומטוגרפי שלב, אשר לשקול מחלקות אחרות של מולקולות. ההרכב האורגני הגבוה בתחילת מעבר הצבע הופך את השיטות הללו למתאימות פחות למחלקות רבות אחרות של מולקולות. בעיקר, בשלב הפוך כרומטוגרפיה נוזלי מעסיקה מעבר מומס בינארי, החל בהרכב מימית בעיקר והגדלת תוכן אורגני כמו חוזק הכרומטוקציה של הכרומטוגרפיה גדל. לשם כך, ביקשו לשלב את שתי הגישות כדי להשיג הפרדה של שיעורי השומנים וגם לא ליפיד של מטבוליטים בתוך ניתוח אחד.

כאן, אנו מציגים שיטת כרומטוגרפית המשתמשת בשלב הנייד השלישי ומאפשרת שלב היפוך מסורתי משולב וlipidomics-שיטת כרומטוגרפיה מתאימה באמצעות הכנה לדוגמה אחת וטור אנליטי אחד. אימצנו רבות מאמצעי בקרת איכות ושלבי סינון נתונים שיושמו בעבר במחקרים טבולומיקס קליניים בעיקר. גישות אלה שימושיות בקביעת תכונות איתנות עם שימוש ביכולות טכניות גבוהות ורלוונטיות ביולוגית וכוללת את אלה שאינם עומדים בקריטריונים אלה. לדוגמה, אנו מתארים ניתוח חוזר של מדגם qc במאגר8, תיקון QC9, סינון נתונים9,10 והשלכה של תכונות חסרות11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שיטה זו מתאימה ל -30 דגימות (כ-150 זרעים לכל מדגם). במקום שימשו כאן שימוש בשלושה משכפל ביולוגי של עשרה סוגי חיטה שונים.

1. הכנת גרגירים

  1. לאחזר דגימות (דגנים מלאים) מ-80 ° c אחסון.
    הערה: ייבוש זרעים מומלץ זמן קצר לאחר הקטיף אם מדגמים נאספים ממספר עונות. זה ממזער את כל השינויים בריכוז מטבוליזם שעלול להתרחש לאחר תקופות שונות של אחסון. כדי לעשות את זה, להעביר זרעים ל 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה פלסטיק (כ 300 זרעים ימלא את הצינור) ולכסות עם רדיד אלומיניום. מחורר את רדיד האלומיניום פעמיים-שלוש בעזרת סיכה ומקפיאים את כל הדגנים בלילה (כ -24 שעות). ניתן להחזיר דגימות למקפיא של-80 ° c בשלב זה או לבצע את השלב הבא.
  2. לטחון את הזרעים באמצעות בלנדר מעבדה עבור שני רץ במצב גבוה עבור 20 s.
    הערה: הבלנדר המשמש לפרוטוקול זה מחייב מינימום של כ 150 זרעים כדי למלא את הבלנדר לגובה להב ולתת מדגם דגנים באופן יחסי הומוזה.
  3. להסיר את הבלנדר מהבסיס ולהקיש על צד של בלנדר להביא כל גרגר הקרקע גס לפני השטח של המדגם. ניתן למחוק או לאחסן חומר גס.
  4. אבקת העברה כמו חומר קרקע דק מבלנדר לצינור מיקרוצנטריפוגה פלסטיק 2 mL.
    הערה: לשטוף את הבלנדר עם מים המיוים ולשטוף עם מיים LC-MS-כיתה בין דגימות. ודא כי הבלנדר יבש לחלוטין לפני שתמשיך המדגם הבא.
  5. החזר דגימות של דגנים בקרקע דק למקפיא או המשך לשלב הבא (חילוץ מטבוליט).

2. הכנת ממיס הוצאה

הערה: הכינו את החילוץ באותו יום שבו מבצעים את העקירה.

  1. הכן לפחות 2 מ ג של 1 מ"ג/mL של כל תקן. השתמש ב-acetonitrile (ACN) כדי להכין חומצת פחם 2-עמינח, miconazole ו d6-החוצה חומצה. להשתמש במים כדי להכין 13ג6-sorbitol.
  2. קח 2 מ ל של כל 1 מ"ג/mL תקן ולהוסיף 100 mL בקבוקון נפחי.
  3. מלא את הבקבוקון הנפחי. עם הצינור ודא כי 100 mL של acetonitrile מכיל 20 μg/mL של כל הסטנדרטים הפנימיים: 2-עמינח פחם, miconazole, 13ג6-sorbitol, d6-החוצה חומצה.

3. הוצאת מטבוליט

  1. שוקלים 200 מ ג של גרגר קרקע דק לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL.
  2. הוסף 500 μL של ממיס החילוץ ל 200 מ"ג של דגימה דק של דגנים.
  3. מערבבים באמצעות הומוגניצר עבור 2 רץ של 20 s ב 6,500 סל ד.
  4. צנטריפוגה ב 4 ° צ' עבור 5 דקות ב 16,100 x g.
  5. העבר את הסופרנאטנט. לצינור פלסטיק של 2 מ ל
  6. חזור על הליך זה משלבים 3.1 עד 3.5 פעמיים יותר כדי לתת נפח supernatant כולל של כ 1.5 mL.
  7. . מערבולת לערבב את הסופרנטאנט
  8. העברת אמצעי אחסון שווה (55 μL) של כל אחד מהחלקים לצינור שפופרת נפרד בנפח של 2 מ ל כדי ליצור מדגם של תמצית תבואה במאגר.
  9. העברת 50 μL ליטר של התמצית לבקבוקון זכוכית.
    הערה: מחלץ יכול להיות קפוא (-80 ° c) בשלב זה או להמשיך לשלב הבא ולהמשיך בניתוח LC-MS.

4. הכנת פתרונות לניתוח LC-MS

התראה: עבור חומצה מרוכזת, תמיד להוסיף חומצה למים/ממס.

  1. להכין 50 mL של פתרון 1 M אמוניום מניות. שוקלים 3.153 g של אמוניום formate ו להעביר 50 mL בקבוקון נפחי. מילוי בקבוקון נפחי לקו עם LC-MS כיתה H2O.
  2. להכין 1 L של השלב הנייד A המורכב של 10 מ"מ מילימטר אמוניום, 0.1% החומצה formate. כדי לעשות זאת, להוסיף כ 500 mL של מים LC-MS בכיתה 1 L נפחי בקבוקון. הוסף 10 מ ל של 1 מ ' אמוניום formate מלאי 1 mL של חומצה formate. מילוי בקבוקון נפחי לקו עם LC-MS כיתה H2O. העברה לבקבוק 1 L ו sonicate עבור 15 דקות כדי דגה.
  3. להכין 1 L של השלב הנייד B המורכב 10 מילימטר אמוניום ב79:20:1 הכולל: אלכוהול איזופרופיל: מים, 0.1% היחס חומצה formate. הוסף 200 מ ל של איזופנול לבקבוקון מנפח 1 L. הוסף 10 מ ל של 1 מ ' אמוניום formate מלאי 1 mL של חומצה formate. ממלאים את הבקבוקון הנפחי. עם הצינור העבר לבקבוקון של 1 וsonicate. במשך 15 דקות לדגה
    הערה: לדלל את האלכוהול 1 M לתוך משקאות חריפים (IPA) לפני הוספת ACN. . מיכל האמוניום אינו מסיסים באוכל
  4. להכין 1 L של השלב הנייד C המורכב 10 מילימטר אמוניום ביחס לאלכוהול איזופרופילי 89:10:1: המים. כדי לעשות זאת, להוסיף כ 500 mL של איזופנול, 10 מ"ל של 1 M מלאי אמוניום ו 100 mL של acetonitrile ל 1 L נפחי בקבוקון. מלא את הקו עם איזופנול. העבר לבקבוקון של 1 וsonicate. במשך 15 דקות לדגה
  5. הכנת ממיסים מערכת LC-MS לשטוף
    1. החליפו את התמיסה של רחיצת ראש המשאבה בתמיסה טרייה. השתמש ב-50% מתנול, 10% אלכוהול איזופרופיל או אחר כמומלץ על ידי היצרן.
    2. להכין פתרונות חזקים וחלשים מחט שטיפת לשטוף את פלואידיקה ההזרקה לפני ובעקבות הזרקת המדגם. לשטיפה חזקה, להוסיף כמויות שוות של ACN ו-IPA. עבור שטיפת חלש, להכין פתרון של 10% ACN (דורש כ 500 mL ו-1 L של כל אחד שוטף חזק וחלש בהתאמה עבור פרוטוקול זה ומספר דגימות) בבקבוקים נפרדים.
    3. הגדר את אמצעי האחסון לשטיפת המחט ל-600 μL ו-1800 μL עבור השטיפה החזקה והחלשה, בהתאמה.

5. הכנת דגימות לניתוח LC-MS

  1. לפי הליך ההפעלה הסטנדרטי של היצרנים לקראת הכנת 400 ng/μL ליוצין אנקפלאין, פיפטה 7.5 מ ל של מים לתוך 12 מ ל לוצין-אנקפלאין בבקבוקון המכיל 3 מ ג של לוקיסין-אנקיצין. להקפיא ב-80 ° c ב 50 μL.
  2. להכין 100 mL של 5% ACN המכיל 200 ng/mL לאוצין-enkephalin (50 μL של 400 ng/μL ליוצין enkephalin). היכונו באותו היום כמו ניתוח LC-MS.
  3. הוסף 950 μL של 5% acetonמטריל המכיל את תקן ההזרקה ליוצין-enke, כדי 50 μL לדוגמה המוכן משלב 3.
  4. מערבולת לערבב את המדגם מוכן.

6. התקנה LC-MS

הערה: תיאור מפורט של כיוונון שיטות המכשיר והרכישה מתואר במדריך למשתמש של היצרן. מדריך כללי והפרטים הספציפיים לפרוטוקול זה מפורטים להלן. ניתן להשלים את השלבים הבאים בכל עת לפני רכישת הנתונים.

  1. פתח פרופיל חומרה של LC-MS.
  2. הגדר את שיטת ה-כרומטוגרפי כמתואר בטבלה 1. ודא שמערכת ה-LC מצוידת במנהל הממס הרבעוני כדי להגדיר מעבר צבע זה.
    הערה: IPA הוא ממיס צמיגה. יש להציג אותה בקצב זרימה נמוך ובזמן מספיק מספק יש להשתמש לפני הגדלת הקומפוזיציה ל-98.0%. שלבים אלה ימנעו ממערכת LC ללחוץ ולעצור.
  3. הגדר את שיטות הרכישה של ספקטרומטר המסה עבור כל אחד מהמצבים החיוביים והשליליים של תוף-MS בטווח m/z של 50-1300.
    הערה: הכלי המשמש לעבודה המוצגת כאן דורש שיטות חיוביות ושליליות לכייל ולפעול בנפרד (כלומר, החלפת קוטביות בתוך שיטה אינה אפשרית).
  4. אם עמודת ה-LC חדשה, הגדר את העמודה בהתאם להמלצה של היצרן.
    הערה: יש להשלים את השלבים הבאים ישירות לפני רכישת הנתונים.
  5. בפרופיל חומרה ' MS בלבד ', כיול את ספקטרומטר המסה בהתאם להמלצות היצרן. השלם שלב זה לפני כל מצב של רכישה, וודא שהמערכת התייצב בכל מודאליות נתונה לפני הכיול.
  6. לטהר ולשטוף את מערכת lc פלואידיקה באמצעות ממיסים lc-MS כיתה, כולל שלב נייד ולשטוף ממיסים.
  7. באמצעות שיטה מערכת LC באמצעות שיטת LC הפעלת תנאי, להבטיח כי לחץ הטור התייצב.
  8. הכנס את הנתרן formate (0.5 mM ב 90% IPA) בתחילת רצף לדוגמה (המתואר להלן) כדי לבדוק את כיול המכשיר.
  9. הגדר את טבלת רצף המכשירים כך שהממס והממיסים (החילוץ) יהיו מנותח תחילה; ואחריו דגימות QC במאגר (6-10) עבור מיזוג מערכת; לאחר מכן הרשימה לדוגמה אקראי עם דגימות QC לרוץ במרווחי זמן קבועים (למשל, כל הזרקה חמישית) כשכפל טכני. הפעל שתי דגימות QC בסוף הרצף.
    הערה: מומלץ לכלול את התאריך ואת סדר ההזרקה/הרכישה בקובץ המדגם, כמו גם את מזהה המדגם. לדוגמה: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological שכפול. לפני לחיצה על התחל, לוודא את הלחץ הטור LC יציב וכי LC מחובר MS.

7. עיבוד נתונים

הערה: זרימת עבודה כללית בעיבוד נתונים מוצגת באיור 1.

  1. בדוק את איכות הנתונים (דיוק ברמת המסה הפנימית (חישוב להלן) ומתן האותות בזמן שהרצף פועל. כדי לבדוק את האותות, הבדיקה החזותית של ספקטרום השכבות צריכה להספיק.
    הערה: שגיאת המסה (ppm) = ((המסה התיאורטית)/המסה התיאורטית) x 106
  2. יצירת מטריצה מיושרת בעוצמת שיא המכילה דגימות x סטנדרטים פנימיים (מיושר לפי זמן שמירה וערכי m/z ).
    1. פתח את תוכנת עיבוד הנתונים (ראה טבלת חומרים). תחת דף הבית ≫ פתיחה, לחץ על נתונים. נווט למיקום הקובץ המתאים ופתח את כל קבצי הנתונים.
    2. תחת ≫ רצף ≫ סוג עיבוד, בחר באפשרות כימות מהתפריט הנפתח.
    3. תחת ה> שיטה ≫ קוואן, לחץ על רכיבי כיול. מלא את כל השדות באמצעות הפרטים המסופקים בטבלה 2. לחץ על אישור.
    4. בלוח השמאלי בעמודות ליד קבצי הנתונים, למלא את סוג המדגם על ידי לחיצה ימנית על התא ובחירה לא ידוע. מלאו את הרמה כ- n/a.
    5. תחת הבית ≫ עיבוד, בחר רצף. בחר מיקום לשמירת הרצף ולאחר מכן לחץ על תהליך.
    6. תחת הבית ≫ תוצאות, בחר קוואן. ממציג קוואן , בחר ייצוא רץ למנתח מטריקס.
    7. מתוך מציג תוצאות מנתח מטריקס, לחץ על ייצוא ל-csv. שמור את הקובץ כקובץ גיליון אלקטרוני.
    8. בתוכנת גיליון אלקטרוני, חשב את הממוצע, סטיית התקן וסטיית התקן היחסית של העוצמה (אזור השיא) של כל תקן פנימי.
  3. צור מטריצה מיושרת בעוצמת שיא המכילה דוגמאות של תכונות שאינן ממוקדות (מיושרות באמצעות זמן שמירה וערכי m/z ).
    1. פתח את תוכנת ניתוח גילוי המולקולה הקטנה (ראה טבלת חומרים) ובחר קובץ > חדש כדי ליצור ניסוי חדש. ציין את שם הניסוי ובחר את המיקום כדי לשמור ולאחסן קבצי ניסוי. לחץ על הבא.
    2. בחר את סוג הכלי המשמש (ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה), תבנית נתונים (פרופיל) והקוטביות (חיובית או שלילית). לחץ על הבא. בחר את כל העדתעלות הזמינות בספריה וערוך ספריית adducts כנדרש. לחץ על יצירת ניסוי. דף חדש ייטען במקום שבו שאר עיבוד הנתונים ימשיך/יתרחש.
    3. יבא קבצי נתונים. בחר את תבנית הקובץ ולאחר מכן בחר ייבוא. דפדף אל מיקום הנתונים ובחר את קבצי הנתונים שייובאו. ההתקדמות תוצג עבור כל קובץ בלוח השמאלי של העמוד.
    4. לאחר ייבוא קבצי נתונים, בחר באפשרות ' הפעל עיבוד אוטומטי'. בחרו שיטה לבחירת הפניה ליישור. או לתת לתוכנה להעריך את כל הרצפים עבור התאמה, לתת רשימה של דגימות מתאימות (כלומר, בדיקות QC) או לבחור את ההפניה המתאימה ביותר i.e. מדגם QC באמצע הרצף. בחר כן, יישר אוטומטית את הרצפים שלי > הבא.
    5. בחר באפשרות הבא בדף עיצוב הניסוי (ניתן להגדיר זאת מאוחר יותר).
    6. בחר באפשרות ' בצע מרב איסוף ' ולאחר מכן הגדר פרמטרים. תחת הכרטיסייה ' מרב מגבלות איסוף ', בחרו ' עוצמת יון מוחלטת ' והזינו 100. בחר באפשרות החל רוחב שיא מינימלי והזן 0.01 דקות. בחר אישור ≫ סיום. בסיום העיבוד, בחרו ' סגור'.
      הערה: ניתן למטב את המרב ממגבלות איסוף עבור סוגי קבצי נתונים אחרים לפי הצורך.
    7. בחלק הימני התחתון של המסך, בחר במקטע הושלם. הפעלת סקירה מיושרת וודא שכל דוגמה מיושרת להפניה. תוצאות היישור היו > 90% עבור הנתונים המוצגים כאן. בחר מקטע שהושלם.
    8. בעמוד הבא, בחר בין עיצוב הנושא. . שם העיצוב בחר באפשרות קבץ את הרצפים באופן ידני וצור עיצוב. הוסף תנאי, לחץ על תנאי 1 ושנה את שם הקבוצה בהתאם. לחץ על המקטע הושלם.
      הערה: המשך להוסיף תנאים בהתאם לשימוש בסטטיסטיקה בתוך התוכנה. מכיוון שאנחנו רק השתמשנו בתוכנה כדי ליצור מטריצה בלתי ממוקדת, השתמשנו בתנאי אחד ' כל '.
    9. בעמוד הבא, בחר במקטע הושלם. אל תעשה מחדש. את איסוף השיא
    10. סקור את הפירוק ולאחר מכן לחץ על המקטע הושלם.
    11. עבור אל קובץ ≫ מדידות מורכבות ייצוא. בטל את הבחירה במאפיינים שאינם מבוקשים בפלט. לחץ על אישור. בחר מיקום לשמירת קובץ ה-csv. לחץ על שמור ≫ פתח קובץ ≫ פתח תיקיה או סגור.
  4. סנן את הנתונים באמצעות החילוץ ריקים כדי להסיר חפצי אמנות (תוכנת גיליון אלקטרוני).
    1. עבור כל תכונה של RT x m/z , בעמודה חדשה, חשב את התגובה הממוצעת בכדורי סרק.
    2. עבור כל תכונה של RT x m/z , חשב את התגובה הממוצעת בכל הדגימות האחרות (כולל דגימות QC).
    3. חישוב העוצמה% שיא של ריקים בדגימות (תגובה ממוצעת בתגובה ריקה/ממוצעת בדגימות x 100).
    4. מיין את עמודת התרומה של אחוז מהערכים הנמוכים ביותר לערכים הגבוהים ביותר.
    5. הסר תכונות אשר יש > 5% התרומה בעוצמה מפני כדורי סרק.
  5. סנן ערכים חסרים ותקן את אותות התכונות לאותות בדגימות QC במאגר.
    1. פתח את תוכנת עיבוד הנתונים (טבלת חומרים). לחץ על לחצן הצג מטריצות מטריקסx. לחצו על הלחצן ' פתח קובץ נתונים '.
    2. נווט למיקום הקובץ. csv המכיל את עוצמת השיא של תכונות RT x m/z עבור כל מדגם (מטריצה לא ממוקדת). בחר באפשרות ' פתח'.
    3. תחת הכרטיסיה דגימות QC, מלא כל פרמטר כנדרש. עבור ערכת הנתונים המתוארים כאן, השתמש ב-QC category = QC, התעלם מקטגוריות = ריק, סוג השלכה = none, סף כיסוי = 80, קנה מידה באמצעות = ללא שינוי קנה מידה, בטלו את ההמרה של יומן הרישום, נכון באמצעות החלקת spline, החלקה = 0.25.
    4. בחלק הימני העליון של החלונית ' מטריצה ', לחץ על תיקון QCלחצן הפעלה.
    5. לאחר שהתיקון התבצע בחלק הימני העליון של החלונית ' מטריצה ', לחץ על ' שמור תוצאות'. נווט למיקום מתאים ושמור את קובץ תוצאות ה-csv.
  6. סנן את הנתונים כדי להסיר תכונות שיש להן > 20% RSD בדגימות QC.
    1. סדר את הנתונים כך שהדגימות נמצאות בשורות ובתכונות נמצאות בעמודות.
    2. בעמודה חדשה, חשב את עוצמת השיא הממוצעת עבור דגימות QC.
    3. בעמודה חדשה, חשב את סטיית התקן של עוצמת השיא עבור דגימות QC.
    4. חשב את סטיית התקן היחסית של עוצמת השיא עבור דגימות QC: (סטיית תקן של QC/QC) x 100.
    5. מיין את התכונות מהנמוכה ביותר לגבוהה ביותר% RSD ולהסיר תכונות שיש להם QC RSD > 20%.
  7. לסנן את הנתונים כדי להסיר תכונות עםלדוגמהrsd נמוכה/rsd יחסQC (למשל, < 1).
    1. בעמודה חדשה, חשב את עוצמת השיא הממוצעת עבור דגימות.
    2. בעמודה חדשה, חשב את סטיית התקן של עוצמת השיא עבור דגימות.
    3. חשב את סטיית התקן היחסית של עוצמת השיא של הדגימות: (סטיית תקן לדוגמה/ממוצע לדוגמה) x 100.
    4. בעמודה חדשה, חלק את הדגימות RSD על-ידי ה-QC RSD.
    5. מיין את הערכים (RSDלדוגמה/יחסQC rsd) מהגבוה ביותר לנמוך ביותר ולהסיר תכונות עם יחס < 1.
  8. להשמיץ ערכים חסרים (מספר שיטות זמין באינטרנט).
    1. עצב את הגיליון האלקטרוני כך שהדגימות נמצאות בשורות ובתכונות נמצאות בעמודות. על העמודה הראשונה להיות שם הקובץ של הדגימות. צור עמודה נוספת ליד שמות הקבצים והזן את הקיבוצים לדוגמה. במקרה זה, הדגימות קובצו לפי מגוון.
    2. שמור את הגיליון האלקטרוני כקובץ csv.
    3. עבור לדף הבית של צינור אנליטי מבוסס אינטרנט עבור טבולומיקס תפוקה גבוהה (ראה טבלת חומרים) ולחץ על לחץ כאן כדי להתחיל.
    4. לחץ על ניתוח סטטיסטי. תחת העלאת הנתונים שלך, בחר סוג נתונים: טבלת עוצמת שיא, תבנית: דוגמאות בשורות (לא משויכים) ולאחר מכן בחרו ' קובץ '.
    5. נווט לקובץ. csv, בחר באפשרות פתיחה ולאחר מכן בחר בשלח.
    6. בעמוד הבא, בחר באפשרות שערוך ערך חסר. בטל סימון שלב 1 (זה בוצע ב-אנליזרפרו XD). בשלב 2, בחר שיטה להערכת הערכים החסרים.
      הערה: עבור הנתונים שהוצגו כאן-' הערכת ערכים חסרים ' ב-' KNN ' נבחרה.
    7. בשלב זה, ניתן להוריד את מטריצת הנתונים (לבחור הורדה מהחלונית השמאלית של דף האינטרנט) או להמשיך לבצע ניתוחים סטטיסטיים נוספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המפעל מושפע משילוב של הגנום והסביבה שלה, ובנוסף בסביבה חקלאית, משטר ניהול יבול. אנו מדגימים כי הבדלים גנטיים בין זני חיטה ניתן לצפות ברמת מטבוליט, כאן, עם מעל 500 תרכובות נמדד מראה ריכוזים שונים באופן משמעותי בין זנים בלבד בדגן. דיוק המוני טוב (< 10 דפים לדקה שגיאה) ו האות מובחנות (< 20% RSD) של תקנים פנימיים (איור 2) נצפו הן עבור מצבי אינון שלילי וחיובי (שולחן 3). ההכנה לדוגמה המתוארת והניתוח המבוסס על מבוססי כרומטוגרפיה נוזלית הניב &g...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מציגים שיטת LC-MS מבוסס טבולומיקס שאינה ממוקדת ניתוח של דגן חיטה. השיטה משלבת ארבעה מצבי רכישה (שלב הפוך ושלב הפוך לשומנים עם אינון חיובי ושלילי) לשני מצבים על ידי החדרת שלב נייד שלישי לתוך הדרגתי שלב היפוך. הגישה המשולבת הניבה כ 500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל קוטביות יון עם כמחצית כאלה שונים באופן משמעותי באינטנסיביות בין זני חיטה. שינויים משמעותיים בריכוז המטמטוליט בדגן של זנים שונים של חיטה מעיד על ביוכימיה שונה, אשר עשוי להיות מקושר להתנגדות למחלות, עמידות במתח ותכונות פנופאיות אחרות החשובות לאיכות הדגנים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים רוצים להכיר בתוכנית החקלאות ומלגת המזון של מערב אוסטרליה (המחלקה למשרות, תיירות, מדע וחדשנות, ממשלת אוסטרליה המערבית) וברנש של ראש הממשלה, פרופסור סיימון קוק (המרכז ל החקלאות הדיגיטלית, אוניברסיטת קורטין ואוניברסיטת מרדוק). ניסויים שדה ואוסף לדוגמה דגנים תמכו על ידי הממשלה של התוכנית תמלוגים של אוסטרליה מערב האזורים. אנו מכירים בגראנטלי סטיינר ורוברט פרנץ ' בגין תרומתם לניסויי שדה. הביו-טפסים של אוסטרליה. מודה במימון הציוד

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
13C6-סורביטולMerck Sigma-Aldrich605514
2-aminoanthraceneMerck Sigma-AldrichA38800-1 g
AcetonitrileThermoFisher ScientificFSBA955-4Optima LC-MS כיתה
פורמט אמוניוםMerck Sigma-Aldrich516961-100 mL>99.995%
אנליסט TFSciexגרסה 1.7
תוכנת AnalyzerProספקטרל וורקס בע"מתוכנת עיבוד נתונים המשמשת לשלב 7.2. גרסה 5.7
AnalyzerPro XD sortwareSpectralWorks Ltd.תוכנת עיבוד נתונים המשמשת לשלב 7.5. גרסה 1.4
איזוןSartorius. דיוק באלאנס בע"מ
d6-חומצה טרנסקינמיתIsotec513962-250 מ"ג
חומצה פורמיתAjax Finechem Pty. Ltd.A2471-500 מ"ל
מייבש הקפאה 99% (Freezone 2.5 Plus)בקבוקי Labconco7670031
Glass Schott (100 מ"ל, 500 מ"ל, 1 ליטר)
בקבוקוני זכוכית (2 מ"ל) ומכסי מכסה בורג (חריץ מראש)Velocity Scientific SolutionsVSS-913 (בקבוקונים), VSS-SC91191 (מכסים)
ערכת התקנה עבור Sciex TripleToFSciexp/n 4456736
איזופרופנולThermoFisher ScientificFSBA464-4Optima LC-MS כיתה
מעבדה בלנדרWaring דגם מסחריHGBTWTS3
לאוצין-אנקפליןווטרסp/n 700008842כוונון
פתרון Metaboanalysthttps://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtmlצינור אנליטי מבוסס אינטרנט עבור מטבולומיקה בתפוקה גבוהה. כלי חינמי מבוסס אינטרנט. גרסה 4.0.
מתנולThermoFisher ScientificFSBA456-4Optima LC-MS
MiconazoleMerck Sigma-AldrichM3512-1 g
מיקרוצנטריפוגה (Eppendorf 5415R)Eppendorf (מופץ על ידי Crown Scientific Pty. Ltd.)5426 מס' 0021716
שפופרות מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל)SSIbio1310-S0
Microsoft Office ExcelMicrosoft
Peak ViewSciexגרסה 1.2 (64 סיביות)
קצות פיפטה (200 uL, 100 uL)ThermoFisher ScientificMBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)
פיפטות (200 uL, 1000 uL)צינורות צנטריפוגה מפלסטיק ThermoFisher Scientific
(15 מ"ל)ThermoFisher Scientific
Progenesis QINonlinear DynamicsSamll. גרסה 2.3 (64 סיביות)
Sciex 5600 ספקטרומטר מסה משולש ToFSciex
צינורות ליזה עם מכסה בורג (2 מ"ל) עם חרוזי קרמיקהBertin Technologies
Sodium formateMerck Sigma-Aldrich456020-25 גרם
ליזזר/הומוגניזר רקמותBertin Technologies0001620 סדרתי
צלוחיות נפח (10 מ"ל, 50 מ"ל, 100 מ"ל, 200 מ"ל, 1 ליטר)
מערבל מערבולתIKA Works Inc. (מופץ על ידי Crown Scientific Pty. Ltd.)001722
WaterThermoFisher ScientificFSBW6-4Optima LC-MS כיתה
מערכת Acquity LC של מים מצוידת במשאבות רבעוניותWaters
Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 עמודהWatersp/n 186005614
תוכנת תוכנת ניתוח גילוי מולקולות NUN339650

מקורות

  1. Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
  2. Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
  3. Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
  4. Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
  5. Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
  6. Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
  7. Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
  8. Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
  9. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  10. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72(2018).
  11. Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
  12. Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
  13. Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
  14. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  15. Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.