מאמר שיטה

המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח

DOI:

10.3791/60868

⸱

21 בפברואר 2020

 ,  ,  , 
1College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, 2Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר שיטות שונות הוקמו עבור חיסוני הקולנוע באמצעות נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח. כאן, אנו מתארים את השימוש של מיקרוגל בתיווך נוגדן בנוכחות של fluorophore-tyramide כדי לחסום נוגדנים לחצות את הנוגדן במהלך כתמים חיסוני במגה-בניין על formalin-קבוע מוטבע האדרנל העכבר סעיפים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיסוני משמש נרחב במחקר ביו להראות דפוס הביטוי הסלולרי של חלבון נתון. חיסוני מולטיפלקס מאפשר תיוג באמצעות נוגדנים ראשוניים מרובים. כדי למזער את הנוגדן החוצה פעילות, חיסוני המגה באמצעות מכתים עקיף דורש נוגדנים ראשוניים ללא תווית ממינים מארחים שונים. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים למינים שונים אינו תמיד זמין. כאן, אנו מתארים שיטה של שימוש בנוגדנים ראשוניים שאינם מסומנים מאותם מינים מארחים (למשל, במקרה זה שני נוגדנים הם מן הארנב) עבור מגנטים למגה-ונציה על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) עכבר סעיפים האדרנל. שיטה זו משתמשת באותו ההליך וריאגנטים המשמשים בשלב אחזור אנטיגן כדי להסיר את הפעילות של קומפלקס הנוגדן העיקרי שהיה מוכתם בעבר. השקופיות היו מוכתמות הנוגדן הראשוני הראשון באמצעות פרוטוקול חיסוני כללי ואחריו צעד מחייב עם נוגדן משני biotinylated. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת פיתוח האותות avidin-biotin-peroxidase באמצעות פלואורואופפור-טירומידה כמצע. הפעילות החיסונית של מתחם הנוגדן הראשוני הראשון הוסרו באמצעות טבילה בתמיסה הרתיחה של נתרן ציטראט במשך 8 דקות. התצהיר המולא-מסיסים, שנותר על המדגם, שאיפשר לשקופית להיות מוכתם בנוגדנים ראשוניים אחרים. למרות שיטה זו מבטלת את רוב האותות החיוביים השווא, חלק מהרקע של הנוגדן חוצה פעילות מחודשת עשוי להישאר. אם הדגימות מועשר בביוטין, נוגדן משני peroxidase מעלה עשוי לשמש כדי להחליף את הנוגדן המשני biotinylated כדי למנוע את חיובי שווא מן התאושש ביולוגי אנדוסוגני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתוך החומרים החיסונית, מכתים ישירות באמצעות נוגדנים ראשוניים מצוים יכול לספק תוצאות אינפורמטיביות. מבלי להשתמש בנוגדנים משניים, שיטת הצביעה הישירה מהווה סיכון נמוך לאותות לוקליזציה מזוייפים מנוגדן לפעילות מחודשת. עם זאת, הכתבים הצוחיים (fluorophore אנזימים) או ביוטין על הנוגדן הראשוני מגביל את השימוש העתידי שלה. לחילופין, חיסוני עקיף מספק בדרך כלל אותות חזקים יותר באמצעות נוגדן ראשוני ללא מעלה עם נוגדן משני מתויג. באופן אידיאלי, נוגדנים ראשוניים בלתי מצובאים בשימוש בבית החומרים החיסוני צריך לבוא ממינים שונים של מארחים כדי להימנע מפני הנוגדנים החוצה פעילות. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים ראשוניים ממינים מארחים שונים אינו תמיד זמין.

מספר שיטות הוקמו כדי לחסל את הסיכון של הנוגדן המשני המגיבים עם נוגדן ראשוני בלתי רצוי. אחת השיטות הנפוצות היא השימוש ב-F (ab) נוגדן monomeric לחסום את כל אפיסקופים הכריכה הנותרים על מתחם הנוגדן הראשוני הראשון לפני הצביעת עם הנוגדן העיקרי השני1. הנוגדן בנוכחות, אשר דומה לרצועה ומחדש של גיליון כתמים מערבי, מסיר את מתחם הנוגדן הקודם ויטראז מבלי להתפשט את התצהיר של מולקולות עיתונאי לזיהוי כגון 3, 3 '-diaminobenzidine (לפרק)2 ו-פלורסנט tyramide התצהיר3. בשיטה זו, מולקולות עיתונאי בצבעים שונים יכולות להציג את התוצאה של השקופית באותה שקופית. הצביעת של מולטיפלקס הינה גם השגה מוחלטת של שכבות הנוגדנים שהופקדו קודם לכן והיישור של תמונות שנרכשו לאחר מכן מנוגדנים אחרים4,5. שיטות אלו נותנות תוצאות אמינות, אם כי לכל שיטה יש מגבלות והיא דורשת הליכים מסובכים או מערכת דימות מיוחדת.

הפרוטוקול הנוכחי מציג את היישום של נוגדן שיטת החשפנות עם שימוש של מאגרים זמינים בדרך כלל. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של מרכיבים מגנטים לשימוש באמצעות משטחי האדרנל (FFPE) עם שני נוגדנים ראשוניים שאינם מתויגים מאותו זן מארח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כתמים עם הנוגדן הראשון

  1. Dewax עווה ומימה מחדש מגלשות ffpe עם 5 דקות מוקצה לכל אחד השלבים הבאים: קסילן או המקבילה ריאגנטים 3x, 100% אתנול 2x, 95% אתנול 1x, 70% אתנול 1x, 50% אתנול 1x, ו מים מזוקקים 2x.
    הערה: שקופיות צריכות להישאר לחות החל משלב מחדש זה עד להרכבה בשלב הסופי.
  2. עבור אחזור אנטיגן אופציונלי, מניחים את השקופיות ב 275 mL של תמיסת נתרן ציטראט רותחים (10 מ"מ, pH = 6.0) עבור 8 דקות. כדי לשמור על הפתרון רותח, למקם את השקופיות שטוח בתחתית של 14 x 9.5 x 9 ס מ3 (W x L x H) בתיבת עצה עם מכסה ומיקרוגל את הפתרון על 70% כוח במיקרוגל 700 W מיקרוגל עבור 8 דקות. לאחר מכן להסיר את תיבת הקצה של הפיפטה מהתנור, לפתוח את המכסה, ולתת לפתרון להתקרר בטמפרטורת החדר (RT) לפחות 20 דקות.
  3. העבר את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכילה PBST (מלוחים באגירה פוספט עם 0.1% polysorbate 20/80). לשטוף עם PBST עבור 5 דקות 3x. אם לא לעבור מיד לשלב הבא, לאחסן את השקופיות בשלב זה עם PBST בצנצנת Coplin ב-RT במשך כמה שעות או ב 4 ° c עבור 1-2 ימים, אם לא מעביר מיד לשלב הבא.
  4. כדי להכין את הפתרון חסימה להשתמש בסרום נורמלי של המינים המארחים של הנוגדן המשני כמו מגיב החסימה. אחרים לחסימת מסחריים ריאגנטים יכול לשמש גם. אם באמצעות סרום רגיל מועסק למחקר הציג במחקר זה, להוסיף 100 μL של סרום חמור נורמלי 4.9 mL של PBST. ניתן לאחסן את פתרון החסימה ב -4 ° c עד 3 ימים.
  5. כדי לחסום חסימה, הרעד את PBST מהשקופיות והתכסה אותם במהירות בפתרון חסימות מספיק. מודקון את השקופיות ב-RT בחדר מחולל לחות במשך 30 דקות.
  6. הכן את פתרון הנוגדן העיקרי (500 μL עבור שתי שקופיות) באמצעות פתרון חסימת כדי לדלל את הנוגדן העיקרי לריכוז הרצוי. הפתרון צריך להיות מאוחסן על הקרח עד השימוש.
    1. עבור 3βHSD, להוסיף 2 μL של 3βHSD לתוך 498 μL של פתרון חסימה.
    2. עבור TH, להוסיף 0.5 μL של הנוגדן ל 499 μL של פתרון חסימה.
    3. עבור β-catenin, להוסיף 1 μL של β-catenin נוגדן לתוך 499 μL של פתרון חסימה.
    4. עבור 20αHSD, להוסיף 1 μL של 20αHSD נוגדן לתוך 499 μL של פתרון חסימה.
    5. עבור CYP2F2, להוסיף 2 μL של נוגדן CYP2F2 לתוך 498 μL של פתרון חסימה.
  7. דגירה עם הנוגדן העיקרי על ידי לטלטל את פתרון חסימת מהשקופיות, ובמהירות לכסות אותם עם פתרון הנוגדן העיקרי מספיק. מחלל את השקופיות בתא מחולל לילה ב -4 ° c. במהלך הדגירה השקופיות עשויות להיות מכוסות על ידי פיסת סרט פרפין קטן כדי למנוע ייבוש.
  8. למחרת בבוקר לשטוף את השקופיות עם PBST עבור 5 דקות 3x.
  9. להכין את הפתרון נוגדן משני (500 μL עבור שתי שקופיות) באמצעות פתרון חסימת לדלל את הנוגדן המשני biotinylated לריכוז הרצוי (למשל, 1 μL של החמור נגד העכבר נוגדן או החמור נגד הארנב נוגדן לתוך 499 μL של חסימת פתרון). הפתרון צריך להיות מאוחסן על הקרח עד השימוש.
  10. דגירה עם הנוגדן השני על ידי לטלטל את PBST מן השקופיות ובמהירות לכסות אותם עם פתרון נוגדן משני מספיק. מחלל את השקופיות בחדר מחולל לחות במשך 1 h ב RT.
    הערה: אם ביוטין אנדוגניים היא דאגה, להשתמש בנוגדן משני peroxidase במקום הנוגדן המשני ביולוגי. לקפוץ לשלב 1.14 אם באמצעות נוגדן משני מעלה מperoxidase בשלב 1.10.
  11. שטוף את השקופיות עם PBST עבור 5 דקות 3 x.
  12. הכינו את הperoxidase מstreptavidin (SA-HRP) פתרון (500 μL עבור שתי שקופיות) על-ידי הוספת 0.5 μL של SA-HRP לתוך 499 μL של PBS. הריכוז הסופי הוא 1 μg/mL.
  13. דגירה עם פתרון SA-HRP. הרעד את PBST מהשקופיות ובמהירות לכסות את השקופיות עם פתרון SA-HRP מספיק. מודטה את השקופיות בחדר מחולל לחות עבור 0.5 h ב RT.
  14. שטוף את השקופיות עם PBST עבור 5 דקות 3 x.
  15. להכין את הפתרון fluorophore-טייקו על ידי דילול fluorophore-tyramide עם מאגר הדילול שלה על פי הוראות היצרן (למשל, 5 μL של פלואור-tyramide לתוך 496 μL של מאגר דילול).
  16. לבצע את פיתוח האות עם fluorophore-tyramide על ידי לטלטל את PBST מן השקופיות ובמהירות לכסות את השקופיות עם הפתרון fluorophore מספיק-ty,. דגירה בחדר מחולל לחות במשך 1 דקות בשעה RT. זמן הדגירה עשוי להיות מותאם כדי לקבל את עוצמת הקרינה הרצויה. הפסיקו את התגובה על ידי העברת השקופיות לצנצנת של קופלין המכילה את PBST. לשטוף שקופיות עם PBST עבור 3 דקות 2x.
  17. אותות ניתן לבדוק במהירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לאשר את התוצאה בשלב זה. אם לא נעשה שימוש בכיסויים, החל טיפה של גליצרול: PBS (1:1) על כל קטע כדי לשמור על הדגימות לחות. לשטוף שקופיות עם PBST עבור 3 דקות 2x. ניתן לאחסן שקופיות ב-PBST ב-4 ° c למשך מספר ימים לפני המעבר לשלב הבא.

2. להסיר את הנוגדן הראשון

  1. מניחים את השקופיות ב 275 מ ל של תמיסת נתרן ציטראט רותחים (10 מ"מ, pH = 6.0) לפחות 8 דקות. שמור על הפתרון רותח על ידי הצבת שקופיות שטוח בתחתית של 14 x 9.5 x 9 ס מ3 (W x L x H) התיבה עצה עם מכסה למיקרוגל את הפתרון על 70% כוח במיקרוגל 700 W עבור 8 דקות. אם זמן החשפנות ארוך יותר הוא מועדף, ייתכן שיידרש להוריד את המאגר באמצעות פתרון נתרן ציטראט רותח כדי לשמור את השקופיות שקועים בפתרון המאגר בכל עת. הסר את תיבת הקצה של הפיפטה מהתנור, פתח את המכסה, ותן לפתרון להתקרר ב-RT במשך 20 דקות לפחות.
  2. להעביר את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכילה PBST. לשטוף עם PBST עבור 5 דקות 3x. אם השלב הבא אם לא יבוצע באופן מיידי, אחסן את השקופיות בצנצנת Coplin עם PBST ב-RT למשך מספר שעות או ב-4 ° c במשך 1-2 ימים.

3. כתם עם הנוגדן השני

  1. התחל משלב החסימה ובצע את אותן הליכים בשלב 1.5 דרך שלב 1.14. בשלבי פיתוח האותות (שלב 1.15 ו-שלב 1.16), השתמש בפלואורופור-טירמידה בספקטרום של זריחה שונה.
    הערה: ניתן לחשוף שקופיות באמצעות שיטה זו מספר פעמים כדי לאפשר כתמים של מולטיפלקס. הנוגדן האחרון אינו דורש. פלואורופפור-טירמידה ככתבת נוגדן משני מצופף מעלה עשוי לשמש כדי להראות אותות מן הנוגדן העיקרי האחרון.
  2. שקופיות דגירה עם 2 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) או הכולל פתרון עבור 1 דקות ב-RT אם יש צורך בצביעת מונה גרעיני. לאחר מכן שטוף את השקופיות עם PBST עבור 3 דקות 2x.

4. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לזהות אותות

  1. הר שמיכות עם טיפת מדיום הרכבה מתאים לאימונולוורבורסנס.
  2. לדימות, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לזהות אותות של כל ערוץ הזריחה. התחל עם ערוץ הצביעת הגרעיני (DAPI) ועדשת 4x כדי לאתר את הרקמה בשקופית.
  3. מעבר לעדשת 10x לדימות. כוונן את זמן החשיפה (300 אלפיות הראשונה) ועוצמת מקור האור (80% אינטנסיביות). התאם הגדרות אלה אם האות בהיר מדי או כהה מדי. צלם תמונות של כל אחד מהערוצים מבלי להזיז את הבמה. ייתכן שיהיה צורך בהתמקדות מחדש עבור כל ערוץ. מזג את התמונות מכל אחד מהערוצים באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות התקבלו מדגימות שטופלו עם כל השלבים שתוארו כולל האחזור אנטיגן שלב 1.2. כל הנוגדנים המשניים. ששימשו כאן היו ביולוגיים פלואור שימש לפיתוח אותות מהנוגדנים הראשוניים הראשונים והשניים. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד קוביית FITC (עבור זריחה ירוקה), קוביית TxRED (עבור Cy3), ו קוביית DAPI (עבור DAPI).

התפשטות המיקרוגל מבטלת את הפעילות הצולבת.
העכבר סעיפים FFPE האדרנל היו מוכתם באמצעות שני נו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתמים חיסוני מולטיפלקס שימושי כדי לבחון את ההתאמה התאית של שני אנטיגנים או יותר. טכניקה זו בשימוש נרחב נותן תוצאות משכנעות לוקליזציה כאשר נוגדנים העיקרי הם מצועם כתבים שונים (כתמים ישירים). עם זאת, מכתים ישירה בדרך כלל מספק אותות חלשים יותר לעומת כתמים עקיפים, אשר כרוך נוגדנים משניים מצופני מעלה כדי לזהות את הנוגדנים העיקריים. באמצעות כתמים עקיפים, התוצאה באיכות גבוהה מכתים החומרים מסתמך אם הנוגדנים המשניים יכולים להבחין בין הנוגדנים העיקריים השונים. בשל הנוגדן האפשרי צלב הפעילות, מגוון הצביעת ניצול שיטת מכתים עקיף הוא נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R00 HD032636.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
חמור ביוטיניל נגד עכברJacksonImmuno715-066-1511:500 דילול
חמור ביוטיניל נגד ארנבJacksonImmuno711-066-1521:500 דילול
DAPIBioLegend4228012 μ גרם/מ"ל במים מזוקקים
מיקרוסקופ פלואורסצנטיECHORevolve 4
סטרפטווידין מצומד חזרת פרוקסידאזג'קסון Immuno016-030-0841:1,000 דילול
תנור מיקרוגל, 700 Wג'נרל אלקטריקJEM3072DH1BB
עכבר אנטי-CYP2F2סנטה קרוזSC-374540דילול
עכבר אנטי-THסנטה קרוזSC-252691:1,000 דילול
סרום חמור רגילJacksonImmuno017-000-1212% סרום ב-PBST
ארנב אנטי-20&אלפא; HSDKerafastEB40021:500 דילול
ארנב אנטי-3&בטא; HSDTransGenicKO6071:250 דילול
ארנב אנטי-THNOVUSNB300-1091:1,000 דילול
ארנב אנטי-&בטא;-cateninAbcamab325721:500 דילול
סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1,000 דילול
TSA Cy3 טירמידפרקין אלמרSAT704B001EAדילול של 1:100
TSA פלואורסצאין טירמידפרקיןאלמרSAT701001EAדילול של 1:100

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043(2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FFPE

מאמרים קשורים