הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חיסול נוירונים סרוטונרגיים על ידי הזרקה סטריאוטקסית של 5,7-דיהידרוקסיטריפטמין בגרעיני הראפ הגביים של עכברים

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60968

⸱

1 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, Frontier Science Center for Stem Cell Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Department of Ophthalmology, Shanghai Tenth People's Hospital Affiliated to Tongji University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר נגוע בגרעין רפה גבי (DRN) (שיעור הישרדות של >90% בעכברי ניסוי) עם אובדן יציב של נוירונים סרוטונרגיים גביים על ידי הזרקה סטריאוטקסית של 5,7-דיהידרוקסיטריפטמין לתוך ה-DRN באמצעות גישה זוויתית למניעת פגיעה בסינוס הסגיטלי העליון.

תקציר

הזרקה סטריאוטקסית נמצאת בשימוש נרחב להעברה ישירה של תרכובות או וירוסים לאזורי מוח ממוקדים במכרסמים. מיקוד ישיר של נוירונים סרוטונרגיים בגרעין הראפ הגבי (DRN) עלול לגרום לדימום מוגזם ולמוות של בעלי חיים, בשל מיקומו מתחת לסינוס הסגיטלי העליון (SSS). פרוטוקול זה מתאר את היצירה של מודל עכבר נגע בנוירונים סרוטונרגיים DRN (>שיעור הישרדות של 90%) עם אובדן יציב של >70% תאים חיוביים ל-5-HT ב-DRN. הנגע נגרם על ידי הזרקה סטריאוטקסית של נוירוטוקסין סרוטונרגי סלקטיבי 5,7-דיהידרוקסיטריפטמין (5,7-DHT) לתוך ה-DRN באמצעות גישה זוויתית (30 מעלות בכיוון הקדמי/אחורי) כדי למנוע פגיעה ב-SSS. עכברים נגועים בנוירונים סרוטונרגיים DRN מציגים שינויים התנהגותיים הקשורים לחרדה, מה שעוזר לאשר את הצלחת ניתוח נגע DRN. שיטה זו משמשת כאן עבור נגעי DRN, אך ניתן להשתמש בה גם עבור זריקות סטריאוטקסיות אחרות הדורשות הזרקות זוויתיות כדי להימנע ממבני קו האמצע. מודל זה של עכברים נגעי נוירון סרוטונרגיים DRN מספק כלי רב ערך להבנת תפקידם של נוירונים סרוטונרגיים בפתוגנזה של הפרעות פסיכיאטריות, כגון הפרעת חרדה כללית והפרעת דיכאון מג'ורי.

מבוא

סרוטונין, או 5-הידרוקסיטריפטמין (5-HT), הוא מוליך עצבי חשוב המיוצר בעיקר במעיים ובמוח ומשפיע על מגוון תפקודים פסיכולוגיים. במערכת העצבים המרכזית (CNS), המערכת הסרוטונרגית ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות מצב הרוח וההתנהגות החברתית, שינה וערות, תיאבון, זיכרון ותשוקה מינית. במערכת העצבים המרכזית, סרוטונין מסונתז על ידי נוירונים סרוטונרגיים, אותם ניתן להפריד לשתי הקבוצות הבאות: הקבוצה הרוסטרלית, שיש לה הקרנות עולות המעצבנות כמעט את כל המוח; וקבוצת הזנב, המקרינה בעיקר לחוט השדרה1. הקבוצה הרוסטרלית, המכילה כ -85% מהנוירונים הסרוטונרגיים במוח, מורכבת מהגרעין הליניארי הזנבי, גרעין הראפ החציוני ו- DRN, בו נמצאת האוכלוסייה הגדולה ביותר של נוירונים סרוטונרגיים במוח.

בדרך כלל מאמינים כי חוסר ויסות של המערכת הסרוטונרגית קשור לפתוגנזה של הפרעת דיכאון מג'ורי (MDD) והפרעות חרדה כלליות (GAD)2. זאת בשל העובדה שמעכבי ספיגה חוזרת סלקטיביים של סרוטונין (SSRI) הם טיפול תרופתי יעיל להפרעות פסיכיאטריות אלו 3,4. בנוסף, עדויות מצטברות מצביעות על כך שמאניה5 והתנהגות אובדנית6 עשויות להיות קשורות לרמות נמוכות יותר של תפקוד סרוטונין ב-DRN. כמו כן דווח כי Pet1-Cre; עכברי Lmx1bflox/flox ועכברי hTM-DTAiPet1 (מודלים גנטיים של עכברים חסרים את רוב הנוירונים הסרוטונרגיים המרכזיים משלבעוברי מאוחר 7 ובגרות8, בהתאמה) מציגים זיכרון פחד הקשרי משופר. עם זאת, למרות מחקר מקיף, המעורבות המדויקת של נוירונים סרוטונרגיים DRN בהפרעות פסיכיאטריות אלה עדיין לא ברורה.

על מנת לחקור את המנגנונים שבאמצעותם נוירונים סרוטונרגיים DRN מווסתים את הפתוגנזה של ההפרעות הפסיכיאטריות הקשורות לסרוטונין, נוצרו מודלים של בעלי חיים. כלים אופטוגנטיים יושמו כדי לעכב נוירונים סרוטונרגיים ב-DRN של חולדות, ובעלי חיים אלה מציגים התנהגויות דמויות חרדה מוגברות9. עם זאת, לאופטוגנטיקה יש מגבלות. לדוגמה, יש להשתיל מכשיר להעברת אור באזור הממוקד בעומק המוח, והרקמה שמסביב עלולה להיפגע במהלך ניתוח השתלה או מחום הנפלט ממכשיר האור. גם אם שינוי הטמפרטורה אינו גורם לנזק לרקמת המוח הניתן לזיהוי, הוא עדיין יכול לגרום להשפעות פיזיולוגיות והתנהגותיות יוצאות דופן10.

מניפולציה פרמקולוגית עשויה להיות גישה קלה יותר ליצירת מודלים של בעלי חיים נגעי נוירון סרוטונרגיים DRN. קבוצות מסוימות יצרו חולדות נגעות נוירון סרוטונרגיות DRN על ידי מיקרו-הזרקה סטריאוטקסית של נוירוטוקסין סרוטונין 5,7-DHT ב-DRN. עם זאת, מודלים אלה של חולדות מציגים שינויים התנהגותיים שונים, כגון התנהגות חרדה11, התנהגות דמוית חרדה מוגברת12 ופגיעה בזיכרון אובייקטים13. למרות מחקרים רבים בחולדות, נערכו פחות מחקרים על ההשפעות של 5,7-DHT על עכברים. קבוצה אחת דיווחה על תמותה מוגזמת (>50%) ודלדול סרוטונין מוגבל בעכברי ניסוי שקיבלו מיקרו-זריקות סטריאוטקסיות של 5,7-DHT ב-DRN14. קבוצה אחרת דיווחה כי מתח מתון כרוני בלתי צפוי (UCMS) יכול לגרום לשינוי משמעותי בחביון ההתקפה בעכברים נגעי DRN המושרים על ידי 5,7-DHT. עם זאת, לא סופקו תוצאות היסטולוגיות כדי לאשר את אובדן הנוירונים הסרוטונרגיים המדויק ב-DRN15. הזרקה סטריאוטקסית ב-DRN באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות עלולה להוביל לדימום מסיבי ולתמותה גבוהה לעכברים, בהתחשב בעובדה שהמיקום האנטומי של DRN נמוך מ-SSS16.

פרוטוקול זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת מודל עכבר נגע בנוירונים סרוטונרגיים DRN (שיעור הישרדות של >90% של עכברי הניסוי) עם אובדן יציב של נוירונים סרוטונרגיים DRN על ידי הזרקה סטריאוטקסית של 5,7-DHT. ההזרקה ב-DRN משתמשת בגישה זוויתית כדי למנוע את הפגיעה ב-SSS. ניתוח זה גורם באופן עקבי לאובדן של >70% של נוירון סרוטונרגי ב-DRN של עכברים, והוא מייצר שינויים התנהגותיים הקשורים לחרדה. הפרוטוקול המשמש כאן מיועד להשראת נגעי DRN, אך הוא יכול להיות שימושי גם לחוקרים שרוצים לבצע הזרקות סטריאוטקסיות במבנים אחרים של קו האמצע. בנוסף, מודל זה של עכברים נגעי נוירון סרוטונרגיים DRN מספק כלי רב ערך להבנת תפקידם של נוירונים סרוטונרגיים בהפרעות פסיכיאטריות (כלומר, MDD ו-GAD) ולהערכת סוכנים נוירו-פרוטקטיביים פוטנציאליים או אסטרטגיות טיפוליות למצבים אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההתערבויות הכירורגיות וההליכים לטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים של בית הספר למדעי החיים והטכנולוגיה, אוניברסיטת טונג'י, שנחאי, סין.

1. דיור בעלי חיים

  1. שמור על עכברי C57BL/6NCrl זכרים (בני 10 שבועות, 25 גרם, n = 21) בתנאים סטנדרטיים (טמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס; 55% לחות) במחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות.
  2. לספק מזון ומים אד ליביטום.
    הערה: כאן, שלושה מהעכברים משמשים לאישור מסלול המחט.

2. הכנת ריאגנטים

הערה: יש לבצע את כל שלבי הכנת התרופה במכסה זרימה למינרי כדי למנוע זיהום. כל התמיסות המוכנות מאוחסנות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. מומלץ להשתמש במנה אחת בכל פעם, להפשיר לחלוטין, לערבב היטב לפני השימוש, להשליך את השאריות בשפופרת ולהימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.

  1. ממיסים 0.25 גרם של דזיפרמין הידרוכלוריד ב-100 מ"ל של 0.9% מי מלח כדי לייצר תמיסה של 2.5 מ"ג/מ"ל. עקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק עם קרום PES הידרופילי בגודל 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, יש לצרף את התמיסה (1.8 מ"ל/צינור) בצינורות מיקרו-צנטריפוגה (EP) של 2 מ"ל. סמנו, תאריכו ושמרו מיד במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. המינון המומלץ לשימוש בבעלי חיים הוא 25 מ"ג/ק"ג.
  2. ממיסים 5 מ"ג של 5,7-DHT ב-1.67 מ"ל של 0.9% מי מלח המכילים 0.1% חומצה אסקורבית כדי להניב תמיסה של 3 מיקרוגרם/מיקרוליטר. מערבולת בעדינות לערבב, עקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק (גודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר), והשתמש בתמיסה (10 מיקרוליטר / צינור) בצינורות EP של 0.5 מ"ל. סמן, תאריך והקפיא מיד ב-80 מעלות צלזיוס. המינון המומלץ לשימוש בבעלי חיים הוא 2 מיקרוליטר לעכבר.
  3. ממיסים קטופרופן (משכך כאבים) לפי השיטה שתוארה קודם לכן17. ממיסים 250 מ"ג קטופרופן ב-15 מ"ל מים ו-1 מ"ל של 1 מ"ל NaOH, התאימו את ה-pH ל-7.3 והרכיבו את הנפח הסופי ל-125 מ"ל, מה שיביא לריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל. עקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר וחלק את התמיסה (0.4 מ"ל/צינור) בצינורות EP של 1.5 מ"ל. יש לתייג, לתארך ולהקפיא בחום של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. המינון המומלץ לשימוש בבעלי חיים הוא 5 מ"ג/ק"ג.

3. הכנת מכשירים ועכברים

  1. הכן חבילה כירורגית (המכילה אזמל, זוג מלקחיים לרקמות, זוג מספריים, מחזיק מחט, 3-0 תפרים, תגי אוזניים ומוליך תג אוזן) שעוקרה בעבר באוטוקלאבים בטמפרטורה גבוהה. הניחו 75% אתנול, פובידון-יוד, 3% מי חמצן, תמיסת רכב (0.1% חומצה אסקורבית ב-0.9% מי מלח), צמר גפן, משחת עיניים אופלוקסצין וכלוב התאוששות עכבר על גבי כרית חימום, באמצעות מזרק המילטון עם מחט 32 גרם ומזרק 1 סמ"ק.
  2. h לפני הזרקת 5,7-DHT, שקלו ורשמו את משקל הגוף של העכברים, ולאחר מכן חשפו אותם לזריקות תוך-צפקיות (i.p) של דזיפרמין (2.5 מ"ג/מ"ל, משקל 10 מיקרוליטר/גרם).
    הערה: מטרת מתן דזיפרמין שעה אחת לפני הזרקת 5,7-DHT היא למנוע אובדן תאים קטכולמינירגיים18.
  3. להרדים עכברים באמצעות הרדמה באינהלציה איזופלורן (3% במהלך האינדוקציה, 1.5% במהלך התחזוקה, קצב זרימה = 2 ליטר לדקה). יש לתת קטופרופן (2 מ"ג/מ"ל, משקל 2.5 מיקרוליטר/גרם) באמצעות הזרקה תת-עורית (s.c). ודא עומק הרדמה הולם על ידי היעדר תגובת צביטה בזנב.

4. הזרקה סטריאוטקסית

  1. הנח את העכבר המורדם על הפלטפורמה הסטריאוטקסית, ואז קבע את ראשו עם מוטות האוזניים ומוט החותכות של המנגנון הסטריאוטקסי.
  2. גלחו את ראשו של העכבר, ולאחר מכן נקו את הקרקפת החשופה עם פילינג אחד של 75% אתנול ואחריו פילינג אחד של פובידון-יוד.
  3. מרחו משחת לידוקאין על הקרקפת בעזרת צמר גפן כדי לספק משככי כאבים מקומיים. מרחו משחת עיניים ofloxacin על העיניים כדי להגן על הקרנית.
  4. בצע חתך בקרקפת לאורך קו האמצע באמצעות אזמל מ-1 מ"מ אחורי העיניים ועד לקו הבין-אוזני.
  5. השתמש בספוגית ספוגה במי חמצן 3% כדי להסיר את הפריאוסטאום, ולאחר מכן יבש את הגולגולת וחשוף את תפרי הגולגולת. סמן את מיקום הברגמה והלמבדה.
  6. כוונן את מיקום הראש באמצעות מוט החותך עד שהברגמה והלמבדה מונחים באותו מישור אופקי. כוונן את קצה המחט כך שייגע בברגמה או בלמבדה, הקלט את הקואורדינטות המדיאליות/רוחביות (ML) והגב/גחון (DV), והתאם את מוט החותך כך שקואורדינטות ה-DV וה-ML של ברגמה ולמבדה יהיו שוות, בהתאמה.
  7. בטל את נעילת לחצן המיקום הניצב ובורג הנעילה, ולאחר מכן הגדר את זרוע המניפולטור (ציר z) ל-30° בכיוון הקדמי/אחורי (AP) כפי שמוצג באיור 1A,B. נעל את הכפתור.
  8. קבע את מזרק המילטון המלא ב-2 מיקרוליטר של 5,7-DHT (3 מיקרוגרם/מיקרוליטר) על המחזיק (עבור קבוצת הדמה, עכברים מוזרקים עם 0.9% מלח המכיל 0.1% חומצה אסקורבית). כוונן את קצה המחט כך שייגע בציון הדרך של ברגמה, ולאחר מכן אפס את ערכי ה-ML, AP וה-DV באמצעות מודול התצוגה הדיגיטלית.
    הערה: תמיסת 5,7-DHT היא נוזל בצבע חום, מה שמקל על הקביעה אם מזרק המילטון מלא כהלכה. אם אין גישה למודול תצוגה דיגיטלית, רשום את המספר המוצג בשלושה צירים כאשר קצה המחט נוגע בברגמה, והקואורדינטות הסופיות מייצגות את "המספר המוקלט בתוספת הקואורדינטות המסופקות בפרוטוקול זה". לדוגמה, אם המספר הרשום על זרוע המניפולטור של ציר ה-y (כיוון A/P) הוא "a", אז הקואורדינטות הסופיות בכיוון A/P צריכות להיות "a - 6.27".
  9. הזז את זרוע המניפולטור כדי לכוונן את קצה המחט למצב ההזרקה (APa = -6.27, ML = 0; הנוסחה לחישוב הקואורדינטות הסופיות מפורטת באיור 1B). סמן את מיקום היעד באמצעות עט טוש.
  10. קדחו את חור הבור באמצעות מקדחה ניידת במהירות גבוהה של מיקרו-מוטורים, ולאחר מכן הזיזו את זרוע המניפולטור כדי להוריד את קצה המחט למטרה (DVa = -4.04). הזריק 2 מיקרוליטר מהתמיסה למוח באיטיות (0.5 מיקרוליטר / 3 דקות), תוך שמירה על המחט באתרה למשך 5 דקות נוספות כדי למנוע דליפת תמיסה. הסר את המחט בעדינות לאחר ההזרקה.
  11. יש למרוח תפרים קטועים על החתך באמצעות 3-0 תפרים. עטפו את החתך התפור במקלון צמר גפן ספוג בפובידון יוד כדי למנוע זיהום.
  12. נקו את האוזן הימנית בעזרת צמר גפן פובידון-יוד, ולאחר מכן הניחו את תג האוזן המעוקר על בסיס האוזן לזיהוי.
  13. הסר עכברי ניסוי מהמנגנון הסטריאוטקסי והנח בכלוב התאוששות עכברים על גבי כרית חימום עד להחלמה מלאה מההרדמה.

5. טיפול לאחר ניתוח בעכברים

  1. לחשוף עכברים לזריקות של קטופרופן פעם אחת ביום עד יומיים לאחר הניתוח.
  2. בדוק עכברים מדי יום עד 7 ימים לאחר הניתוח.

6. מבחן מבוך T מוגבה

הערה: בצע את הבדיקה כמתואר קודם לכן19,20.

  1. ודא שבדיקת מבוך ה-T המוגבה (ETM) מורכבת משתי זרועות פתוחות (30 ס"מ x 5 ס"מ x 0.5 ס"מ) בניצב לשתי זרועות סגורות (30 ס"מ x 5 ס"מ x 16 ס"מ x 0.5 ס"מ) עם פלטפורמה מרכזית (5.0 ס"מ x 5.0 ס"מ x 0.5 ס"מ). אחת הזרועות הסגורות חסומה על-ידי יריעת פלסטיק אטומה ויוצרת צורת T (איור 2A).
  2. שלושה ימים לפני בדיקת ETM, הרגילו את בעלי החיים על ידי טיפול יומיומי למשך 5 דקות.
  3. ביום ה-30 לאחר הניתוח, בצע את בדיקת ה-ETM.
  4. ביום הבדיקה ההתנהגותית, חשפו עכברים לאחת הזרועות הפתוחות למשך 10 דקות.
  5. לבדיקת הימנעות מעכבת, הנח כל עכבר בקצה הדיסטלי של הזרוע הסגורה ורשום את הזמן שנדרש לעזוב את הזרוע הזו עם ארבע כפות בשלושה ניסויים. הניסוי הראשון הוא הימנעות בסיסית, הניסוי השני הוא הימנעות 1, והניסוי השלישי הוא הימנעות 2.
  6. החזיקו עכברים בכלובים שלהם במשך 30 שניות בין השבילים וקבעו זמן הפסקה (כאן, 300 שניות משמשות לכל ניסוי).

7. זלוף, קיבוע, צביעה אימונוהיסטוכימית וכימות

  1. בסיום המחקר (35 יום לאחר הניתוח, לאחר המבחן ההתנהגותי), יש לבצע זלוף וקיבוע של כל הגוף לאחר שהעכבר נמצא בהרדמה כללית.
    1. הרדמו את העכבר כמתואר בשלב 3.3. הנח את העכבר המורדם עמוק בשכיבה גבית.
    2. הרטיבו את הפרווה עם 75% אלכוהול על כל אזור הגחון.
    3. בצע חתך מתחת לעצם החזה ואחריו חתך בצורת V בכלוב הצלעות. אחוז בכלוב הצלעות באמצעות clamp כדי לחשוף את הלב.
    4. הכנס את מחט העירוי הוורידי לחדר השמאלי, ולאחר מכן חתוך את התוספתן הפרוזדורי מיד במספריים כדי לאפשר לדם לזרום החוצה.
    5. הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי להחדיר מי מלח לכל הגוף דרך מערכת הדם. עברו מתמיסת מלח ל-4% פרפורמלדהיד (PFA) כאשר הנוזל היוצא מהפרוזדור הימני מתבהר וכאשר הכבד משתנה מאדום לאדום בהיר. החדרו עוד 5 מ"ל של 4% PFA כאשר זנב העכבר זז, והגוף נוקשה.
      הערה: נדנוד של זנב העכבר הוא סימן לזלוף מתאים.
  2. בידוד המוח לאחר זלוף תוך לבבי עם 4% PFA
    1. ערפו את ראשו של העכבר באמצעות מספריים גדולים, ולאחר מכן חתכו את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
    2. בצע שני חתכים בבסיס הגולגולת (מחובר לצוואר), בצע חתך אחד לאורך הקו המחבר בין העיניים, ולאחר מכן חתוך את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי. אחזו וקלפו את הגולגולת של כל המיספרה כלפי חוץ כדי לחשוף את המוח באמצעות מלקחיים.
      הערה: חיתוך הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי חייב להתבצע בזהירות, אחרת המוח עלול להינזק ולהיפרד לחלקים.
    3. הסר את המוח והנח אותו ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לאחר הקיבוע, ואז העביר את המוח ל-30% סוכרוז עד שהוא שוקע לתחתית.
      הערה: התייבשות באמצעות 30% סוכרוז אינה הכרחית אם חותכים חלקים עם ויברטום.
  3. יש לספוג את עודפי הנוזלים סביב הטישו באמצעות מגבת נייר לפני ההטמעה. הטמע את רקמת המוח ב-OCT עם הפנים הרוסטרליות על הצ'אק.
    הערה: כיוון המדגם חשוב. יש לחבר את הפנים הרוסטרליות של המוח לצ'אק כדי לוודא שקצה החיתוך הוא החלק הזנבי.
  4. חותכים קטע עטרה של ה-DRN (4.0-4.8 מ"מ אחורי מברגמה) בעובי של 30 מיקרומטר (מרווחים של ארבעה חלקים) באמצעות קריוסטט ואוספים את החלקים ב-PBS. יש לאחסן בתמיסת שימור בהקפאה (SCS) ב-20 מעלות צלזיוס.
    הערה: זיהוי ה-DRN חשוב מאוד. המבנים האנטומיים העוקבים מוצגים באיור 3A-H. המבנים האופייניים הם כדלקמן: שקע רוחבי של החדר הרביעי (LR4V, קו מקף אדום באיור 3A,E), החדר הרביעי (4V, משולש מקף אדום באיור 3B,F), אונה מוחית שנייה (2Cb, מבנה בצורת יהלום מקף אדום באיור 3C/G), ואמת מים (Aq, חור מקף אדום באיור 3D,H). התחל לאסוף את הרקמות כאשר נצפים מבנים כפי שמוצג באיור 3D,H, ואז חתוך לקטעים בעובי 30 מיקרומטר (מרווחים של ארבעה חלקים) כדי להניב 24 חתכים עטרתיים בסך הכל. צביעת H&E של הקטעים מוצגת ב (איור 3E-H). החלק הרביעי של כל אחד מארבעת הסעיפים ייבחר לביצוע צביעה אימונו-פלואורסצנטית. המקטעים הנותרים מאוחסנים ב-SCS. אם קשה לזהות את המבנים, הרכבה של חתיכה אחת של החלקים על המגלשה מועילה.
  5. בצע בדיקה אימונוהיסטוכימית כמתואר קודם לכן21,22.
  6. ספור תאים חיוביים ל-5-HT ברמות חתך שונות לאורך כל ה-DRN באמצעות ImageJ.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בתוכנה סטטיסטית לניתוח נתונים. בטא את התוצאות כאמצעים ± SEM.
  2. עבד את הערכים לניתוח סטטיסטי על ידי ANOVA דו-כיווני או מבחן t לא מזווג ושקול את ההבדלים המשמעותיים ב-**p <-0.01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בחתך עטרה, מיקום ה-DRN נמצא ממש מתחת ל-SSS ואמת המים (איור 1B,C); לפיכך, מיקוד ה-DRN באמצעות נהלים סטנדרטיים יכול להוביל לדימום מסיבי ותמותה גבוהה בעכברים16. לכן, הזרקות סטריאוטקסיות בוצעו כאן בגישה זוויתית במקום בגישה האנכית הסטנדרטית כדי למנוע נזק ל-SSS (איור 1A,B). כדי לאשר את מיקום המחט הנכנסת למוח, עכברים שקיבלו זריקות סטריאוטקסיות הוקרבו מיד לאחר הניתוח, והמוחות המוחדרים בודדו לבדיקה היסטולוגית. כפי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר בהצלחה ייצור של מודל עכבר נגע בנוירונים סרוטונרגי DRN אמין עם יכולת שחזור נגעים גבוהה ושיעור תמותה נמוך. התמקדות ב-DRN היא משימה מורכבת, מכיוון שהיא עלולה לפגוע ב-SSS הממוקם ממש מעל ה-DRN16 ולהוביל לדימום מוגזם ואפילו למוות14. לכן, הזרקות סטריאוטקסיות בוצעו על ידי הגדרת זרוע המניפולציה ב-30 מעלות בכיוון AP כדי למנוע פגיעה ב-SSS (איור 1A,B). מסלול המחט המוצג מתחת לאמה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין [מספרי מענק 2017YFA0104100]; הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [מספרי המענקים 31771644, 81801331 ו-31930068]; וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסנן מזרק 0.22מיקרוןMilliporeSLGPRB
3% מי חמצןCaoshanhu Co., Ltd, ג'יאנגשי, סין
5,7-DihydroxytryptamineSigma-AldrichSML20583ug/ul, 2ul
מכונת הרדמה קומפקטית לבעלי חייםקטנים RWD מדעי החיים ושות', בע"מסדרת
CryostatLeica Biosystems, Wetzlar, גרמניהCM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-165-0031:2,000
dapiSigma-AldrichD8417
דסיפרמין הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'PHR172325 מ"ג/ק"ג
צינור אפנדורףאיכות פלסטיק מדעי509-GRD-Q
נוגדן עז נגד 5-HTAbcamab660471:800
GraphPad פריזמהGraphpad תוכנה בע"מ, קליפורניה, ארה"ב
המילטון מזרק מיקרוליטרהמילטון87943
קטופרופןסיגמא-אולדריץ'K1751-1G5 מ"ג/ק"ג
חומצה L-אסקורביתBBI מדעי החייםA610021-05000.10%
משחת לידוקאיןTsinghua Tongfang פרמצבטיקה ושות' בע"מH20063466
ofloxacin משחת עינייםשניאנג Xingqi פרמצבטיקה Co.Ltd, סיןH10940177
משאבה פריסטלטיתHuxi מכשיר אנליטי מפעל ושות', בע"מ, שנחאי, סיןHL-1D
מכשיר סטריאוטקסיRWD מדעי החיים ושות', בע"מ68018
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדHaierDW-86L388
מערבולתקיילין-בלVORTEX-5
R500

מקורות

  1. Goridis, C., Rohrer, H. Specification of catecholaminergic and serotonergic neurons. Nature Review Neurosciences. 3 (7), 531-541 (2002).
  2. Zmudzka, E., Salaciak, K., Sapa, J., Pytka, K. Serotonin receptors in depression and anxiety: Insights from animal studies. Life Science. 210, 106-124 (2018).
  3. Sanchez, C., Asin, K. E., Artigas, F. Vortioxetine, a novel antidepressant with multimodal activity: review of preclinical and clinical data. Pharmacology and Therapeutics. 145, 43-57 (2015).
  4. Pae, C. U., et al. Vortioxetine, a multimodal antidepressant for generalized anxiety disorder: a systematic review and meta-analysis. Journal of Psychiatric Research. 64, 88-98 (2015).
  5. Howerton, A. R., Roland, A. V., Bale, T. L. Dorsal raphe neuroinflammation promotes dramatic behavioral stress dysregulation. Journal of Neuroscience. 34 (21), 7113-7123 (2014).
  6. Matthews, P. R., Harrison, P. J. A morphometric, immunohistochemical, and in situ hybridization study of the dorsal raphe nucleus in major depression, bipolar disorder, schizophrenia, and suicide. Journal of Affective Disorders. 137 (1-3), 125-134 (2012).
  7. Dai, J. X., et al. Enhanced contextual fear memory in central serotonin-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (33), 11981-11986 (2008).
  8. Song, N. N., et al. Reducing central serotonin in adulthood promotes hippocampal neurogenesis. Science Reports. 6, 20338(2016).
  9. Nishitani, N., et al. Manipulation of dorsal raphe serotonergic neurons modulates active coping to inescapable stress and anxiety-related behaviors in mice and rats. Neuropsychopharmacology. 44 (4), 721-732 (2019).
  10. Long, M. A., Fee, M. S. Using temperature to analyse temporal dynamics in the songbird motor pathway. Nature. 456 (7219), 189-194 (2008).
  11. Sena, L. M., et al. The dorsal raphe nucleus exerts opposed control on generalized anxiety and panic-related defensive responses in rats. Behavioral Brain Research. 142 (1-2), 125-133 (2003).
  12. Hall, F. S., Devries, A. C., Fong, G. W., Huang, S., Pert, A. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine depletion of tissue serotonin levels on extracellular serotonin in the striatum assessed with in vivo microdialysis: relationship to behavior. Synapse. 33 (1), 16-25 (1999).
  13. Lieben, C. K., Steinbusch, H. W., Blokland, A. 5,7-DHT lesion of the dorsal raphe nuclei impairs object recognition but not affective behavior and corticosterone response to stressor in the rat. Behavioral Brain Research. 168 (2), 197-207 (2006).
  14. Martin, S., van den Buuse, M. Phencyclidine-induced locomotor hyperactivity is enhanced in mice after stereotaxic brain serotonin depletion. Behavioral Brain Research. 191 (2), 289-293 (2008).
  15. Yalcin, I., Coubard, S., Bodard, S., Chalon, S., Belzung, C. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine lesion of the dorsal raphe nucleus on the antidepressant-like action of tramadol in the unpredictable chronic mild stress in mice. Psychopharmacology (Berlin). 200 (4), 497-507 (2008).
  16. Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).
  17. Spofford, C. M., et al. Ketoprofen produces modality-specific inhibition of pain behaviors in rats after plantar incision. Anesthesia and Analgesia. 109 (6), 1992-1999 (2009).
  18. Baumgarten, H. G., Klemm, H. P., Sievers, J., Schlossberger, H. G. Dihydroxytryptamines as tools to study the neurobiology of serotonin. Brain Research Bulletin. 9 (1-6), 131-150 (1982).
  19. Graeff, F. G., Netto, C. F., Zangrossi, H. The elevated T-maze as an experimental model of anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 23 (2), 237-246 (1998).
  20. Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology (Berlin). 92 (2), 180-185 (1987).
  21. Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Reports. 3 (5), 1580-1591 (2013).
  22. Cao, L., et al. Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Human Serotonergic Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 131(2017).
  23. Sinhababu, A. K., Borchardt, R. T. Molecular mechanism of biological action of the serotonergic neurotoxin 5,7-dihydroxytryptamine. Neurochemistry International. 12 (3), 273-284 (1988).
  24. Jia, Y. F., et al. Abnormal anxiety- and depression-like behaviors in mice lacking both central serotonergic neurons and pancreatic islet cells. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 325(2014).
  25. Marcinkiewcz, C. A., et al. Serotonin engages an anxiety and fear-promoting circuit in the extended amygdala. Nature. 537 (7618), 97-101 (2016).
  26. Ohmura, Y., Tanaka, K. F., Tsunematsu, T., Yamanaka, A., Yoshioka, M. Optogenetic activation of serotonergic neurons enhances anxiety-like behaviour in mice. International Journal of Neuropsychopharmacology. 17 (11), 1777-1783 (2014).
  27. Correia, P. A., et al. Transient inhibition and long-term facilitation of locomotion by phasic optogenetic activation of serotonin neurons. eLife. 6, (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Dorsal Raphe Nucleus
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.