הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לכידת DNA סביבתי (eDNA) מדגימות מים על ידי פלוקולציה

3.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60967

⸱

29 במאי 2020

1Leetown Science Center, U.S. Geological Survey

במאמר זה

סיכום

DNA סביבתי (eDNA) נלכד בדרך כלל מדגימות מים באמצעות משקעי אלכוהול, סינון או פלוקולציה. מוצג כאן פרוטוקול חלופי המשתמש בלנתנום כלוריד כדי לאפשר איסוף של חומצות גרעין מומסות וקשורות לחלקיקים מדגימות מים המכילות תאים אוקריוטיים, תאים פרוקריוטיים ווירוס.

תקציר

ניתוח ה-DNA הסביבתי (eDNA) הפך לגישה בשימוש נרחב לפתרון בעיות בניהול מינים. איתור מינים קריפטיים כולל מינים פולשים ו/או מינים בסיכון היא המטרה, המושגת בדרך כלל על ידי בדיקת מים ומשקעים לנוכחות חתימות DNA אופייניות. נדרשים נהלים אמינים ויעילים ללכידת דנ"א סביבתי, במיוחד אלה שיכולים להתבצע בקלות בשטח על ידי צוות עם הכשרה מוגבלת ומדענים אזרחיים. לכידת eDNA באמצעות סינון ממברנה נמצאת בשימוש נרחב כיום. לגישה זו יש בעיות אינהרנטיות הכוללות את בחירת חומר המסנן והנקבוביות, עכירות מסנן והזמן הנדרש באתר לביצוע התהליך. פלוקולציה מציעה חלופה הניתנת ליישום בקלות על משטרי דגימה השואפים לכסות שטחים נרחבים בזמן מוגבל.

מבוא

לפני אמצע שנות ה-2000, המונח "DNA סביבתי" שימש בדרך כלל להתייחסות ל-DNA המתקבל מחיידקי מים וקרקע, אם כי שימוש מסוים לזיהוי DNA של בני אדם ובעלי חיים למטרות מעקב אחר מקורות צואה או זיהוי מינים לא מקומייםהחל 1,2,3. כיום, DNA סביבתי משמש בדרך כלל לתיאור DNA מתאים שנלקחו מאורגניזמים אוקריוטיים, וניתוח DNA זה הפך לכלי ניהול בשימוש נרחב. איתור מינים קריפטיים, כולל כאלה שהם פולשים או מינים בסיכון, הוא המטרה, המושגת בדרך כלל על ידי בדיקת מים או משקעים לנוכחות חתימות ה-DNA האופייניות של מין המטרה. מחקרים עשויים להתמקד במין יחיד מעניין באמצעות בדיקת PCR ספציפית (דגימה פעילה), או שמינים רבים עשויים להיות מזוהים בו זמנית באמצעות מטא-ברקוד וריצוף מקביל מסיבי.

שיפורים רבים באיסוף דגימות, עיבוד דגימות וניתוח נתונים הקשורים למחקר eDNA נעשו במהלך שני העשורים האחרונים. מחקרים מוקדמים השתמשו במשקעי אלכוהול כדי ללכוד DNA מדגימות מים3. למרות שנוסה ונכון, הצורך לנתח כמויות מים גדולות כדי להגביר את רגישות הבדיקה הופך את השיטה הזו ללא אטרקטיבית בשל הדרישה האופיינית לשני נפחים של אתנול לכל נפח דגימת מים.

מחקרים מאוחרים יותר השתמשו בדרך כלל בסינון ממברנה, ונימקו כי דנ"א סביבתי קיים ברצף של מצבים מקשר תאית להמסה חופשית, אך הדנ"א המומס נתון לפירוק מהיר ולכן הדנ"א הקשור לתא מייצג את החלק המשמעותי ביותר. אופטימיזציה של חומר סינון וגודל נקבוביות נדונה ונדונה בהרחבה כמו גם השיטות האופטימליות לחילוץ eDNA שנלכד מהמסנן 4,5,6.

גישה שלישית ללכידת דנ"א סביבתי היא פלוקולציה, תהליך ששימש במשך מאות שנים להבהרת נוזלים כולל מים, בירה ויין. מספר מחקרים השתמשו בפלוקולציה כדי ללכוד וירוסים ממקורות מים טבעיים או ראויים לשתייה 7,8,9,10,11. מחקרים אלה השתמשו בדרך כלל בחלב דל שומן או בברזל כלוריד כחומרי לכידה. שיטות ברזל כלוריד גורמות בדרך כלל לבעיות מולקולריות בניתוח במורד הזרם עקב עיכוב תגובת PCR12,13. שיטות המשתמשות בחלב דל שומן לפני הפלוקולנט דורשות הכנה מוקדמת של הפלוקולנט, בקרת pH, ועד כה יושמו רק על לכידת נגיף 7,8,9.

לאחרונה, לכידת פלוקולציה של חיידקים ווירוסים על בסיס שימוש בלנתנום (III) כלוריד נחקרה 12,13,14,15. המחברים הראו כי ניתן לאסוף פתוגנים ברי קיימא בשיטה זו מכיוון שקשירת לנתנום כלוריד הייתה יעילה בריכוז נמוך (0.2 מ"מ). יתר על כן, פלוקולציה של לנתנום הפיכה באמצעות כלציה בתנאים קלים בניגוד לזה של ברזל כלוריד.

לפיכך, פלוקולציה באמצעות לנתנום כלוריד ללכידת חלקיקים ביולוגיים היא אטרקטיבית בהתחשב בכך שנדרשת רק כמות קטנה של חומר פלוקולציה מרוכז נוסף, אין צורך בבקרת pH קפדנית, ונפחי הדגימה ניתנים להרחבה ממיליליטר לגלונים. כפי שמיושם על לכידת eDNA, DNA תאי, תת-תאי (מיטוכונדריה וכלורופלסטים) כמו גם DNA מומס מתאוששים בקלות. חיידקים ווירוסים נאספים בו זמנית ומאפשרים בדיקת פתוגנים ו/או מחקרים אקולוגיים נוספים מדגימת מים אחת. מוצג פרוטוקול פלוקולציה באמצעות לנתנום כלוריד המאפשר איסוף של חומצות גרעין מומסות וקשורות לחלקיקים מדגימות מים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. טיהור ציוד והכנת ריאגנטים פלוקולציה

  1. יש לשטוף היטב את כל הבקבוקים, הצינורות וציוד אחר ששימש בעבר עם חומר ניקוי לשטיפת כלים ומים חמים.
  2. רססו את כל הבקבוקים, הצינורות וציוד אחר ששימש בעבר בתמיסת חומצת לימון של 6% כדי להסיר משקעי מינרלים, הניחו לעמוד 20 דקות ושטפו במי ברז.
  3. הוסף תמיסה של אקונומיקה ביתית מדוללת פי 10 (ריכוז סופי של 0.5-0.6% של נתרן היפוכלוריט) לכל הבקבוקים (כ-10% מנפח המיכל), לנער, לתת לו לעמוד לפחות שעה, ואז לנקז ולשטוף במי ברז עד שלא נשאר זכר לאקונומיקה. לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת במים נטולי יונים.
  4. יבש את כל הבקבוקים.
  5. הניחו את כל בקבוקי האיסוף והפקקים בארון בטיחות ביולוגי והקרינו באמצעות מנורות קוטל חיידקים אולטרה סגול למשך שעתיים תוך סיבוב כל בקבוק ומכסה רבע סיבוב כל חצי שעה.
  6. יש להניח את הפקקים על הבקבוקים ולהבריג כלפי מטה באופן רופף. שקלו כל בקבוק ורשמו את משקלו הריק על הבקבוק.
  7. הכן תמיסה של 100 מ"מ של לנתנום (III) כלוריד הפטהידרט על ידי המסת 3.71 גרם ב-100 מ"ל מים נטולי יונים. כדי למזער את חשיפת הכימיקל לאוויר, מכיוון שלנתנום כלוריד הוא היגרוסקופי, אטמו את הבקבוק בנייר דבק בין השימושים.
    זהירות: לנתנום כלוריד נושא את הצהרת האזהרה של מילת האות. H315 גורם לגירוי בעור. H319 גורם לגירוי חמור בעיניים. H335 עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. השתמש בציוד מגן אישי. עיין ב-SDS של החומר למידע נוסף.
  8. הכן תמיסה של 1 M של נתרן ביקרבונט על ידי המסת 84.01 גרם נתרן ביקרבונט ב-1 ליטר מים נטולי יונים. מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורת החדר.

2. איסוף דגימות ופלוקולציה

  1. אסוף דגימות מכל אתר בתוספת שדה ריק אחד (דגימה המכילה מי שתייה ממולאים באתר כדי לשלוט בזיהום) על ידי מילוי בקבוקים בגודל מתאים. התאם את מספר הדגימות שנלקחו בהתאם לתכנון הניסוי ולמטרה המיועדת. אין למלא יתר על המידה בקבוקים מעבר לכתף הבקבוק כדי לאפשר את ההתרחבות אם יש להקפיא דגימות.
  2. הקלט מטא נתונים רלוונטיים כולל תאריך, שעה ומיקום GPS. הוספת תווית לגורמים מכילים לדוגמה.
  3. הוסף תמיסת נתרן ביקרבונט 1 M לכל דגימה ושדה ריק. הוסף 10 מ"ל לכל דגימה של 500 מ"ל.
  4. מכסים את הבקבוקים ומערבבים.
  5. הוסף 100 מ"מ לנתנום כלוריד לכל דגימה וריק שדה. הוסף 1 מ"ל לכל דגימה של 500 מ"ל.
  6. מכסים ומערבבים היטב. השתמש בסרט חשמלי כדי לאבטח את המכסה.
  7. יש לאחסן על קרח עד להחזרתן למעבדת השדה, ואז ניתן לאחסן את הדגימות למשך הלילה בקירור ובעמידה זקופה כדי לאפשר לפלקים להתיישב בתחתית המכולה או להקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשלוח למעבדה שנייה להמשך עיבוד. יש להקפיא דגימות בעמידה זקופה כדי לאפשר את התפשטות הנוזל ולמנוע קרע במיכל.

3. עיבוד פלוקים

  1. הפשירו דגימות קפואות בטמפרטורת החדר בצידנית או העבירו דגימות שלא הוקפאו לאזור שולחן עבודה מתאים הכולל משאבה פריסטטית ומערך צינורות לשאיבת דגימות. ודא שהצינור העובר דרך המשאבה הפריסטלטית מתפרק לדלי גדול על הרצפה. הצריכה צריכה להיות מצוידת בקש שתייה נקי מפלסטיק לשליטה בצריכה.
  2. השתמש במשאבה הפריסטלטית כדי להסיר את הסופרנטנט על ידי שימוש בקשית השתייה כדי לכוון את היניקה תחילה ממש מתחת לפני הנוזל והזזת צריכת הקשית כלפי מטה עם מפלס הנוזל. הסירו את אחרון הסופרנטנט על ידי הזזת המנה בזהירות כדי לנוח על הפונטיל (גומה מוגבהת בתחתית הבקבוק). זה מאפשר סילוק נוזלים מקסימלי בזמן שהפלוקים נאספים סביב הפריפריה (ראה איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: אוסף של פלוקים שהתיישבו ביחידת כבידה. פלוקים שמכילים חומר תאי ודנ"א סביבתי מיושבים בתחתית בקבוק הדגימה, ומוכנים לשחזור אחרי הסרת הסופרנטנט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. חבר קשית שתייה נקייה וחזור על הסרת הסופרנטנט עבור כל דגימה.
  2. השתמש בבקר פיפטה ופיפטה נקי של 20 מ"ל כדי להעביר את מתלה הפלוק לחלוטין לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. השתמש בשטיפות מים נטולות יונים בנפח נמוך (כ-5 מ"ל) כדי להבטיח שכל שאריות הפלקים יתאוששו מבקבוק הדגימה.
  3. כוונן את כל הצינורות של 50 מ"ל לנפחים שווים עם מים נטולי יונים ואסוף את הפלוצ'ים על ידי צנטריפוגה ב-2,500 x גרם למשך 20 דקות.
  4. יוצקים את הסופרנטנט וגורמים לצינורות לעמוד הפוך על מגבת נייר נקייה לניקוז.
  5. השעו מחדש את הפלקים ב-1 מ"ל של 0.5 M EDTA, pH 8.0 על ידי ערבוב מערבולת ולאחר מכן הוסיפו 4 מ"ל תמיסת TE 1x, pH 8.0 וערבבו שוב. העבירו את הפלקים התלויים לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 10% פוליאקרילאמיד ליניארי ומערבולת. מוסיפים 5 מ"ל 100% איזופרופנול, מערבבים ונותנים לו לעמוד על קרח למשך 20 דקות.
  6. צנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך 20 דקות לאיסוף DNA וחלקיקים תאיים. יוצקים את הסופרנטנטים ונותנים לו לעמוד הפוך על מגבות נייר נקיות לניקוז. מניחים לייבוש קל, אך לא לייבש יתר על המידה.
  7. התחל בתהליך מיצוי ה-DNA של פלוק באמצעות ערכה מסחרית המשתמשת במכות חרוזים וקשירת עמוד ספין בקיבולת של 25 מיקרוגרם.
    1. ראשית, השעו מחדש את הפלקים ב-800 מיקרוליטר של מאגר הליזיס המסופק עם הערכה והעבירו לחלוטין את המתלה לצינור מכות חרוזים. חרוז ניצח את מתלי הפלוק בפרקי זמן קצרים עם קירור ביניהם. ניתן לאחסן הומוגנטים קפואים בשלב זה או להמשיך עם פרוטוקול הערכה.
    2. מסלק את ה-DNA מעמודת הספין תחילה עם 100 מיקרוליטר, ולאחר מכן מחזר את ה-eluate דרך צינור הספין.
    3. לבסוף, הוצא את שאריות ה-DNA מהעמודה עם תוספת של 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה כדי ליצור נפח כולל של 200 מיקרוליטר. זה ממקסם את ההתאוששות.
  8. אסוף, הכן ונתח eDNA כדי להדגים את הביצועים של פרוטוקול זה ואת ביצועיו ביחס לשיטת הסינון הנפוצה.
    1. הכן תגובות המכילות תערובת מאסטר של 1x qPCR, 25 מיקרוגרם/מ"ל תרומבין בקר14,16, 0.4 מיקרומטר קדימה ואחורה, ו-2 מיקרוליטר של תבנית (1% מה-DNA של הדגימה המשוחזרת). בנה עקומות סטנדרטיות באמצעות דילולים סדרתיים של אמפליקונים PCR מטוהרים ומכומתים שנוצרו באמצעות DNA שובר. לחלופין, ניתן לסנתז מטרות באופן מסחרי.
    2. השתמש בשיטת כימות השוואתית אם אין תקן זמין. לדוגמא זו, בצע מחזור תרמי בתנאי תגובה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 57 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, אם כי יש להתאים תנאים אלה לבדיקות אחרות. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שמונה דגימות מים של 500 מ"ל (450 מ"ל כל אחת) שנלקחו מאקווריום שבו שני צבים צבועים מהמזרח (Chrysemys picta picta) שימשו להכנת דנ"א סביבתי באמצעות הפרוטוקול המתואר. שמונה דגימות מים נוספות של 500 מ"ל סוננו על גבי מסנני סיבי זכוכית של 47 מ"מ בעלי נקבוביות של 1.5 מיקרומטר ללא קלסר ו-eDNA חולץ באותה שיטת מיצוי המשמשת לפרוטוקול הפלוקולציה. DNA שהוכן בשתי השיטות נותח באמצעות PCR כמותי המכוון לאזור הבקרה המיטוכונדריאלי של מין המטרה ומשתמש בפריימרים קדימה ואחורה ספציפיים לאורגניזם המטרה. אורגניזם היעד להדגמה זו היה C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שטכניקה זו פשוטה, כמה שלבים הם קריטיים להצלחה. האיסוף וההעברה של הפלוק חייבים להיעשות לחלוטין כדי לא לאבד DNA. יש לאסוף חומר שיורי באמצעות שטיפות אסטרטגיות. הפרוטוקול המתואר משתמש בערכת מיצוי DNA מסחרית לעיבוד סופי של חומר מפוזר. שיטות מיצוי אחרות עשויות לבצע ביצועים דומים או עשויות להיות טובות יותר בביצועים, אך שינויים בחלק זה של הפרוטוקול לא נבדקו באופן ממצה.

הפרוטוקול המתואר שימושי לאסטרטגיות דגימה הדורשות לקיחת דגימות מאתרים מפוזרים באופן נרחב עם הפר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחבר אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו הושלמה במימון הסקר הגיאולוגי של ארצות הברית.

כל שימוש בשמות מסחריים, חברות או מוצרים הוא למטרות תיאוריות בלבד ואינו מרמז על תמיכה של ממשלת ארה"ב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5M EDTA, pH 8.0זמין ממספר מקורות
1 x TE Buffer, pH 8.0זמין ממספר מקורות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםלשימוש
16 אונקיות בקבוקים מרובעים שקופים PETלשימוש חוזר עם ניקוי וטיהור
38/400 מכסה פוליפרופילן עם רגיש ללחץ תוחםיש להשאיר את הפקקים מחוברים באופן רופף עד לשימוש. יש לסגור היטב כדי לאטום את הבטנה הרגישה ללחץ.
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ללשימוש
6% תמיסת חומצת לימוןהשתמש להסרת משקעי מינרלים מבקבוקי דגימה לשימוש חוזר.
ערכת חיידקי צואה/אדמההשתמש במעכב הסרת שרף או עמוד
לנתנום (III) כלוריד הפטהידראט100 מ"מ תמיסת
משאבת DC פריסטלטיתכל משאבה פריסטלטית תעשה, או שניתן לסיפון
נושא פוליאקריל10% פוליאקרילאמיד
נתרן ביקרבונט1 מ ', מסנן מעוקר ומאוחסן בטמפרטורת
מסחרייםמסחרייםחד פעמי: חד פעמימלאיליניארי החדר

מקורות

  1. Mathes, M. V., et al. Presumptive Sources of Fecal Contamination in Four Tributaries to the New River Gorge National River, West Virginia, 2004. , Report No. 2007-1107 (2007).
  2. Caldwell, J. M., Raley, M. E., Levine, J. F. Mitochondrial Multiplex Real-Time PCR as a Source Tracking Method in Fecal-Contaminated Effluents. Environmental Science & Technology. 41 (9), 3277-3283 (2007).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology Letters. 4 (4), 423-425 (2008).
  4. Djurhuus, A., et al. Evaluation of Filtration and DNA Extraction Methods for Environmental DNA Biodiversity Assessments across Multiple Trophic Levels. Frontiers in Marine Science. 4 (314), (2017).
  5. Hinlo, R., Gleeson, D., Lintermans, M., Furlan, E. Methods to maximise recovery of environmental DNA from water samples. PLOS One. 12 (6), 0179251(2017).
  6. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Scientific reports. 8 (1), 4682(2018).
  7. Aguado, D., et al. A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. Journal of Visualized Experiments. (147), e58463(2019).
  8. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  9. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  10. Payment, P., Fortin, S., Trudel, M. Ferric chloride flocculation for nonflocculating beef extract preparations. Applied Environmental Microbiology. 47 (3), 591-592 (1984).
  11. Poulos, B. T., John, S. G., Sullivan, M. B. Iron Chloride Flocculation of Bacteriophages from Seawater. Methods Molecular Biology. 1681, 49-57 (2018).
  12. Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Hu, Z. Lanthanum-based concentration and microrespirometric detection of microbes in water. Water Research. 44 (11), 3385-3392 (2010).
  13. Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Hu, Z. Determination of low-density Escherichia coli and Helicobacter pylori suspensions in water. Water Research. 46 (7), 2140-2148 (2012).
  14. Schill, W. B., Galbraith, H. S. Detecting the undetectable: Characterization, optimization, and validation of an eDNA detection assay for the federally endangered dwarf wedgemussel, Alasmidonta heterodon (Bivalvia: Unionoida). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 29 (4), 603-611 (2019).
  15. Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Purdy, G. A., Hu, Z. Development of a virus concentration method using lanthanum-based chemical flocculation coupled with modified membrane filtration procedures. Journal of Virology Methods. 190 (1-2), 41-48 (2013).
  16. Zhang, Y., et al. Bovine thrombin enhances the efficiency and specificity of polymerase chain reaction. BioTechniques. 57 (6), 289-294 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

eDNA

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.