Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלבון s-אכלציה, המכונה גם S-palmitoylation, הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה של שאריות ציסטאין עם חומצות שומן ארוכות בשרשרת באמצעות בונד לבנה thioester. S-אכלציה, המתעוררים כמנגנון הרגולציה הנרחב, יכול לווסת כמעט את כל ההיבטים של הפעילות הביולוגית של חלבונים, מפני היווצרות מורכבים לסחר בחלבונים ויציבות חלבונים. ההתקדמות האחרונה להבנת התפקוד הביולוגי של חלבון S-אכלציה הושגה בעיקר בשל התפתחות הכלים הביוכימיים החדשניים המאפשרים גילוי חזק ורגיש של חלבון S-אכלציה במגוון דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מתארים לכידה בסיוע של acyl שרף (Acyl-מירוץ), שיטה שפותחה לאחרונה מבוסס על לכידת סלקטיבי של חלבונים S-acylated על ידי החרוזים הספרדית thiol-תגובתי. לעומת הגישות הקיימות, Acyl-מירוץ דורש פחות שלבים והוא יכול להניב תוצאות אמינות יותר כאשר ביחד עם ספקטרומטר המסה לזיהוי מטרות הרומן S-אכלציה. מגבלה מרכזית בטכניקה זו היא חוסר יכולת להפלות בין מינים של חומצת שומן המחוברים לציסטרינס באמצעות אותו קשר.
מבוא
S-אכלציה הוא שינוי הפיך לאחר ההעברה מעורבים תוספת של שרשרת acylation שומן לשאריות ציסטאין פנימי על חלבון היעד באמצעות בונד לבנה thioester1. הוא דווח לראשונה כשינוי של חלבונים עם palmitate, חומצה שומן רווי 16 פחמן2, ולכן שינוי זה מכונה לעתים קרובות S-palmitoyלציה. בנוסף palmitate, חלבונים יכולים להיות שונה למדי על ידי מגוון רחב יותר וקצר יותר רווי (myristate ו stearate), חד (oleate) ו רב בלתי רווי (ארכאידיט ו eאיסאופנטאנואט) חומצות שומן3,4,5,6,7. בתאי איקריוטית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הורדמים על פי הנחיות NIH. הוועדה לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת טקסס מדעי הבריאות המרכז ביוסטון אישר את כל העבודה בעלי חיים.
1. הכנת ליקוטים סלולריים
- הכן את מאגר הליזה כמתואר בטבלה 1. כדי 10 mL של PBS, להוסיף 0.1 g של n-dodecyl β-D-מלטוסייד אבקת כביסה (DDM) ולסובב להתמוסס. הוסף 100 μL של קוקטייל פוספאטאז מעכבי 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 מ"מ) ו מעכב פרוטאז קוקטייל (1x) ולצנן את המאגר על הקרח לפני השימוש.
- העברת מדיה נדרש המכיל תאים מהאינקובטור לתוך 15 מ"ל או 50 mL מצינורות ותאי ספין ב 350 x g עבור 5 דקות ו-מדלל כדי להיפטר כל פסולת תא.
הערה: השתמשנו 1 x 107 ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו הראשון acyl-מירוץ כדי לזהות בו S-אכלציה של כמה חלבונים בתאים ורנל, קו תא T הונצח במקור נגזר דם היקפי של חולה לוקמיה של תא T27. החלבונים של תא T הרגולציה שזוהו בעבר כ-S-acylated9,28,29 נבחרו כדי להדגים את כלי השירות של שיטה זו. כפי שמוצג באיור 2a, טירולך קינאז lck ניתן להבחין ב lysates שטופלו עם נייטרלי 2 M הידרוקסילין כדי לדבוק את הקשר th.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מנוצל בהצלחה את הבחינה מירוץ acyl כדי לזהות S-אכלציה של חלבונים שנבחרו בתאי האדם התרבותי הן התאים הראשוניים הנגזרים מרקמת העכבר. שיטה זו היא פשוטה, רגישה, ניתן לבצע בקלות עם דרישות ציוד מינימלי באמצעות טכניקות ביוכימיה סטנדרטית. שיטה זו הוצגה בהצלחה לזהות חלבונים S-acylated הרומן כגון β-subunit של המערכת חלבון האיתור (Sec61b), חלבון הריבוזומS11 (Rps11), ו מיקרוזומיום הגלוטתיון-S-transferase 3 (MGST3)22. רגישות והסתגלות של מירוץ acyl הופך אותו מתאים ללמוד חלבון S-אכלציה במגוון של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין קונפליקטים של עניין מוצהר.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות 5R01GM115446 ו-1R01GM130840.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| cOmplete מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל | סיגמא | 11836170001 | |
| צנטריפוגה אפנדורף 5424 | אפנדורף | 22620444 | |
| הידרוקסילאמין (HAM) | סיגמא | 159417 | |
| מתיל מתנתיוסולפונאט (MMTS) | סיגמא | 64306 | |
| מיני מסובב צינור | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl & -D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| קוקטייל מעכב פוספטאז 2 | Sigma | P5726 | |
| תיופרופיל-ספרוז 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L &; ר |
מקורות
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
