מאמר שיטה

עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי

DOI:

10.3791/60886

⸱

23 באפריל 2020

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, Elizabethtown College, 2Department of Psychiatry, Yale University, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לתפעל ישירות קולטני אזור tegmental גחוני ללמוד את תרומתם לשחרור דופמין תת שנייה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס ממלא תפקיד מרכזי בעיבוד תגמול ולמידה חיזוק. הבנת האופן שבו התשומות העצביות המגוונות לתוך שחרור DA פאזי של בקרת VTA יכולה לספק תמונה טובה יותר של המעגלים השולטים בעיבוד תגמול ולמידת חיזוק. כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת חליטות צינוריות פנים-VTA של אגוניסטים ואנטגוניסטים רוקח עם שחרור DA פאזי מעורר גירוי (עירוי וגירוי משולב, או CIS) כפי שנמדד על ידי voltammetry מחזורי סריקה מהירה (FSCV). באמצעות CIS-FSCV בחולדות מרדים, תגובת DAphasic יכול להיות מעורר על ידי גירוי חשמלי VTA עם אלקטרודה דו קוטבית מצוידת צינורית תוך הקלטה בליבת גרעין האקומבנס. אגוניסטים רוקח או אנטגוניסטים ניתן להחדיר ישירות באתר הגירוי כדי לחקור תפקידים ספציפיים של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic. היתרון העיקרי של CIS-FSCV הוא כי תפקוד קולטן VTA ניתן ללמוד ב vivo, בניית מחקרים במבחנה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס (NAc) ממלא תפקיד חיוני בהתנהגויות הקשורות לתגמול. נוירונים VTA DA לעבור מירי דמוי טוניק (3-8 הרץ) לירי דמוי פרץ (>14 הרץ)1, אשר מייצר שחרור DA פאזי ב- NAc. VTA מבטא מגוון של קולטנים סומטונדריטיים הממוקמים היטב כדי לשלוט על המתג מטוניק לפרץירי 2,3,4,5. זיהוי אילו קולטנים אלה, והתשומות המתאימות להם, שחרור DA פאזי שליטה יעמיקו את הבנתנו כיצד מאורגנים המעגלים הקשורים לתגמול. מטרת המתודולוגיה המתוארת כאן, עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV), היא להעריך במהירות ובחזקה את הפונקציונליות של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic.

המונח עירוי וגירוי משולבים (CIS) מתייחס קולטנים מניפולציה פרמקולוגית על קבוצה של נוירונים (כאן VTA) וממריץ נוירונים אלה ללמוד את תפקוד הקולטן. בחולדה המרדים, אנו מעוררים חשמלית את ה- VTA לעורר אות DA פאזי גדול (1-2 מיקרומטר) בליבת NAc, כפי שנמדד על ידי וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (FSCV). חליטות של תרופות פרמקולוגיות (כלומר, אגוניסטים קולטן/אנטגוניסטים) באתר הגירוי ניתן להשתמש כדי למדוד את הפונקציה של קולטני VTA על ידי התבוננות בשינוי הבא בשחרור DA פאזי מעורר. FSCV היא גישה אלקטרוכימית הנהנית הן מרחבית גבוהה (50-100 מיקרומטר) והן רזולוציה זמנית (10 הרץ), ומתאימה היטב למדוד אירועי DA פאזיים הקשורים לתגמול6,7. רזולוציה זו עדינה יותר ממדידות נוירוכימיות אחרות של vivo, כגון מיקרודיאליזה. לכן, יחד, CIS-FSCV מתאים היטב כדי להעריך ויסות קולטן VTA של שחרור דופמין פאזי.

דרך נפוצה אחת לחקור את תפקוד קולטן VTA היא באמצעות שילוב של גישות אלקטרופיזיולוגיות המטפלות באופן שבו קולטנים אלה משנים את קצב הירי של נוירונים1,8. מחקרים אלה הם בעלי ערך רב בהבנת מה קולטנים מעורבים בהנעת DA ירי בעת ההפעלה. עם זאת, מחקרים אלה יכולים רק להציע מה עלול לקרות במורד הזרם במסוף אקסון (כלומר, שחרור של נוירוטרנסמיטר). CIS-FSCV בונה על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה על ידי מענה כיצד הפלט של VTA פרץ ירי, שחרור DA פאזי, מוסדר על ידי קולטנים הממוקמים על דנדריטים VTA וגופי תאים. לכן, CIS-FSCV מתאים היטב לבנות על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה. כדוגמה, הפעלת קולטן nicotinic יכול לגרום יריפרץב VTA 9 , ו CIS-FSCV בחולדה מרדים שימש כדי להראות כי קולטן אצטילכולין nicotinic (nAChR) הפעלת VTA גם שולט שחרור DA פאזי ב NAc10,11.

בדיקה מכנית של רגולציה DAphasic נלמד גם בדרך כלל באמצעות תכשירי פרוסה יחד עם יישום אמבטיה של תרופות. מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות ברגולציה presynaptic של שחרור DAphasic מסופי דופמין, כמו גופי התא מוסרים לעתים קרובות מן הפרוסה12. תכשירים אלה הם בעלי ערך לחקר השפעות קולטן presynaptic על מסופי דופמין, בעוד CIS-FSCV מתאים יותר ללמוד השפעות קולטן סומטונדריטי על נוירונים דופמין, כמו גם תשומות presynaptic ל- VTA. הבחנה זו חשובה, כי הפעלת קולטן somatodendritic ב- VTA עשוי להיות השפעה שונה מאשר הפעלת קולטן פרסינפטי NAc. ואכן, חסימת דופאמין presynaptic nAChRs ב NAc יכול להעלות את שחרור דופמין פאזי במהלך פרץ ירי13, ואילו ההפך נכון VTA somatodendritc nAChRs10,11.

CIS-FSCV היא גישה אידיאלית לחקר היכולת של קולטני VTA לווסת את שחרור DA פאזי. חשוב לציין, גישה זו יכולה להתבצע בחולדה שלמה, או מרדים או לנוע חופשי. גישה זו מתאימה למחקרים חריפים, כדי לחקור את תפקוד הקולטן במצב הבסיסי שלה10,14, כמו גם מחקרים ארוכי טווח שיכולים להעריך שינויים תפקודיים קולטן לאחר חשיפה לסמים או מניפולציה התנהגותית11,15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים נערכו על פי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו הן על ידי מכללת אליזבתטאון והן על ידי אוניברסיטת ייל מוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה לטיפול בבעלי חיים (IACUC). פרוטוקול זה הוא ספציפי להכנת חולדה מרדים של ניצול CIS-FSCV.

1. הכנות פרסוקרתיות

  1. הכנת פתרון אלקטרודה
    1. כדי להפוך את פתרון מילוי גב אלקטרודה, להכין פתרון של 4 M אשלגן אצטט עם 140 mM אשלגן כלורי16.
  2. הכנת אלקטרודה
    1. באמצעות שאיבה ואקום, הכנס סיבי פחמן T-650 (7 מיקרומטר קוטר) לתוך נימי זכוכית בורוסיליקט (אורך = 100 מ"מ, קוטר = 1.0 מ"מ, קוטר פנימי = 0.5 מ"מ).
    2. לאחר סיבי הפחמן הונח בתוך נימי הזכוכית, מניחים את נימי הזכוכית לתוך פולר אלקטרודה אנכי, עם אלמנט החום בערך באמצע הנימי. הגדר את התנור ל 55 עם המגנט כבוי.
    3. לאחר הנימי נמשך, בזהירות להעלות את מחזיק נימי העליון, כך קצה האלקטרודה אינו מוקף גוף חימום.
    4. בעזרת מספריים חדים, חותכים את סיבי הפחמן שעדיין מחברים בין שתי חתיכות הנימי. התוצאה תהיה שני מיקרואלקטרודים נפרדים של סיבי פחמן.
    5. תחת מיקרוסקופ קל, לחתוך בזהירות את סיבי הפחמן החשופים עם אזמל חד, כך סיבי הפחמן משתרע כ 75-100 מיקרומטר מעבר לסוף הזכוכית.
    6. באמצעות מיקרוסקופ אור, ודא כי האלקטרודה היא ללא סדקים לאורך נימי. כמו כן, להבטיח כי החותם, שבו סיבי הפחמן יוצא נימי, קשה להבחין ללא סדקים.
      הערה: חותם טוב יעזור להפחית רעש במהלך ההקלטות. ראה מחקרים שפורסמו17,18,19 לפרוטוקול מפורט יותר.
  3. ייצור אלקטרודה ייחוס
    1. הלחמה סיכת זהב לחוט כסף 5 ס"מ.
    2. חבר את האנודה למהדק נייר ממתכת או למוליך אחר, הקתודה לסיכה, והחל מתח (~ 2 V) בעוד מהדק הנייר וחוט הכסף שקועים ב- 0.1 M HCl.
    3. הפסק את המתח ברגע שציפוי לבן (AgCl) מופיע על חוט הכסף.
  4. הכנת אלקטרודה להשתלת
    1. הלחמה סיכת זהב לחוט מבודד דק (אורך ~ 10 ס"מ, קוטר <0.50 מ"מ).
    2. הסר ~ 5 ס"מ של בידוד מן החוט מול סיכת הזהב.
    3. מלא את האלקטרודה בערך באמצע הדרך עם פתרון אלקטרודה.
    4. הכנס חוט מבודד לתוך האלקטרודה.
      הערה: החוט צריך ליצור קשר עם סיבי הפחמן בתוך האלקטרודה.

2. השתלות אלקטרודה

  1. תן לחולדות בוגרות, זכריות, ספראג דולי (250−450 גרם) הזרקה תוך-איטרא-איטרציונלית (1.5 גרם/ק"ג או נפח של 1 מ"ל/ק"ג) של 0.5 גרם/מ"ל אורתאן מומס בתמיסת מלח סטרילית. התחל עם מינון הurethane הראשוני של 1.0−1.2 גרם/ק"ג. אם החיה עדיין מגיבה לבדיקת הגירוי הרעיל (צביטת זנב) 20 דקות לאחר מתן השופכה, יש צורך במנה כוללת נוספת של 0.3−0.5 גרם/ק"ג עבור מנה כוללת של 1.5 גרם/ק"ג.
    הערה: להכנת פתרון אורתאן 0.5 גרם / מ"ל, להוסיף 10 גרם של אורתאן כדי 10 גרם (~ 10 מ"ל) של מלוחים. אורתאן הוא מסרטן ויש לטפל בו בזהירות. אורתאן הוא הרדמה חשובה, כפי שהוא אינו משנה את רמות הדופמין, כמו גם הרדמה אחרת כגון קטמין / קסילאסין וכלורל הידרציה20,21.
  2. ברגע שהחיה היא מרדימה עמוקה ואינה מגיבה לגירויים מזיקים (למשל, צביטת בוהן), מניחים אותה במסגרת הסטריאוטקסית. יש למרוח חומר סיכה עיניים על כל עין של החולדה.
    הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדות, אך מעודדים טכניקה אספטית טובה.
  3. נקה את הקרקפת של החולדה באמצעות קרצוף דו-שלבי (כלומר, קרצוף iodopovidone ואחריו קרצוף אתנול 70%; לבצע עם חזרה 3 מחזור).
  4. חותכים את רקמת הקרקפת באמצעות פינצטה של האף מחט מעוקר ומספריים כירורגיות. הסר כמות משמעותית של רקמה כדי לפנות מקום להשתלות השונות המתוארות להלן.
  5. יש לנקות בעדינות את משטח הגולגולת באמצעות אפליקטורים מעוקרים של קצה כותנה. לאחר מכן להחיל 2−3 טיפות של 3% מי חמצן כדי לעזור לזהות את lambda ו bregma.
  6. באמצעות מקדחה סטריאוטקסית או ידנית (1.0 מ"מ, כ-20,000 סל"ד), מקדחים חור בקוטר 1.5 מ"מ בקוטר 2.5 מ"מ, 2.5 מ"מ, לרוחב ברגמה. חלקית (בערך באמצע הדרך, עד שהוא יציב במקום) להשתיל בורג (1.59 מ"מ O.D., 3.2 מ"מ ארוך) בחור זה. מומלץ להשתמש מלוחים סטריליים להשקיה בעת הקידוח כדי למנוע פגיעה תרמית.
  7. עבור אלקטרודה הייחוס, לקדוח חור בקוטר 1.0 מ"מ 1.5 מ"מ קדמי ו 3.5 מ"מ לרוחב ברגמה, בחצי הכדור השמאלי.
  8. ביד, להכניס ~ 2 מ"מ של חוט התייחסות לתוך החור הזה, תוך גלישת חוט הייחוס סביב ומתחת לראשו של הבורג המושתל.
  9. להשתיל את הבורג באופן מלא, מצמיד את אלקטרודה הייחוס במקום.
  10. בחצי הכדור הימני, לקדוח חור בקוטר 1.5 מ"מ 1.2 מ"מ קדמי ו 1.4 מ"מ לרוחב ברגמה.
  11. הסר בעדינות את הדורה באמצעות פינצטה.
  12. עבור האלקטרודה הממריצה, לקדוח חור מרובע (2 מ"מ הקדמי-אחורי, 5 מ"מ מ"מ מנדל-לרוחב) מרוכז 5.2 מ"מ אחורי ו 1.0 מ"מ לרוחב ברגמה.
  13. באמצעות מוטות הזרוע הסטריאו-פקטיים, הורידו את הצינורית המעוררת/מדריך הדו-קוטבית 5 מ"מ מתחת לדורה. במקרה של דימום במהלך ההשתלה של האלקטרודה, להשתמש צמר גפן סטרילי גזה כדי למזער את הדימום.
    הערה: האלקטרודה הממריצה הדו קוטבית המשמשת בשיטה זו מותאמת מראש עם צינורית מדריך(טבלת חומרים). הצינורית הפנימית המשמשת עם פריט זה צריך להיות סמוק עם ניחני האלקטרודה מגרה דו קוטבי כאשר מוכנס במלואו לתוך צינורית המדריך. זה יאפשר את הצינורית הפנימית לשבת ישירות בין שני חוד החנית של הממריץ, אשר יושבים על 1 מ"מ זה מזה. פרוטוקול דומה מתואר במקום אחר14.
  14. באמצעות מוטות הזרוע הסטריאו-טסטרואטקטיים, הורידו את מיקרו-המיקרו-קטרוד של סיבי הפחמן 4 מ"מ מתחת לדורה. מיקום זה נמצא בחלק החלק החלקי ביותר של הסטריאטום.
  15. חבר את חוט הייחוס וסיבי הפחמן לפוטנציוסטט.
  16. החל צורת גל משולשת (-0.4−1.3 V, 400 V/s) למשך 15 דקות ב-60 הרץ, ושוב למשך 10 דקות ב-10 הרץ.
    הערה: בדרך כלל, בעת החלת צורות גל על מיקרו-ectrodes סיבי פחמן במוח, קבוצות תחמוצת מתווספות לפני השטח של סיבי הפחמן. יש להגיע לשיווי משקל של תגובה זו לפני ההקלטה; אחרת סחיפה משמעותיתתתרחש 19. רכיבה על אופניים האלקטרודה בתדרים גבוהים יותר (60 הרץ) מאפשר סיבי הפחמן להשיג שיווי משקל מהר יותר.

3. אופטימיזציה של סיבי פחמן וממריץ מיקומי צינוריות אלקטרודה/מדריך

  1. הגדר את הממריץ כדי לייצר צורת גל חשמלית דו קוטבית, עם תדר של 60 הרץ, 24 פולסים, זרם 300 μA ורוחב דופק של 2 אלפיות שניים / פאזה.
  2. הוריד בעדינות את הממריץ במרווחים של 0.2 מ"מ מ-5 מ"מ ל-7.8 מ"מ מתחת לדורה. בכל תוספת, לעורר את VTA.
    הערה: בעומקים יותר של עור (5−6 מ"מ), גירוי המוח בדרך כלל (~ 80% מהזמן) לגרום לשפם של החולדה להתעוות. בעומקים נוספים, השפם יפסיק עוויתות, אשר מתרחשת בין 7.5−8.2 מ"מ מתחת לדורה. כאשר השפם מפסיק להתעוות, האלקטרודה הממריצה תהיה קרובה או ב- VTA. זה לא יקרה בכל חולדה, וחוסר עוויתות שפם לא צריך להיחשב כסימן כי צינורית אלקטרודה / עירוי מגרה דו קוטבי אינו במקומו. עוויתות שפם לא יכול להתרחש עבור כל ההרדמה (למשל, איזופלוראן).
  3. המשך להוריד את הצינורית האלקטרודה/מדריך המעוררת הדו-קוטבית עד שגירוי מייצר שחרור DA פאזי במיקרו-קטרודת סיבי הפחמן (שנמצאת כיום בסטריאטום גב).
    הערה: שחרור DA בסטריאטום גב לא תמיד יתרחש אם האלקטרודה הדו קוטבית מושתלת ב- VTA, אבל התבוננות בשחרור DA בסטריאטום גב על גירוי VTA הוא בדרך כלל סימן טוב כי אות טוב יהיה נצפה בליבת NAc.
  4. מנמיכים את סיבי הפחמן מיקרו-קטרוד עד שהוא לפחות 6.0 מ"מ מתחת לדורה. זהו החלק הכי גדול של ליבת NAc.
  5. לעורר את VTA ולתעד את משרעת השיא של שיא DA.
  6. להנמיך או להעלות את microelectrode סיבי פחמן באתר המייצר את שחרור DA הגדול ביותר.
  7. ודא כי שיא התגובה DA הוא שיא חמצון ברור ב 0.6 V ושיא הפחתה ב -0.2 V. פסגות אלה מעידות על DA.

4. שילוב עירוי וגירוי FSCV הקלטה

הערה: איור 1 מציג את ציר הזמן להקלטה לפני ואחרי מיקרו-fusion VTA.

  1. לאחר סיבי פחמן ומיקום צינורית אלקטרודה / מדריך מגרה כבר אופטימיזציה, לעורר במשך ~ 20−30 דקות.
    הערה: תחת הפרמטרים הגירוי הנוכחי, לא לעורר יותר מפעם אחת בכל 3 דקות, כדי לאפשר טעינה מחדש של כלי רכב22.
  2. לאחר השגת בסיס יציב (<20% וריאציה על פני חמישה גירויים), בעדינות להוריד את הצינורית הפנימית ביד לתוך צינורית המדריך כי הוא prefitted לתוך ממריץ דו קוטבי.
  3. קח הקלטות בסיסיות נוספות של 2−3 כדי להבטיח שהכנסת הצינורית עצמה לא גרמה לשינוי באות המעורר. במקרים מסוימים, החדרה והסרה של הצינורית הפנימית יכול לגרום נזק VTA. אם האות משתנה באופן דרסטי במהלך תקופת בסיס זו (>20%), יש לבצע הקלטות נוספות של 3−4 עד לשחזור הבסיס.
  4. באמצעות משאבת מזרק ומיקרו-מזרק, להחדיר 0.5 μL של פתרון (למשל, 0.9% מלוחים, N-מתיל-D-אספרטט [NMDA], (2R)-אמינו-5-חומצה פוספונובלרית [AP5]) לתוך VTA על פני תקופה של 2 דקות.
  5. לאחר ההדבקה, להשאיר את הצינורית הפנימית לפחות 1 דקות לפני ההסרה.
    הערה: תרופות מסוימות עשויות לדרוש עזיבת הצינורית הפנימית במשך זמן רב יותר בהתבסס על קינטיקה סמים, והסרת הצינורית הפנימית עלולה לגרום לתרופה לנסוע בחזרה דרך הצינורית הפנימית. אם יש חשש, אפשר להשאיר את הצינורית הפנימית ב צינורית המדריך במהלך כל ההקלטה. אחרת, ההקלטה יכולה להתחיל לאחר מרווח זמן של דקה אחת.
  6. המשך להקליט כל 3 דקות כדי למדוד אפקטים לאחר ההנפצה.
    הערה: אם מחדיר פתרון בקרה, ולא נצפתה השפעה, ניתן להחדיר בפעם השנייה10. אם יש שחרור DA שונה הנגרמת על ידי החדרת צינורית פנימית או עירוי מלוחים, האות בדרך כלל מתאושש לקו הבסיס בתוך 30 דקות.

5. אימות היסתולוגי של מיקום אלקטרודה

  1. בסוף הניסוי, ליצור נגע קטן באתר ההקלטה באמצעות microelectrode סיבי פחמן.
    1. אם יש לשמר את האלקטרודה לכיול לאחר הניסיון, השתמש בחוט טונגסטן המוצב בני נימי זכוכית הבולט ~ 100 מיקרומטר מעבר לקצה הנימי. במקרה זה, להעלות את האלקטרודה מהמוח, להחליף את אלקטרודה ההקלטה עם אלקטרודה טונגסטן, ולהוריד אותו לאותה קואורדינטות דורסוונטרליות.
      הערה: סיבי הפחמן עשויים לשמש נגע גם למוח ויספקו ייצוג מדויק יותר של המיקום של אתר ההקלטה; עם זאת, הנסיין יאבד את היכולת לכייל אלקטרודות אלה.
  2. כדי לצל את אתר ההקלטה, להחיל מתח באמצעות ספק כוח. התחל ב- 1 V והגדל ב- 1 V כל 10 s עד 10 V.
  3. המתת חסד החיה באמצעות זריקה תוך-איפריטונית קטלנית של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג).
  4. לנטרל את החולדה באמצעות פתרון פורמלין 4%.
  5. הסר את הראש מן החולדה באמצעות גיליוטינה מחודדת.
  6. באמצעות rongeurs, להסיר את רקמת החיבור ואת הגולגולת המקיפה את המוח, בעדינות להוציא את המוח מכל רקמה שנותרה.
  7. לאחסן את המוח ב 4% פורמלין ליום אחד ולאחר מכן להעביר אותו ל 30% סוכרוז.
    הערה: זלוף עם 4% פורמלין אין צורך לראות את אתר הנגע, אם כי כתרגול הטוב ביותר זה ישפר את השחזור של אתר הנגע.
  8. צור 30 פרוסות מיקרומטר של המוח באמצעות cryostat.
  9. הרנו את הפרוסות על שקופיות וכסו במכתר כיסוי.
  10. ציין את המיקום של נגע microelectrode סיבי פחמן ומעורר דו קוטבי / צינורית עירוי באמצעות מיקרוסקופ אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CIS-FSCV שימש כדי ללמוד את הפונקציה של קולטני VTA N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR), קולטני אצטילכולין nicotinic (nAChRs), וקולטנים אצטילכולין muscarinic (mAChRs) בנהיגה שחרור DA פאזי בליבת NAc. איור 2 מציג נתונים מייצגים לשליטה שלילית, עירוי של 0.9% תמיסת מלח, לפני (בסיסי) ו-9 דקות לאחר התפוגגות (מלוחים). איור 2 מציג התוויית צבע עם פוטנציאל בציר ה-y, זמן בציר ה-x וזרם (המיוצג כצבע כוזב) בציר z, עקבות נוכחיות לעומת זמן (IvT), וכן וולטמוגרמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CIS-FSCV מספק הזדמנות ייחודית לחקור מנגנוני קולטן VTA שבבסיס שחרור DA פאזי. ישנם שני שלבים קריטיים על מנת להבטיח הקלטה נכונה. ראשית, יש להשיג הקלטה בסיסית יציבה, עם מעט סחיפה באות DA המעורר. דרך חשובה להגדיל את הסבירות להקמת הקלטה יציבה היא להבטיח כי האלקטרודה היה מספיק זמן מחזור הן 60 הרץ ו 10 הרץ (בדרך כלל 15 דקות ב 60 הרץ, ו 10 דקות ב 10 הרץ). כמו סיבי הפחמן הוא להיות רכב על אופניים, סיבי הפחמן עצמו מתחמצן, הופך חרוט, הפחתת שטח הפנים אבל לייצר משטח חדש עבור דופמין ספיחה23. זה יכול להוביל לעלייה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה על ידי מכללת אליזבתטאון (R.J.W, M.L., ו- L.M.), על ידי מלגת בוגרי NSF (R.J.W. ) ועל ידי בית הספר לרפואה של ייל (N.A.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>פתרון מילוי אלקטרודות / אספקה < / חזק>
מכשירי דיוק מיקרופיפטהעולמייםMF286-5 (מד
אשלגן אצטטסיגמא236497-100G
אשלגן כלוריסיגמאP3911-25G
<אספקת אלקטרודות חזקה>< / חזק>
סיבי פחמןThornelT650
חולץ אלקטרודותNarishige InternationalPE-22הערה: ניתן להשתמש גם במושכים אופקיים כמו גם
במערכות נימי זכוכית A-M626000
חוטים מבודדים לאלקטרודותחוט וכבל Weico משולביםUL 1423אורך; 10 ס"מ; קוטר, 0.4 מ"מ; חייב להיות מותאם אישית; חומר מבודד צריך לכסות 5 ס"מ של החוט
מיקרוסקופ אור (לצפייה וחיתוך אלקטרודה)Fischer ScientificM3700
PinPhoenix EnterprisesHWS1646להלחמה על חוט האלקטרודה המבודד ואלקטרודת הייחוס; מתחבר לראש הבמה
שפכטלאלקולין23922-1003משמש להנחת אלקטרודה בעת חיתוך סיבי הפחמן
להב הקרפלWorld Precision Instruments500239לחיתוך סיבי פחמן באורך המתאים
כסףסיגמא327026-4G
<חזק>FSCV חומרה/תוכנה
Faraday כלובU-LineH-3618 (36 אינץ' x 24 אינץ' x 42 אינץ')
PotentiostatUniv. of N. Carolina, מתקן
מגרה אלקטרודהPlasticsOneMS303/2-A/SPCבעת ההזמנה, בקש חיתוך של 22 מ"מ מתחת לכן
TarHeel HDCV תוכנהאוניברסיטת צפון קרוליינה-צ'אפל היל- https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ להזמנת מידע
UEI Breakout BoxUniv. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ להזמנה מידע
אספקת חשמל UEIאוניברסיטת צפון קרוליינה, מתקןhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ להזמנת מידע
<חזק>חומרת סטימולטור
מבודד גירוי נוירולוגדיגיטימר בע"מDS4נוירולוג 800A
<חזק>עירוי/גירוי אספקה
משאבת עירוימשאבת מזרק עידן חדשNE-300
צינוריתפנימית פלסטיק OneC315I/SPC פנימי 33GA
מיקרוליטר מזרקהמילטון80308
צינורותפלסטיק אחדC313CT / חבילה צינורות 023 X 050 PE50
<חזק>ציוד כירורגי
מחזיק צינוריתKopf מכשירים1776 P-1
כותנה קצה אפליקטוריםחיוניות רפואית806
מחזיק אלקטרודותKopf Instruments1770
כרית חימוםקנט סיינטיפיקRT-0501
Povidone יודVitality רפואי29906-004
ברגים ברגיסטולינג/ חבילה של 1001.59 מ"מ OD, אורך 3.2 מ"מ
חוט כסף התייחסות עם AgClInVivo מטריE255A
גזה מרובעתVitality Medical441408
StereotaxKopf מכשיריםדגם 902 (מוט זרוע כפול)
<חזק>אספקה היסטולוגית
פורמוליןסיגמא1004960700
ספק כוחBK Precision9110
סוכרוזסיגמא80497
מיקרו-אלקטרודה טונגסטןMicroProbesWE30030.5A3
<חזק>תרופות לעירויים
((2R)-חומצה אמינו-5-פוספונובלריתסיגמא אולדריץ'A5282
N-מתיל-D-אספרטטסיגמא אולדריץ'M3262
מקמילמין הידרוכלוריד (M9020-5 מ"ג)סיגמא אולדריץ'M9020
סקופולמין הידרוברומיד (S0929-1g)סיגמא אולדריץ'S0929
28) חוט אלקטרוניקה אלקטרוניקה עיגון עצם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  2. Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
  3. Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
  4. Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
  5. Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
  6. Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
  7. Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
  8. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
  9. Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
  10. Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
  11. Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
  12. John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
  13. Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
  14. Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
  15. Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
  16. Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
  17. Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
  18. Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14(2002).
  19. Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
  20. Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
  21. Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
  22. Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
  23. Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
  24. Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
  25. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
  26. Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
  27. Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
  28. Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
  29. Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  30. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  31. Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
  32. Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
  33. Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Nucleus Accumbens CoreIn Vivo

מאמרים קשורים