הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60961

⸱

19 במאי 2020

 , 
1Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, F. Edward Hébert School of Medicine, Uniformed Services University of the Health Sciences

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

תקציר

ניתוח ניסיוני של תאים חילוק בחיים, רקמות ואיברים שלמים הוא חיוני להבנת איך חלוקת התא משתלב עם פיתוח, רקמות הומאוסטזיס, ותהליכי מחלות. דרוזופילה ספרמטוציטים שעוברים מיוזיס הם אידיאליים עבור ניתוח זה, כי (1) כל drosophila האשכים המכילים spermatocytes קל יחסית להתכונן למיקרוסקופיה, (2) בגודל גדול של הספרציטים הופך אותם מתאימים היטב לדימות ברזולוציה גבוהה, ו (3) הכלים הגנטיים של drosophila יכול להיות משולב כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיש בקלות להכנת האשכים שלמים מדרוזוהילה הזחלים השלישי והגלמים המוקדמים. אנו מתארים כיצד לזהות ספרמטציטים מיוטיות בתוך האשכים המוכנים וכיצד לדמות אותם חיים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. פרוטוקולים עבור קיבוע והכתים האשכים שלם מסופקים גם. השימוש האשכים זחל יש מספר יתרונות על פרוטוקולים זמינים המשתמשים באשכים מבוגרים לניתוח spermatocyte. החשוב ביותר, האשכים זחל הם קטנים פחות צפוף עם תאים מאשר האשכים למבוגרים, וזה מאפשר מאוד הדמיה ברזולוציה גבוהה של spermatocytes. כדי להדגים את היתרונות הללו ואת היישומים של הפרוטוקולים, אנו מציגים את התוצאות המציגות את ההפצה משנה של הרשת האנדופלזמית לגבי מיקרוטובוקלס במהלך חלוקת תאים באמצעות מיקרוסקופ בודד שנוצר על-ידי מיקרוסקופיה בזמן הקפיצה. הפרוטוקולים יכולים להיות משולבים עם הביטוי של כל מספר של חלבונים מתויגים fluorescently או סמנים ארגונית, כמו גם מוטציות גנטיות וכלים גנטיים אחרים, מה שהופך גישה זו חזק במיוחד עבור ניתוח של מנגנוני חלוקת התא בהקשר הפיזיולוגי של רקמות ואיברים שלמים.

מבוא

חלוקת התא לומדת לעתים קרובות באמצעות קווי תאים הגדלים בתרבות1. למרות שרכשנו שפע של תובנה והבנה לא יסולא בפז של מנגנונים בסיסיים ממחקרים אלה2, תאים שגדלו בתרבות לא יכולים ללכוד באופן מלא את הפיזיולוגיה של חלוקת התא כפי שהוא מתרחש ברקמה חיה שלמה. לדוגמה, ברקמות ובאיברים שלמים, התאים חייבים להתחלק במקום הנכון ובזמן הנכון כך שתאים צאצאים ממוקמים כראוי בתוך הרקמה, כך שהם יכולים לעבור בידול מתאים או תוכניות פונקציונלי, ולכן התפשטות התא מתואמת כראוי עם צמיחה רקמות או הומאוסטזיס3. עבור תאים שגדלו בתרבות מצד שני, החטיבה התא מוסדר בדרך כלל על ידי גורמי גדילה במדיום התרבות4, ולכן אנחנו לא יכולים ללמוד מתאים אלה איך בvivo גורמים סביבתיים כגון אדריכלות רקמות או איתות התפתחותי להשפיע על תהליך החלוקה. חשוב גם לציין כי רבים של קווי התא המשמשים לחקר חלוקת התא, כגון התאים הלה ו U2OS, נגזר גידולים גרורתי5. לכן, היבטים רבים של הפיזיולוגיה הבסיסית של תאים אלה סרטניים, כגון מנגנוני הרגולציה מחזור התא ויציבות כרומוזומלית, סביר להניח ששונו לעומת תאים בריאים. הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של חלוקת התא, לפיכך, תלויה ביכולתנו ללמוד את התאים המקוריים שלהם, בסביבות vivo השימור מנגנונים פיזיולוגיים וארכיטקטורת רקמות.

ההתקדמות בהבנת האופן שבו חטיבת התאים פועלת בתוך רקמות ואברים שלמים, מתקשים בvivo או בניתוח vivo לשעבר. ראשית, זה יכול להיות קשה או בלתי אפשרי כדי לגשת מחלוקת תאים לניתוח מיקרוסקופי בתוך איברים גדולים או עבה רקמות. שנית, קשה לעתים קרובות לנבא כאשר תאים בודדים מתחלקים בvivo. שלישית, פיזיולוגיה של רקמות עלולה להתדרדר במהירות במהלך התרבות הvivo לשעבר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות נגישות בקלות לניתוח בשידור חי וקבוע של דרוסופילה מלאנומנוציטים בזמן שהם עוברים מחלקות תאים מיוטיות בתוך האשכים שלמים לחלוטין. תאים אלה הם אידיאליים עבור לחיות, לשעבר ניתוח vivo כי הם נגישים בקלות עם שיטות אופטיות סטנדרטיות כגון קונפוקלית מיקרוסקופ, הם מתחלקים בזמנים צפויים ומיקומים, ואת האשכים שלמים ניתן לשמור בתרבות לשעבר vivo עד כ 24 h. בנוסף, דרוזופילה ספרציטים הם תאים עגולים גדולים (כ -20-30 יקרומטר בקוטר) שאינם משנים צורה כאשר הם מתחלקים, והופכים אותם לאידיאליים ברזולוציה גבוהה, הדמיה של מרכיבי הסלולר כגון מנגנון הצירים והאורגלים הציטוטיים. למרות תאים אלה עוברים מיוזה לעומת mitosis, רבים של התהליכים החיוניים החטיבה התא דומים מאוד בין שני אלה מנגנוני חלוקת התא6. יתרונות אלה, בשילוב עם כלים גנטיים בעלי עוצמה דרוזוהילה , עשו דרוזוהילה ספרמטציטים בשימוש נרחב בדגם vivo ex של תהליכים של חטיבת תאים חיוניים, כולל היווצרות צירים ורגולציה, ציטוקינזה, ושיפוץ ארגונית וחלוקה למחיצות7,8,9,10,11.

הספרציטים הם תאים הנמצאים בשלב המיוטיסטי של זרע. בדרוזופילה, מתחילה הזרע עם קבוצה של תאי גזע של germline הממוקמים באזור קטן או "hub" בעמוד אחד של ה-12,13. תאים אלה מתחלקים על ידי מיטוזיס אסימטרית, ומעניק הרבה spermatogonium אחד הבדיל. הזרע לאחר מכן לעבור ארבעה mitoses סינכרוני כדי לייצר קבוצה של 16 תאים שנותרו קשורים היטב בתוך ציסטה אחת. בשלב זה, התאים מעבר מmitotic למחזור התא meiotic ומכונים spermatocytes. Spermatocytes לבלות שניים עד שלושה ימים בשלב מורחב G2 של מחזור התא, במהלכו הם גדלים באופן דרמטי ולעבור שינויים ציטולוגיים בהכנה עבור שתי חטיבות meiotic ו spermiogenesis הבאים13,14. הקבוצה כולה של 16 spermatocytes בתוך ציסטה אחת ולאחר מכן להיכנס החלוקה meiotic הראשון באותו זמן. לפיכך, ניתן לבצע יצירת תמונות של מספר ספרציטים במקביל כשהם ממשיכים דרך מחלקת התאים. החטיבה meiotic הראשון ההכנסות עבור כ 1.5 h והוא עקב כמעט מיד על ידי החטיבה השנייה meiotic, מניב 64 הכולל הכוללת כי להמשיך להבדיל לתוך הזרע בוגרת.

היתרון הייחודי של שימוש בספרציטים כדי ללמוד החטיבה התא בחיים, רקמה שלמה היא כי קבוצות או ציסטות של תאים התקדמות מתמדת דרך בשלבים שונים של הזרע, ותאים בכל שלבי הזרע ניתן בדרך כלל להיות מזוהה בכל בעיות נתון (ראה איור 3A). לכן, קל יחסית למצוא תאים meiotic באשכים שלמים. אנחנו בדרך כלל למקד את הניתוחים שלנו על הראשון לעומת מיוזה השני משום תאים אלה הם הרבה יותר גדול ומקובל יותר הדמיה ברזולוציה גבוהה, אבל התהליך כולו המקיף הן מחלקות מיוזה ניתן לבצע דימות בהצלחה. יצוין גם כי הפרוטוקול הכללי לקראת הכנה ותרבות ניתן להשתמש כדי לנתח תהליכים אחרים של הזרע כמו גם, כגון תא הגזע הקודם mitotic או מחלקות spermatogonial או שינויים ציטולוגיים המתרחשים כמו זכותנו מבוגרים לתוך הזרע15. רבים מן ההיבטים הללו של הזרע נשמרים במידה רבה בין דרוזוהילה לבני אדם16.

דרוזוהפילה ספרציטים מתחיל להגיע לשלב המיוסטי של הזרע במהלך הזחל השלישי של דרוזוהילה לפיתוח13. לפיכך, האשכים מבודדים משלבי מחזור חיים המתחילים בזחלים שלישיים ובכללם גלמים ומבוגרים יכולים לשמש לניתוח של חלוקת ספרציטים. פרוטוקולים מצוינים מספר זמינים עבור חילוץ של האשכים של גברים בוגרים זבובים לניתוח חי וקבוע של זרע בראשית17,18,19. פרוטוקולים אלה עשויים להיות עדיפים ללמוד בשלבים מאוחרים של הזרע או אם סמנים גנטיים הגלויים רק אצל מבוגרים יש להשתמש. הפרוטוקול מתמקד בהכנה של בדיקת הרימות והגלמים המוקדמים, משום שלאשכים בשלבים אלה יש מספר יתרונות הרלוונטיים במיוחד לניתוח של חלוקת תאים ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ בזמן הקפיצה. ראשית, האשכים של הזחלים והגלמים קטנים יותר מאלה של מבוגרים, והתאים בתוך האיבר הם פחות צפוף. בגלל זה, חלוקת הספרציטים יכולה לעתים קרובות להיות בתמונה ליד המשטח החיצוני של האשכים זחל, מבלי לחדור דרך שכבות מרובות של רקמת פיזור אור. שנית, האשכים מבוגרים לזוז בקצב בשל התכווצויות של אברי האביזר המצורף, ותנועות אלה להפוך זמן לפקיעה הדמיה של תאים בודדים מאתגרת. ושלישית, האשכים הזחל הם יתרון כאשר לומדים מוטציות גנים הגורמות גולמי או מבוגרים השפעה. השיטות שלנו ממוטבת לתרבות ארוכת טווח של האשכים על הבמה המיקרוסקופ, המאפשר דימות של סיבובים מרובים של חלוקת התא או התקדמות של תאים בודדים באמצעות שלבים מרובים של הזרע באותו הכנה. אנו מתארים גם פרוטוקול עבור קיבוע וכתמים חיסוני של האשכים שלמים. בסך הכל, הפרוטוקולים שלנו שימושיים במיוחד עבור אלה המעוניינים ללמוד חלוקת תאים ברקמה שלמה, ואת היכולת לשלב ניתוח spermatocyte עם מאוד צייתן הכלים הגנטיים הופך את זה גישה חזקה במיוחד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת בעלי חיים, כלים ומדיה לחיתוך

  1. להצליב זבובים זכר ונקבה כדי להשיג צאצאים של גנוטיפ הרצוי. סמנים הטרנסגניים שימושיים לזיהוי ואחסון זמני של הספרציטים כוללים GFP-טובולין כדי לתייג את ציר meiotic ו RFP-histone 2A כדי תווית כרומזומים8. השתמש חמש עד עשר נקבות לחצות ולשמור על צלבים על מזון לעוף רגיל בבקבוקונים בחממה של 25 ° c עד הזחלים השלישי להתחיל לזחול לצדדים של הבקבוקון (4 – 5 ימים). הגלמים הלבנים המוקדמים יתחילו להרכיב יום אחד לאחר מכן.
  2. להשיג שני זוגות של מלקחיים ישר עם טיפים קנס. ודא שהטיפים חדים, אפילו באורך וישר (איור 1A). השתמש מלקחיים אלה רק לניתוח, וכובע עם 10 μL הצינורות טיפים כאשר לא בשימוש.
  3. . הכן כלי אזמל
    1. הכנס את הקצה הקהה של סיכת חרק שחור מפלדה למחזיק פינים, וסובב את הבורג של המחזיק כדי לאבטח את הסיכה במקומה. באמצעות זוג מלקחיים ותחת מיקרוסקופ מבתר, אחוז בסיכת החרק באמצע וכופף אותו לצורת זווית פנימית של 135 ° (איור 1B). הקצה החד הוא לחיתוך רקמה, בעוד הקצה משמש להעברת האשכים בין טיפות התקשורת.
    2. Cap עם תשר של 1,000 μL לאחר שאינו בשימוש.
  4. בעבודה במכסה של תרבות רקמה, הכינו 5 מעלות מדיה של שניידר והחנות ב -4 ° c עד לזמן השימוש. כאשר מוכנים להתחיל בניתוח, חם אחד 5 mL מדיה לטמפרטורת החדר. ואז להעביר את מדיית החיתוך החמם למזרק 10 מ ל ולצרף מסנן מזרק 0.22 יקרומטר.

2. חיתוך אשכים מזחלים וגלמים מוקדמים

  1. השתמש במזרק מילוי המדיה כדי לגרש שלוש טיפות של מדיה (50 μL לכל אחד) בחלק העליון, האמצעי והתחתון של שקופית זכוכית.
  2. השתמשו במקדח מבתר כדי להעביר חמישה עד עשרה זחלים שלישיים או גלמים מוקדמים (הגלמים שעדיין לבנים או צהובים) ועד לירידה העליונה. מתפרעים בעדינות את הזחלים והגלמים בתקשורת בעזרת המקדח החוצה כדי להסיר מזון או פסולת.
  3. תחת מיקרוסקופ מבתר, הפוך את הזחל היחיד או הגולם לצדו באמצעות בדיקה מבתר כדי לזהות את שתי האשכים הדו, שנראים כמבנים שקופים בצורת אליפסה בשליש האחורי של הגוף (איור 2א, ב). בעלי חיים שחסרי האשכים הם נקבה ויש להיפטר מהם.
  4. כאשר מוצאים זחל או גולם זכרים נקיים, הזיזו אותו לטיפת המדיה השנייה. חזרה עד 3 או 4 זחלים זכרים ו/או גלמים הועברו לטיפת המדיה השנייה.
  5. עבודה בטיפה השנייה של התקשורת, אחוז בזחל גברי או גולם עם זוג מלקחיים באמצע האזור, רק הקדמי של האשכים. השתמש בזוג השני של מלקחיים כדי לקרוע בעדינות את החיה לשניים.
  6. החזיקו את הקצה האחורי של הזחל או הגולם על מגלשת הזכוכית עם זוג מלקחיים. מתחיל רק ליד מלקחיים, לדחוף על הקוטיקולה באמצעות הקצה של כלי אזמל ולהעביר את האזמל לכיוון הקצה החתוך של החיה. זה יהיה לגרש את האיברים הפנימיים של החיה, אשר כוללים את המעיים, גוף שומן, והאשכים.
  7. להקניט בעדינות להפריד את האשכים משאר האיברים. האשכים הם ברורים, איברים בצורת אליפסה מוטבע רצועות של גוף שומן (איור 2C).
  8. להעביר את האשכים אחד בכל פעם כדי טיפה השלישי של התקשורת. כדי לבצע זאת, הכנס את קצה האזמל מתחת לגוף השומן, הרם את הרקמה מתוך המדיה, ובמהירות הזז אותה לירידה השלישית.
  9. לחילופין, אם אין מספיק גוף שומן עדיין מחובר האשכים כדי להרים בהצלחה את הרקמה, בעדינות להעביר את הרקמה באמצעות זכוכית פסטר מיכל כי כבר מראש עם מדיה לחיתוך.
  10. השתמש בקצה חדה של הכלי אזמל כדי לחתוך בעדינות את הגוף שומן עודף מן האשכים, השארת רק שפה קטנה של גוף השומן סביב הקצוות (איור 2C). אין צורך להסיר את כל הגוף fat, ומנסה לעשות זאת עלול לגרום נזק או בתפירה של האשכים.
  11. חזרו על הצעדים שלעיל עבור כל הזחלים הזכרים על מגלשת הזכוכית.
  12. המשך או לשלב 3 או צעד 5.

3. הרכבה האשכים עבור הדמיה חיה מיקרוסקופיים

הערה: הליך ההרכבה הזה הותאם מפרוטוקול שפורסם לאחרונה לדימות של דרוזוהילה זחל מוח באורך20. פרטים נוספים ניתן למצוא בהפניה זו.

  1. השתמש מזרק מסנן כדי להפקיד טיפה אחת של המדיה של שניידר (כ 30 μL) על מרכז של צלחת התרבות החדיר 50 מילימטר גז.
  2. להעביר את האשכים מוכנים לירידה על הצלחת חדיר גז. האשכים בדרך כלל לצוף אל פני השטח של הירידה.
  3. השתמש בכלי אזמל כדי לדחוף בעדינות את האשכים לתוך קרום חדיר גז. לדאוג לא לקרוע את קרום חדיר גז עם הנקודה החדה של האזמל. לדחוף את כל האשכים למרכז הירידה.
  4. השתמש 1 מזרק mL מלא עם שמן הלוקרבון לעשות 4 טיפות שמן, כ 30 μL כל אחד, על קרום חדיר גז. מרחב טיפות של שמן סביב טיפת התקשורת המכילה את האשכים כדי להתאים את ארבע פינות של שמיכות זכוכית 22 מ"מ.
  5. לסדר את הפינות של שמיכות זכוכית 22 מ"מ עם ארבע טיפות של שמן הלוגן ולהקטין בעדינות את coverslip על התקשורת והנפט. אפשר שמיכות להתיישב ולתקשורת המכילה את האשכים להתפשט בין טיפות שמן.
  6. להסיר את המדיה העודפים כדי לאפשר את coverslip להתיישב על פני השטח של האשכים. בעוד התבוננות האשכים תחת מיקרוסקופ מבתר, להכניס את הפינה של משימה עדינה לנגב לתוך התקשורת תחת coverslip לפתיל משם כמות קטנה של נוזל. וויק מספיק תקשורת עד שcoverslip זכוכית רק יוצר קשר עם פני השטח של הפנים הגדולות. זה קריטי לא להסיר יותר מדי מדיה ולהקטין את שמיכות רחוק מדי, כמו זה יהיה להפעיל לחץ על האשכים ולגרום להם קרע (ראה איור 5).

4. הדמיה חיה של הספרציטים

הערה: הזרע ניתן לדימות באמצעות סריקת לייזר או מיקרוסקופ הדיסק המסתובב. המערכת חייבת להיות מהירות נאותה ורגישות כדי למנוע הלבנת של חלבונים פלואורסצנטי או פוטונזק של הרקמה.

  1. מניחים טיפה של שמן טבילה על שמיכות זכוכית בדיוק מעל האשכים. להתהפך התבשיל ולמקם אותו על הבמה המיקרוסקופ ולהעביר את מטרת המיקרוסקופ (40x או 60x) לתוך השמן עד שזה רק מתחת לאשכים. השתמש באור משודר כדי למצוא ביקורות בודדות ולהביא אותה לפוקוס.
  2. בזמן לכידת תמונות מהירות עם הקונמוקד, להזיז את המוח סביב כדי לבחון את הארגון של התאים. קצה אחד של הב, יהיו בעלי תאים קטנים וצפופים. הקצה הזה מכיל את תאי הגזע. הגרמקו והזרע במעבר לקצה השני של העוגב, זהה תאים גדולים בהדרגה מאורגנים לאשכולות או ציסטות נפרדים. תאים גדולים אלה הם הספרציטים (איור 3A).
  3. אם הדמיה gfp-טובולין, לזהות spermatocytes שיחל מיוזה בתוך 30 – 60 דקות על ידי נוכחות של שתי מיקרוטוכתים בהירים (כלומר, centrosomes) ממוקם בקליפת התא (איור 3ב, ג).
  4. לאחר ציסטה של ספרציטים meiotic זוהה, להגדיר פרמטרים הרכישה כדי ללכוד z-ערימות של תמונות לאורך זמן. בדרך כלל, רכישה של 15 עד 20 תמונות במרווחים 1.5 יקרומטר מלבד בממד z מספיק כדי ללכוד את הנפח המלא של מספר spermatocytes בתוך אותה ציסטה.
  5. לרכוש מלא z-ערימות כל 2 דקות אם הדמיה כל החלוקה meiotic הראשון, אשר לוקח כ 1.5 שעות. ניתן להשתמש בתעריפי רכישה מהירים יותר, במיוחד אם יש לנתח רק אירוע ספציפי של מיוזיס. עם זאת, לדאוג לא לגרום photobleaching לבנת או נזק עקב חשיפה חוזרת של המדגם לעירור לייזר.
  6. השתמש במערכת בקרת מיקוד רציפה אוטומטית כדי למנוע סחף ממוקד לאורך זמן הרכישה. בדרך כלל אין צורך בבקרת טמפרטורה של המדגם על במת המיקרוסקופ, בהנחה שטמפרטורת החדר היא כ -22-23 ° c. אם בקרת טמפרטורה זמינה, שמור על המדגם ב -25 ° c על במת המיקרוסקופ.
  7. אם הספרציטים לא נמצאו, אחסן את המדגם במשך מספר שעות או לילה בחממה ובתמונה של 25 ° c.

5. קיבוע וכתמים חיסוני

  1. משלב 2.10 לעיל, להשתמש מזכוכית פסטר הצינורות כדי להעביר את האשכים לבאר ב 9-היטב מבתר זכוכית צלחת המכיל 0.5 mL של 8% פאראפורמלדהיד ב PBSTx (פוספט מואגור מלוחים עם 0.3% טריטון X-100). ודא כי האשכים הם הנחת על החלק התחתון של המנה.
    הערה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ויש לטפל עם כפפות בתוך מכסה.
  2. תקן את האשכים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. להעביר את האשכים היטב המכיל 0.5 mL PBSTx. לשטוף 5 דקות עם עצבנות עדינה. חזור על הצעד לשטוף בארות חדשות עם PBSTx טרי פעמיים יותר.
  4. לדלל את הנוגדן העיקרי לריכוז הרצוי ב 0.5 mL PBSTx המכיל 5% בסרום ב (BSA) בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. העברת האשכים מן 9-הבאר מבתר את הצלחת לתוך הצינור של הנוגדן הראשוני מדולל הדגירה לילה ב 4 ° צ' עם נדנדה עדין או התנדנד.
  5. לשטוף את האשכים ב 0.5 mL של PBSTx עבור 5 דקות בבאר של 9-היטב מבתר זכוכית צלחת. חזור על שלב השטיפה עם PBSTx טריים פעמיים נוספות.
  6. לדלל את הנוגדן המשני ב 250 μL של PBSTx המכיל 5% BSA ו לוותר על הבאר נקי של הצלחת מנתח זכוכית 9. אם רצונך בכך, הוסף DAPI כדי להכתים דנ א. העברת האשכים כדי היטב המכיל נוגדן משני, לכסות עם ניילון לעטוף, ו דגירה בחושך עם עצבנות עדינה עבור 4 שעות בטמפרטורת החדר.
  7. להעביר את האשכים היטב נקי מלא עם 0.5 mL של PBSTx. לשטוף עם PBSTx טרי פעמיים עבור 5 דקות ופעם שלישית עבור 30 דקות.

6. הרכבה קבוע האשכים

  1. להעביר את האשכים מן השטיפה האחרונה על שקופית זכוכית מיקרוסקופ באמצעות הצינורות פסטר. במקרה הצורך, השתמשו בשולי כלי האזמל כדי לדחוף את האשכים אל פני השטח של השקופית.
  2. השתמש בפינה של משימה עדינה לנגב לפתיל החוצה נוזל עודף מן האשכים. הסר ככל האפשר את הכמות הנוזלית.
  3. החלת ירידה של 30 עד 50 μL של מיקרוסקופיה בינונית הרכבה לאשכים.
  4. מקום שמיכות 22 מ"מ על ירידה של המדיום הגובר ולאפשר coverslip ליישב את המדיום ההרכבה להתפשט מתחת coverslip. להחיל לחץ עדין על שמיכות אם יש צורך לסחוט החוצה בינונית גובר ולאפשר coverslip לנוח על פני השטח של האשכים.
  5. להשתמש לק לציפורניים לאטום את הקצוות של הכיסויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, האשכים יישארו שלמים לחלוטין לדימות על ידי מיקרוסקופ מוקד או שיטות אחרות מיקרוסקופ הזריחה. כפי שניתן לראות באיור 3a, הארגון הסלולר של האשכים נשמר, ואת ההתקדמות של בידול התא מקצה אחד של הפנים אל השני כולל הזרע, spermatציטים, ו פלואידי spermatids הוא גלוי. GFP-טובולין הוא סמן שימושי לזיהוי חלוקה ספרציטים והדמיה חיה של ההתקדמות של התאים דרך meiosis. כפי שניתן לראות באיור 3B, אפשר לזהות הספרציטים על התחלת המכינה על ידי שתי הרימות הבולטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תיארנו פרוטוקול להכנת זחל או גולמי מוקדם drosophila ילה האשכים, אופטימיזציה לטווח ארוך, לחיות הדמיה של מחלקת התא spermatocyte. זוהי שיטה רבת-עוצמה לניתוח חלוקת תאים בהקשר הפיזיולוגי של רקמות שלמות. העוצמה של שיטה זו מורחבת עוד יותר כאשר בשילוב עם כלים גנטיים דרוזוהילה , כגון מוטציות גנטיות ספציפיות, דיכוי ספציפי לרקמות rnai-בתיווך, ו-fluorescently אופן שכותרתו סמנים חלבונים ו אורגל. בנוסף, בגודל קטן של זחל והאשכים גולמי, ואת היכולת תמונה חלוקת תאים קרוב מאוד שמיכות זכוכית, להפוך את השיטה אידיאלית עבור ד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מחלקת ההגנה הסטארט-up לJ.T.S.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5 "ניתוח בדיקהפישר08-965-A
5.75 אינץ' זכוכית פסטר פיפטפישר13-678-20A
סרום בקר אלבומין (BSA)פישרBP9703-100
דומונט #5 מלקחייםכלי מדע עדינים11252-20תפיסות ישרות עם טיפים עדינים
שקופיות מיקרוסקופ חלביפישר12-544-2שקופיות להרכבת רקמה קבועה, עם משטח כתיבה חלבי
שמן הלוקרבון 700סיגמאH8898-100 מ"ל
צלחת Lumox 50SarstedtSAR946077410צלחת תרבית רקמות חדירה לגז
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתפישר12-541-B22 מ"מ x 22 מ"מ, #1.5 כיסוי זכוכית
סיכות MinutienFine Science Tools26002-15סיכות חרקים המשמשות לייצור כלי אזמל
מחזיק סיכה מצופה ניקלכלי מדע עדינים26018-17
תמיסת פרפורמלדהיד 32%,מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15714
תוכנית שקופיות מיקרוסקופ קצה משופעפישר12-549-5שקופיות המשמשות לנתיחות
צלחות ספוט פיירקספישר13-748Bצלחת
חיתוך זכוכית 9 בארותמסנן מזרק Drosophila בינוני פישר21720-024
, 0.22 ומיקרו; mEMD MilliporeSLGS033SB
Triton X-100FisherBP151-500
VectashieldVector LabsH-1000מיקרוסקופיה הרכבה בינונית
בדרגת EM של שניידר

מקורות

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111(2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456(2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8(2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460(2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058(2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868(2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אשכים של דרוזופיליהדימוג חימיקרוסקופיה של צילומי רצף (Time-lapse)דיסקציה של אשכיםניתוח ספרמטוציטיםמיקרוסקופיה קונפוקליתמיקרוסקופיה פלורסצנטיתהכנת רקמותכלים גנטיים
הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.