פיתחנו מתודולוגיה יעילה לדגימה וניתוח של אותות ריח כדי להבין כיצד ניתן להשתמש בהם בתקשורת בין בעלי חיים. במיוחד, אנו משתמשים במיקרו-אינטרנצ'רציה מוצקה של מרחב הראש יחד עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה כדי לנתח את הרכיבים הנדיפים של ריחות בעלי חיים וסימוני ריח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דגימה וניתוח של אותות ריח בעלי חיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיתחנו מתודולוגיה יעילה לדגימה וניתוח של אותות ריח, באמצעות microextraction שלב מוצק headspace בשילוב עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה, כדי להבין כיצד הם עשויים לשמש בתקשורת בעלי חיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח חצי כמותי של הרכיבים הנדיפים של הפרשות ריח על ידי מתן אפשרות הפרדה וזיהוי זמני של הרכיבים במדגם, ואחריו ניתוח של יחסי אזור שיא לחפש מגמות שיכולות לסמן תרכובות שעשויות להיות מעורבות באיתות. נקודות החוזק העיקריות של גישה נוכחית זו הן טווח סוגי המדגמים שניתן לנתח; חוסר הצורך בהכנה או עקירות מדגם מורכבות; היכולת להפריד ולנתח את מרכיבי התערובת; זיהוי הרכיבים שזוהו; והיכולת לספק מידע חצי-כמותי ופוטנציאלי כמותי על הרכיבים שזוהו. המגבלה העיקרית למתודולוגיה מתייחסת לדגימות עצמן. מכיוון שמרכיבי הריבית הספציפית הם תנודתיים, ואלה עלולים בקלות ללכת לאיבוד, או שהריכוזים שלהם ישתנו, חשוב שהדגימות יאוחסנו ויעברו כראוי לאחר האיסוף שלהם. משמעות הדבר היא גם שתנאי האחסון וההובלה לדוגמה יקרים יחסית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של דגימות (כולל שתן, צואה, הפרשות ריח של שיער ובלוטת ריח). ריחות אלה מורכבים מתערובות מורכבות, המתרחשות במגוון מטריצות, ובכך מחייבות שימוש בטכניקות להפרדת הרכיבים הבודדים ולחילוץ תרכובות בעלי עניין ביולוגי.
מבוא
מעט מאוד ידוע על השינויים הכימיים העומדים ביסוד אותות הריח בבעליחיים 1, גם בגלל אתגרים מתודולוגיים בהקלטה וכימות פרופילים כימיים נדיפים של ריחות2. ישנן מספר מלכודות פוטנציאליות בעת עבודה עם מטריצות כימיות מורכבות ביותר; אלה כוללים בעת דגימה וניתוח דגימות ריח3.
במרכז המדע ע"ש רוזלינד פרנקלין, אוניברסיטת וולברהמפטון, אנו מבצעים ניתוח של ריחות וסימני ריח כדי להבין כיצד בעלי חיים יכולים להשתמש בהם. אנו משלבים סמיוכימיה עם אקולוגיה התנהגותית, אנדוקרינולוגיה וציטולוגיה כדי לשפר את הבנתנו את התפקיד שמילאו אותות חוש הריח בתקשורת בין בעלי חיים.
פיתחנו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אוסף לדוגמה
- דוגמת ריחות שהם אחד מהבאים:
- לאסוף באופן ספונטני שוחרר על ידי נושאי מחקר רגילים (למשל, פרימטים גן החיות) באמצעות סימון ריח על נייר מסנן סטרילי (למשל, הפרשות ריח בלוטת ריח) או ישירות לתוך בקבוקונים (למשל, שתן).
- לאסוף על ידי שפשוף ספוגיות כותנה סטרילית לאחר אימון נושאי המחקר באמצעות אימון חיזוק חיובי.
- לאסוף על ידי שפשוף ספוגיות כותנה סטרילית לאחר הרדים של נושאי המחקר.
- מניחים דגימות בבקבוקוני זכוכית שקופים סטריליים של 10 מ"ל, וחותמים עם כובעי בורג עם כובעים המשלבים ספטה FTFE/סיליקון. מיד לאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: חיוני להשתמש בציוד מגן אישי נקי, כגון כפפות ניטריל; לשנות אותם לעתים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות פרוטוקול זה, זיהינו באופן זמני סך של 32 תרכובות כימיות נדיפות מניתוח של 14 סימני ריח של איברי המין האנו שפורסמו באופן ספונטני על נייר סינון על ידי למורים אדומי צווארון (Varecia variegata rubra) והשווינו פרופילי ריח עם תכונות של האות12. תרכובות נדיפות המתרחשות באופן טבעי, כגון פחמימנים, טרפנים, אלכוהול טרפן וקטונים, היו נוכחים בתוך פרופילים אלה וכללו תרכובות שנמצאו בעבר לשמש פרומונים מין רמזים כושר מינים אחרים של בעלי חיים. התרכובות שזוהו באופן לא סופי מפורטות בטבלה 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השימוש בדגימות בקרה, הן בקרות סביבתיות שנוצרו בזמן איסוף הדגימה והן כדורי סרק של המערכת, חיוניים לפרשנות דגימות סימן הריח. כל הפסגות המיוחסות לסביבת הדגימה או למערכת האינסטרומנטלית צריכות להיות מודרות מדגימות סימן ריח, כך שרק פסגות העניין נכללות בכל פרשנות. פקדים אלה יכולים גם לשחק תפקיד בהערכת וניטור 'בריאות' המכשור.
הפרוטוקול כולל שלבים כדי להתנות את הסיבים לפני ואחרי כל מיצוי. זה נעשה קל יותר על ידי שימוש במדגם אוטומטי ומבטיח כי אין זיהום צולב מדגם לדגימה.
המגבלה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לקית' הולדינג על עזרתו בניתוחים כימיים במרכז המדע ע"ש רוזלינד פרנקלין, וולברהמפטון ובן מנטל על הפקת הסרטון. אנו מודים גם לפרופ' גלוריאנו מונטי, ד"ר ג'וזפה פייראצ'יני ולחברי המרכז לספקטרומטריית מסה באוניברסיטת פירנצה, פירנצה, ולפרופ' לוקה קלמאי וד"ר מרקו מיכאלוצי ממעבדת ARCA של CNR, פירנצה, על עזרתם בהקמת מתודולוגיה זו. פרויקטי המחקר שכללו את שיטות הדגימה והניתוח המתוארות בכתב היד נתמכו על ידי שתי מלגות מארי סקלודובסקי-קירי אינטרה אירופאיות (תעודות זהות של הסכם מענק: 327083, 703611), מענק קטן ('הפרימט המועשר החושי') מאגודת הפרימטים של בריטניה הגדולה, ומענק מחקר קטן ('האם לציידים-לקטים יש חוש ריח מיוחד?') מהאקדמיה הבריטית / קרן Leverhulme ל S....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בקבוקוני דגימה אוטומטית של 10 מ"ל | Agilent | 5188-5392 | בקבוקוני הברגה של 10 מ"ל עם |
| מכסי בקבוקון 18 מ"מ | Agilent | 8010-0139 | מגנטי עם מחיצת PTFE/סיליקון |
| דגימה אוטומטית | Agilent | GC120 PAL דגימה | |
| נימית | Agilent | HP5-MS | 30 מ' x 0.25 מ"מ; 0.25 ומיקרו; m |
| תוכנת ניתוח נתונים | Agilent-ChemStation | ||
| כרומטוגרף גז | Agilent | 7890B | |
| כניסת מחיצה | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| גלאי סלקטיבי מסה | Agilent | 5977A | |
| תוכנת דיווח | ספרייה | Microsoft-Excel | |
| NIST | - | NIST/EPA/NIH ספרייה ספקטרלית מסה | |
| תוכנית חיפוש ספרייה ספקטרלית | NIST-MS | חיפוש v.2.2 | |
| אניה כניסה מפוצלת | Agilent | 5190-4048 | |
| סיבי SPME | Agilent | SU57345U | 65 ומיקרו; m PDMS/DVB סיבים |
מקורות
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
