אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד החומר הצמחי לאימונולוקליזציה של חלבונים ופקטינים ערבינוגלקטניים קבוע, מוטבע בשרף אקרילי הידרופילי, חתוכה ומורכבת על מגלשות זכוכית. אנו מראים אפיטופים הקשורים לקיר התא יזוהו עם נוגדנים ספציפיים.

תקציר

פיתוח הצמח כרוך בהתאמות מתמידות של הרכב ומבנה דופן התא בתגובה לגירויים פנימיים וחיצוניים כאחד. קירות התא מורכבים מפוליסכרידים תאיים ולא צלולוסיים יחד עם חלבונים, תרכובות פנוליות ומים. 90% מקיר התא מורכב מפוליסכרידים (למשל, פקטינים) וחלבונים ערבינוגלקטים (AGPs). האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית של אפיטופים גליקן ספציפיים בחלקים היסטולוגיים של הצמח נותרה כלי מרכזי לחשיפת שיפוץ של רשתות פוליסכריד בקיר, מבנה ורכיבים.

כאן, אנו מדווחים על הליך אימונולוקליזציה פלואורסצנטי אופטימיזציה לגילוי אפיטופים גליקן מ- AGPs ופקטינים ברקמות הצמח. קיבוע Paraformaldehyde / glutaraldehyde שימש יחד עם הטמעת LR-לבן של דגימות הצמח, המאפשר שימור טוב יותר של מבנה הרקמה והרכב. חלקים דקים של הדגימות המוטבעות שהושגו עם אולטרה מיקרוטום שימשו לאימונולוקליזציה עם נוגדנים ספציפיים. טכניקה זו מציעה רזולוציה רבה, ספציפיות גבוהה, ואת ההזדמנות לזהות אפיטופים גליקן מרובים באותה דגימה. טכניקה זו מאפשרת לוקליזציה תת-תאית של גליצנים ומזהה את רמת ההצטברות שלהם בקיר התא. זה גם מאפשר קביעת דפוסים מרחביים-זמניים של הפצת AGP ופסטין במהלך תהליכים התפתחותיים. השימוש בכלי זה עשוי בסופו של דבר להנחות כיווני מחקר ולקשר גליצנים לפונקציות ספציפיות בצמחים. יתר על כן, המידע המתקבל יכול להשלים מחקרים ביוכימיים וביטוי גנים.

מבוא

קירות תאי הצמח הם מבנים מורכבים המורכבים מפוליסכרידים וגליקופרוטאינים. קירות התא הם מבנים דינמיים ביותר שהארכיטקטורה, הארגון וההרכב שלהם משתנים בהתאם לסוג התא, לוקליזציה, שלב התפתחותי, גירויים חיצוניים ופנימיים¹. חלבונים ערבינוגלקטנים (AGPs) ופקטינים הם מרכיבים חשובים של דופן תאי הצמח. AGPs הם חלבונים glycosylated מאוד פקטינים הם פוליסכרידים homogalacturonan אשר הרכב, כמות ומבנה להשתנות מאוד בשלבים התפתחותיים שונים של הצמח^2,3,4. AGPs ומחקרי פקטין חשפו את מעורבותם במספר תהליכים צמחיים כגון מוות תאי מתוכנת, תגובה ללחצים אביוטיים, רבייה של צמחים מיניים, ב....

פרוטוקול

1. הכנת מדגם: קיבעון, התייבשות, הטבעה LR-לבן

1. קיבוע והתייבשות
   הערה: תהליך הקיבעון הוא קריטי לשמירה על הדגימה; על ידי הצלבת מולקולות חילוף החומרים התאי נעצר, הבטחת שלמות הסלולר ומניעת דיפוזיה מולקולרית. סוכנים מתקנים ואת הריכוז בשימוש חייב להיות מותאם למטרה זו, משאיר את האנטיגנים חשופים מספיק כדי לקיים אינטראקציה עם הנוגדנים. הפרוטוקול הבא משלב את היכולת הקיבעון המתון של paraformaldehyde, עם ההשפעה החזקה יותר של גלוטארלדהיד. הפרופורציות שלהם היו ממוטבות עבור AGPs ורכיבי קיר התא, אבל זה מתאים חלבונים אחרים ומבני תאים. תהליך ההתייבשות הבא יכין את הדגימות להטמעה LR-לבן. בניסוי זה נעשה שימוש ברקמות צמחים ממספר מיני צמחים. דגימות משנה Quercu....

תוצאות

בניסוי מוצלח, הנוגדן המשני יאתר באופן ספציפי את מיקומו של האפיטופ הספציפי בירוק בהיר, באופן עקבי, ויאפשר אפיון של הרכב דופן התא בשלב התפתחות מסוים של התא, הרקמה או האיבר. לדוגמה, לנוגדן LM6 יש זיקה גבוהה ל-1,5-arabinan, תרכובת עם סוג I rhamnogalacturonan שניתן למצוא מתייגת בשפע את דופן התא של קוורקוס suber anther המתפתח (איור 2A), ובכך מאפשרת להסיק כי סוג זה של פקטין הוא בשפע וחלק מהרכב דופן התא הראשי. JIM5 יש זיקה homogalacturonans בקושי esterified כי נמצאים בדרך כלל בקצה השורש של .......

דיון

שיטת האימונולוקליזציה הפלואורסצנטית בצמחים כאן תיארה, אף שהיא פשוטה בצורה חלקה, מסתמכת על ההצלחה של מספר צעדים קטנים. הראשון שבהם הוא הכנה וקיבעון לדוגמה. במהלך צעד ראשון זה, תערובת של פורמלדהיד ו glutaraldehyde משמש כדי crosslink רוב מרכיבי התא. הפורמלדהיד בתמיסה מספק קיבעון קל וניתן הפיכה בעוד הגלוטארלדהיד מספק חיבור חזק וקבוע יותר; האיזון בין שני התיקונים מספק את הכמות המתאימה של הצלבה, ומאפשר חשיפה של האפיטופים להגיב עם הנוגדן העיקרי¹⁰. כדי שהפתרון המתקן יפעל כראוי, המדגם חייב להיות קטן. מבנים.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
25% (w/v) גלוטרלדהיד	אגר Scientific	AGR1010	aq. תמיסה, ללא מתנול
8 בארות שקופיות תגובת זכוכית	מרינפלד	MARI1216750	מותגים אחרים ניתן להשתמש
בחומצה אצטית	Sigma-Aldrich	A6283
Anti-Rat IgG (מולקולת וולה)-FITC נוגדן המיוצר ב-GOAT	Sigma-Aldrich	F6258
תלושי כיסוי, 24 מ"מ x 50 מ"מ	מרינפלד	MARI0100222	תלוש הכיסוי צריך לכסות את כל הבארות. ניתן להשתמש במותגים אחרים
ddH2O	עם
אתנול מוחלט
brighter 28	Sigma-Aldrich	F-6259
כמוסות ג'לטין	Agar Scientific	AGG29211	גודל הקפסולה צריך להתאים לגודל המדגם.
		ניתן להשתמש בבקבוקוני זכוכית	ובכל בקבוקוני זכוכית פשוטים ולא יקרים שניתן לאטום. ניתן לנקות את הבקבוקונים עם 96% אתנול לאחר השימוש כדי להסיר שאריות LR-White ולעשות בהם שימוש חוזר.
שרף LR-לבן בדרגה בינונית, המשבץ Agar	Scientific		מגיע במספר צורות; הדרגה הבינונית מספקת תמיכת חיתוך נאותה לרוב הרקמות, בעוד שלרקמות קשות יותר ניתן להמליץ על דרגה קשה יותר של LR-white. במידת האפשר השתמש בשרף שכבר מעורבב עם מפעיל הפולימרציה (בנזואיל פרוקסיד), אם לא אנא עקוב אחר הוראות הספק להכנת השרף.
חלב יבש ללא שומן	Nestlé		כל חלב יבש שאינו שומן מספיק
תנור	ותנור		מעבדה גנרי
צלחת פטרי, 10 ס"מ על 10 ס"מ מרובע		וצינורות
	Sigma Aldrich	P1851
	עכברוש שנוצר על ידי עכברוש חד שבטי צמח אנטי גדנים		מספר נוגדנים המזהים את מרכיבי דופן התא זמינים הן במרכז המחקר לפחמימות מורכבות (CCRC, אוניברסיטת ג'ורג'יה ארה"ב) והן ב-Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, באוניברסיטת לידס בריטניה). רשימה קצרה של כמה MABS נפוצים והיכן ניתן לרכוש אותם מוצגת בטבלה משלימה 1
סכיני גילוח			וסכיני גילוח רגילים
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף של Leica Microsystems	UC7
עם מסנני פלואורסצנטי UV ו-FITC	Leica Mycrosistems	DMLb
משאבת ואקום
			ניתן להשתמש בתכשירים אחרים נגד דהייה. אנא בדוק את התאימות ל-FITC ול-Fluorescente brightner 28. (הערה: לחלופה לא מסחרית, (ראה Jonhson et al 198218) ניתן לייצר מדיום נגד דהייה על ידי ערבוב של 25 מ"ג/מ"ל של 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) אוקטן (DABCO) ב-9:1 (v/v) גליצרול ל-1xPBS. התאם את ה-pH ל-8.6 עם HCl מדולל.)

ו-Fluorescent AGR1281-LR-White תא ואקום עם ומעבדות Vectashield T-1000