בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים באופן ברור מבני אדם בריאים שעברו ניתוח שקדים ניתוחים חלקיים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
לימוד תאים בודדים מרקמות הלימפה הקשורות רירית (מאלט) מאפשר הבנה של תגובת תאים חיסוניים בפתווגיות מעורבים חסינות רירית, כי הם יכולים לדגמן אינטראקציות מארח הפתוגן ברקמה. בעוד תאים מבודדים נגזר מרקמות היו המודל הראשון של תרבות התא, השימוש שלהם הוזנח כי רקמות יכול להיות קשה להשיג. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים המוננוציליים של האדם (tmcs) מפני השקדים האנושיים בריאים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית. בידוד של TMCs מן השקדים הוא מהיר, כי השקדים בקושי יש אפיתל כל התשואה עד מיליארדי כל סוגי התא החיסונית העיקריים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של הייצור cy, באמצעות מספר טכניקות, כולל חיסוני, qPCR, מיקרוסקופ, זרימה cy, ועוד., בדומה לשימוש בתאים היקפיים ברורים (PBMCs) מהדם. יתרה מזאת, TMCs מראים רגישות גבוהה יותר לבדיקות סמים מאשר PBMCs, אשר צריך להיחשב עבור רעילות בעתיד. כך, התרבויות vivo tmcs לשעבר הם מודל רירית קלה ונגישה.
מבוא
מחקרים על איברי האנוש מוגבלים בשל נגישות, כמו גם סיבות אתיות ברורות. עם זאת, הם חיוניים כדי להבין באופן מלא את המורכבות של הביולוגיה האנושית. תרבויות של תאים מבודדים (התרבויות הראשיות או קווי התא) הם מערכת סטנדרטית בלימודי התא בביולוגיה בשל זמינותם. בעוד תרביות תאים מבודדים אפשרו תגליות מצטיינים, השימוש קווי התא הגיע על בדיקה מקרוב יותר כי הם לא לחקות באופן מלא vivo ביולוגיה איברים. עם זאת, התרבות של תאים תלת מימדיים או explants רקמות הוא מורכב מאוד4,5,6. אכן, פיסת רקמה או איבר הוא הטרודוגני מאוד כי הרכב התא שלה שונה בהתאם לוקליזציה ברקמה. לפיכך, שימוש בקוביות רקמה דורש ניתוח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הדגימות לא נאספו במיוחד למטרות מחקר והמחקר אינו נחשב פולשני. עם זאת, איסוף השקדים האנושיים דורש אישור מוסרי של הרשויות הרלוונטיות המקומיות. במקרה שלנו, היא אושרה על ידי הגנת האגודה דה אישית (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). יתרה מזאת, הסכמה של כל מטופל או נציג משפטי מתבקשים להשיג נתונים אישיים של תורמים (למשל, מין, גיל, היסטוריה של דלקות ENT) שיכולות לסייע בפענוח תוצאות נסיוניות.
1. טיפול ברקמת המין האנושי
- שים שקדים מכל תורם בבקבוקון 50 mL סטרילי אחד המכיל 25 מ"ל PBS 1x ותחבורה בטמפרטורת החדר (RT) למעבדה על פי המלצות הרשות (להשתמש בשלוש רמות של הגנה: בבקבוקונים, תיבת בטיחות, ושקית).
הערה: ההליך כולו צריך להתבצע במ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לראשונה אפיינו את הפרופיל החיסוני של תאים נוכח בתרבות וניתח את כמות TMCs. . בעזרת השקדים והטטוטונסות כפי שמוצג באיור 1, כל סוגי התא החיסונית העיקריים הקיימים pbmcs מהדם היו מייצגים tmcs מן השקדים. עם זאת, ב-TMCs התדירות של כל סוגי התאים, למעט תאים B, היו נמוכים מ-PBMCs.
איור 1: פנוטיפים של TMCs בשקדים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השקדים האנושיים מייצגים מודל אינטגרטיבי ופיזיולוגי ex vivo ללמוד תגובות החיסונית מולדת בממשק רירית, משום שהם לחקות את התפקיד של איבר הלימפה המשני. מעניין, הרכב הסלולר של TMCs דומה ל-PBMCs וכולל את כל אוכלוסיות התאים הגדולות, למרות שהאחוז שלהם יכול להיות שונה מ-PBMCs מדם (איור 1). אוכלוסיות נוספות ניתן למצוא גם, כמו כל התגובות החיסונית מבוצעים ברקמות (רירית או איברי הלימפה משני) ולא בדם.
השימוש ברקמות הגוף האנושי כמו גם בשימוש בתרבית תאים או בתאי דם לכל אחד מהם יש .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
העבודה הזאת נתמכת על ידי הסוכנות הלאומית למחקר הלאומי של הסוכנות למען הפרקליט המחוזי (J-P. ח) לניסויים ומלגת N.B. (AAP 2017 166). נ מאשר תמיכה של anrs עבור ההתחברות (aap 2016 1), הארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית embo עבור ההתחברות (LT 834 2017), תוכנית מימון ההפעלה "באושטיין" של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Ulm (lsbn. 0147) ו הגרמני forschans544/1 1 gealllllllllllll
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| רשת פלדה 10 רשתות - 1910 ומיקרו; m | Dutscher | 198586 | להכניס למסננת התא רשת פלדה Cellector |
| 60 רשתות - 230 ומיקרו; m | Dutscher | 198591 | להכניס למסננת התאים Cellector |
| 70 & micro; m מסנני תאים ClearLine לבנים | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D חומר ניקוי | Dutscher | 59852 | תמיסת אנטיביוטיקה דטרגנטים |
| , 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium ו-100 μ g/mL Streptomycin - להוספה למצע התרבית |
| BD FalconTM צינורות תחתונים עגולים, 5 מ"ל | BD Biosciences | 352063 | צינורות FACS |
| מסננת תאים מסננת, 85 מ"ל וקוטר 37 מ"מ | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) בדיקת כדאיות תאים זוהרים | Promega | G7572 | כדאיות |
| צנטריפוגה 5810 R | Eppendorf | ||
| צינורות חרוטיים Falcon 50 מ"ל | Dutscher | 352070 | |
| פינצטה מעוקלת | Dutscher | 711200 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Sa Salt (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | ללא סידן ומגנזיום |
| EnVision | PerkinElmer | מודד את הזוהר | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | להוספה למדיית | ||
| התרבית תוויות פלואורסצנטיות נוגדנים | ראה טבלה 1 | ||
| עלי זכוכית | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 מ') | Thermo Fisher | 15630056 | שימוש בחממה |
| LEGENDplex פאנל תגובה אנושי נגד וירוס | BioLegend | 740390 | בדיקה חיסונית מבוססת חרוזים |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | מדיום שיפוע צפיפות |
| מיכל Mr. Frosty מיכל Thermo | Fisher | 5100-0001 | מיכל הקפאה איטית |
| פירס 16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנול | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 אגוניסט |
| RPMI-1640 צלחת | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL, 150 מ"מ x 25 מ"מ (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| להב כירורגי סטרילי N° 23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBiads פיצוי חרוזים | תרמו פישר | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | להכנת מאגר כביסה ב-PBS |
מקורות
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
