כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות
במאמר זה
סיכום
תקציר
באלקטרופורציה הרחם היא בטכניקת העברת ה-DNA vivo שימוש נרחב כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים והסלולריים הבסיסיים corticogenesis. הליך זה מנצל את חללי המוח כדי לאפשר את המבוא של ה-DNA של עניין ומשתמש בזוג אלקטרודות כדי לכוון את הכניסה של החומר הגנטי לתוך התאים רירית החדר, תאי גזע עצביים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לתייג את התאים הרצויים ו/או לטפל בביטוי של גנים המעניינים בתאים אלה. יש לו מספר יישומים, כולל מיקוד העברת הגירה עצבית, מעקב אחר שושלת היוחסין, ומציאת האקונאליות. תכונה חשובה של שיטה זו היא בקרה הזמני והאזורי שלה, המאפשר לעקוף את הבעיות הפוטנציאליות הקשורות השפעה עובריים או העדר עכברים ספציפיים מנהל התקן. היבט רלוונטי נוסף של טכניקה זו הוא שהוא מסייע לצמצם במידה ניכרת את המגבלות הכלכליות והטמפורלית הכרוכות ביצירת קווי עכבר חדשים, הנעשים חשובים במיוחד בחקר האינטראקציות בין סוגי התאים הנובעים מאזורים רחוקים במוח בגילאים התפתחותיים שונים. כאן אנו מתארים אסטרטגיית אלקטרופורציה כפולה המאפשרת פילוח של אוכלוסיות תאים המופרדות באופן זמני ומופרדות. עם גישה זו אנו יכולים לתייג תת סוגים שונים של תאים במיקומים שונים עם חלבונים שנבחרו הפלורסנט כדי להמחיש אותם, ו/או אנחנו יכולים לטפל בגנים של ריבית המתבטאת על ידי אלה תאים שונים בזמנים המתאימים. אסטרטגיה זו מגבירה את הפוטנציאל באלקטרופורציה של הרחם ומספקת כלי רב-עוצמה לחקר ההתנהגות של אוכלוסיות תאים המופרדות באופן זמני ומופרדות, העוברות להקמת קשרים קרובים, כמו גם אינטראקציות ארוכות טווח באמצעות התחזיות האקאליות, הפחתת עלויות זמניות וכלכליות.
מבוא
קליפת המוח היא מבנה מורכב ומסודר מאוד. כדי להשיג מידה כזו של ארגון, נוירונים הקרנה בקליפת הגוף לעבור תהליכים התפתחותיים מורכבים הדורשים הדור הזמני שלהם, הגירה היעד הסופי שלהם לוחית הקליפה, והקמת חיבורים קצרים וארוכי טווח1,2. במשך זמן רב, הדרך הקלאסית ללמוד corticogenesis היה מבוסס על השימוש בנוקאאוט או מודלים מורטין של גנים של עניין. עם זאת, אסטרטגיה זו, ובעיקר השימוש בעכברים מותנים מותנה, הוא זמן רב ויקר, ולפעמים מציג בעיות נוספות לגבי קיומו של יתירות גנטית או היעדר מנהלי התקנים מסוימים של היצור, בין היתר. אחת הגישות שהתעוררו לנסות לטפל בבעיות אלה וכיום משמש באופן נרחב לחקר ההתפתחות הקורטיקלית היא בתוך הרחם3,4. באלקטרופורציה של הרחם היא טכניקה המשמשת לטרנסגנזה סומטית, המאפשרת התמקדות בvivo של תאי גזע עצביים וצאצהם. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לתייג תאים לפי ביטוי של חלבונים פלואורסצנטי5,6, עבור מניפולציה גנים ב vivo (כלומר, להרוויח או לאבד את הפונקציה assays)7,8,9, עבור בידוד אלקטרופורציה ממגורות בתאי מבחנה ו-culturing תאים8,10. יתר על כן, באמצעות אלקטרופורציה הרחם מאפשר בקרה הזמני והאזורי של האזור המיועד. טכניקה זו כוללת יישומים רבים ושימש רבות לחקר הגירה עצבית, חטיבת תאי גזע, קישוריות עצבית, ונושאים אחרים8,9,11,12.
כתב היד הנוכחי מתאר את השימוש במשתנה אלקטרופורציה של הרחם, הנקרא כפול באמצעות אלקטרופורציה של הרחם, כדי לנתח את האינטראקציות של תאים בקליפת המוח עם מקורות הזמן והמרחב השונים. מחקרים אלה הם מורכבים מאוד להשלים בעת העסקת מודלים murine כי הם דורשים שימוש משולב של מספר קווים טרנסגניים. חלק מהיישומים של הפרוטוקול המתואר במאמר זה כוללים את חקר האינטראקציות הקרובות בין התאים השכנים, כמו גם אינטראקציות בין תאים מרוחקים באמצעות תחזיות טווח ארוך. השיטה מחייבת ביצוע שני באופן עצמאי ניתוחי אלקטרופורציה ברחם, מופרדים באופן זמני ובצורה מהותית, על אותם עוברים למקד אוכלוסיות תאים שונות של עניין. היתרון של גישה זו הוא האפשרות של מניפולציה הפונקציה גנים באחד או בשני סוגים של נוירונים באמצעות חיות טיפוס פראי. בנוסף, ניסויים פונקציונליים אלה ניתן לשלב עם הביטוי של cytoplasmic או ממברנה מתויג חלבונים פלורסנט כדי להמחיש את המבנה המשובח של תאים ממוקדים, כולל דנדריטים ואקסונים, ולנתח הבדלים אפשריים אינטראקציה תאית בהשוואה עם פקד (כלומר, תאים המסומנים רק עם חלבון פלורסנט).
הפרוטוקול הנמצא כאן מתמקד בחקר האינטראקציות הסלולריות בתוך הקליפת המוח, אך ניתן להשתמש באסטרטגיה זו גם כדי לבחון אינטראקציות עם אזורים בעלי מוצא שיכולים להיות ממוקדים באמצעות אלקטרופורציה של הרחם, כגון תת-התלמוס או האינטראקציות של13,14או תאי תא במבנים אחרים, כגון המוח15. פילוח של אזורים שונים מבוסס על כיוון האלקטרודות ועל החדר שבו ה-DNA מוזרק (לרוחב, שלישי, או הרביעי). עם האסטרטגיה המתוארת כאן, אנו יכולים לתייג מספר משמעותי של תאים, אשר שימושי כדי להעריך שינויים כלליים בקישוריות/אינבציה בניסויים פונקציונליים. למרות זאת, כדי ללמוד שינויים עדינים בקישוריות, ניתן להשתמש בגרסאות ששונו של אלקטרופורציה ברחם כדי לקבל תיוג מספרנות ולזהות תאים בודדים16. לסיכום, כפול באמצעות אלקטרופורציה הרחם היא שיטה רב-תכליתית המאפשרת מיקוד באופן זמני והפרדה בין אוכלוסיות תאים ולימוד האינטראקציות שלהם בפירוט, בתנאי שליטה או בשילוב עם ניסויים פונקציונליים, צמצום משמעותי עלויות הזמני והכלכלי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליך המתואר במסמך זה אושר על ידי הוועדה האתית האחראית על הניסויים, רווחת בעלי החיים של האוניברסידה ולנסיה והקונסליריה דה יוחדים, דסאררולו כפרי, אמגנסיה Climática y טראנסיטריון של Comunidad ולנסיה, ואת ההנחיות של המועצה הבינלאומית למדע בעלי חיים מעבדה (ICLAS) שנבדקו ב Decreto האמיתי 53/2013 של החקיקה הספרדית, כמו גם בהוראה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי והמועצה.
הערה: פרוטוקול זה כולל שתי מטרות שונות: 1) המחקר הראשון, המכונה "אסטרטגיה A", מאפשר ניתוח של האינטראקציות בין התאים Cajal-רטינוס (CR-תאים) ו-מוקדם נולד הקרנה הנוירונים בתוך האונה המוחית זהה; 2) המחקר השני, "אסטרטגיה B", מבוצעת על מנת לבחון את האינבציה של הקרנה העליון callosal ההקרנה החלק הצדדי של קליפת המוח.
1. הכנה לניתוח מקדים
- הכנה לדנ א
- המרה כימית או אלקטרוDH5α E. coli תאים עם הפלמידים של עניין, לוחית אותם על לוחות LB אגר עם אנטיביוטיקה המתאים, ומודקת אותם לילה ב 37 ° c.
הערה: כל הפלמידים המשמשים כאן מכילים את היזם הכללי עבור עוף β-actin (הקאג) נהיגה ביטוי של חלבון כתבת פלורסנט (הקאג-mCherry ו-הקאג-EGFP עבור אסטרטגיה A ו-הקאג-BFP ו-הקאג-שליליים-2A-מצחג עבור אסטרטגיה B). כולם מכילים עמידות אמפיצילין (AMP). - בחר מושבות בודדות מכל שינוי בפלסטלינה ויזום תרבות נוזלית התחלתית ב -2 מ ל של מרק לוריא + אמפיצילין (LB + AMP) בצינורות התרבות החיידקית במהלך 3 עד 4 h ב 37 ° c עם טלטול נמרץ (200 rpm). לאחר, להגדיר תרבות חיידקית גדול יותר 500 mL Erlenmeyer בקבוקון הוספת 200 mL של LB + AMP ו 1 mL של התרבות הראשונית. דגירה לילה ב 37 ° c ב שייקר מסלולית ב 200 rpm.
- השתמש בערכת מקסי-הכנה נטולת-רעלן (טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן להשגת דנ א טהור ומרוכז מתרבויות הנוזלים. השהה מחדש את ה-DNA ב-~ 50-100 μL של מאגר טריס-EDTA חינם של אנדוטוקסין (TE) כדי לקבל ריכוזים של לפחות 5 μg/μL.
- עבור כל ניתוח, להכין פתרון עם הנפח הסופי של 10 μL המכיל 1 μL של צבע ירוק מהיר, הפתרון DNA באמצע הריבית של ריכוז סופי של 1 μg/μL עבור כל פלסטלינה, ו-מאגר חינם אנדוטוקסין. לדוגמה, לערבב 1 μL של צבע ירוק מהיר, 2 μL של 5 μg/μL באמצע פתרון DNA, ו -7 μL של מאגר TE.
- המרה כימית או אלקטרוDH5α E. coli תאים עם הפלמידים של עניין, לוחית אותם על לוחות LB אגר עם אנטיביוטיקה המתאים, ומודקת אותם לילה ב 37 ° c.
- פיפטה מושך
- משוך את נימי זכוכית הורוסיליקט (1/0.58 מ"מ בקוטר חיצוני/פנימי) בתוך מיקרופיפטה אנכי, עד שהקצה מגיע לאורך של 1-1.5 ס מ ומקצץ אותו באמצעות מלקחיים בזווית של כ -30 ° מתחת להיקף מבתר.
- כיוונון חדר כירורגי
- שימו את כל הציוד על שולחן הניתוחים (כלומר, מלקחיים, מספריים, מלקחיים, מיקרופיפטות, מחט ומחזיק מחט). תדליק את כרית החימום ותכסה אותו. בפנקס סופג כירורגי סטרילי ודא כי המאגר במכונה עבור הרדמה אינהלציה מתמלא isofלאנה, מיכל החמצן מכיל מספיק חמצן, והמערכת פועלת כראוי.
הערה: חדר ניתוח וחומר עמיד צריך להישמר סטרילי ככל האפשר (כלומר, כל החומר חייב להיות אוטומטית לפני הניתוח ומשטחים חייב להיות מחוטא עם 70% אתנול). אלקטרודות פלטינה צריך להיות מחוטא היטב הראשון עם סבון germרידקים ושנית עם 70% אתנול לפני הניתוח. - להכין 100 mL של 0.9% (w/v) פתרון מלוחים סטרילי המכיל פניצילין-סטרפטומיצין 1:100 ולמלא 10 ס מ צלחת פטרי. מניחים את הצלחת על גבי משטח מחומם כדי לחמם את הפתרון.
- למלא מזרק 1 מ ל עם 150 μL של פתרון כאבים (למשל, 0.1 mg/ק"ג בופרנורפין).
- לטעון את הצנרת משכה עם 5 μL של הפתרון הסופי DNA באמצע הכין בשלב 1.1.4. חברו את הנימים לצינור. שנשלט בפה
- שימו את כל הציוד על שולחן הניתוחים (כלומר, מלקחיים, מספריים, מלקחיים, מיקרופיפטות, מחט ומחזיק מחט). תדליק את כרית החימום ותכסה אותו. בפנקס סופג כירורגי סטרילי ודא כי המאגר במכונה עבור הרדמה אינהלציה מתמלא isofלאנה, מיכל החמצן מכיל מספיק חמצן, והמערכת פועלת כראוי.
2. ראשית בניתוח הרחם
- מקום E 11.5 (אסטרטגיה A) או E 13.5 (אסטרטגיה B) C57BL/6 עכבר בהריון בתוך חדר אינדוקציה סגור עם 2.5% (v/v) isof ane ב 0.8 L/min ולחכות עד שהוא מורדם. להעביר את העכבר על כרית החימום ולשים את אפו לתוך מסכה למסירה מתמדת של isofלאנה. בדקו אם יש היעדר רפלקס פדלים כאינדיקטור להרדמה נאותה.
הערה:הגיל mbryonic נקבע בהתבסס על היום שבו תקע הנרתיק הוא נצפתה (E 0.5). - הכנס את הנקבה ההרה עם פתרון משכך כאבים (0.1 מ"ג/ק"ג buprenorphine) תת-עורי. כדי למנוע את העיניים מייבוש במהלך ההליך, להחיל טיפה אחת של משחה עין בכל עין באמצעות ספוגית כותנה.
- לגלח את העכבר באזור הבטן עם תער חשמלי ולשטוף אותו 2x עם 70% (v/v) מגבונים האתנול, פעם עם מגבונים יוד, ופעם אחת אחרונה עם מחיקה אתנול.
- השימוש במספריים כדי ליצור חתך ארוך של 30 מ"מ דרך העור בצד ימין של בעל החיים ולהפריד בזהירות את העור הסמוך מהשריר עם מרית קהה. לאחר מכן, עשו חתך שני. בדופן הבטן
- לכסות את הבטן עם פיסת נייר טישו מקופל בעבר מחוטא עם 70% אתנול המכיל 40 מ"מ ארוך חתך במרכזו. בזהירות למשוך את הרחם מתוך חלל הבטן עם מלקחיים הטבעת.
הערה: הרחם חייב להיות רטוב עם פתרון מלוחים חמים הכין בשלב 1.3.2 במהלך ההליך כולו. - טעינת הפיפטות משכו עם פתרון ה-DNA המוכן בשלב 1.1.4. הכנס ~ 0.5 μL של פתרון ה-DNA לעובר אל החדר הצדדי של חצי הכדור הנבחר באמצעות שפופרת מבוקרת בפה מבוקר עד הצבע הירוק מהיר מורגש בתוך החדר.
- במקום מלקחיים בצורת אלקטרודות פלטינה מסביב לראש העובר המוזרק (כפי שמוצג באיור 1a ואיור 2a). האוריינט האלקטרודות כדי למקד את אזור המוח הרצוי. מכוונים את הקוטב החיובי לעבר הקיר האמצעי כדי לאלקטרופורקות את קליפת המוח (אסטרטגיה A) או לקראת קליפת לרוחב (אסטרטגיה ב') כדי לתייג תאים שנוצרו באותו אזור.
הערה: בכל המקרים, יש להימנע מלב ושליה כדי להבטיח הישרדות מעוברית. - החל את רצף מסוים של פולסים חשמליים עם משבצת גל מרובע בעקבות הסימנים המוצגים בטבלה 1 (אסטרטגיה e 11.5 עוברים: ארבעה פולסים של 25 V ו-40 ms, מופרדים על-ידי 950 ms מרווחי זמן; אסטרטגיה B e 13.5 עוברים: חמישה פולסים של 35 V ו 60 ms, עם מרווחי 950 ms).
- בזהירות למקם את הרחם בחזרה לחלל הבטן עם מלקחיים, למלא אותו עם תמיסת מלח חם, ולסגור את קיר הבטן עם מחט 6-0 תפר. הצטרפות שני הצדדים של החתך הראשוני שנעשו בעור או באמצעות מחט 6-0 תפר או מחסניות תפר.
- שמרו על החיה על כרית החימום והצג אותה עד שהיא מחלימה מהרדמה. לספק מנה נוספת של כאבים (150 μL) בתמיסה הידרוג'ל ממוקם בכלוב הבית שלה.
- 24 שעות לאחר הניתוח, לתת מנה נוספת של כאבים (150 μL). המשך הפיקוח היומיומי על ידי בדיקה חזותית לכאב ומצוקה אפשריים. שימו לב להתנהגות של בעל החיים, בדיקת הרפלקסים האחוריים הנורמליים שלה, ובדוק את התפר עבור סימנים אפשריים של נזק עקב ליקוק או גירוד של הפצע.
3. שנית ברחם
- יומיים לאחר הניתוח הראשוני, חזרו על צעדים 2.1-2.3. למרות ההתאוששות של נשים בהריון לאחר הניתוח הוא טוב מאוד, לבדוק כי הם מראים התנהגות נורמלית ולא להציג שום סימנים של כאב או מצוקה לפני ביצוע הניתוח השני (E 13.5 עוברים עבור אסטרטגיה A ו-E 15.5 עבור אסטרטגיה ב').
- לעשות חתך 30 מ"מ ארוך דרך העור כמו בשלב 2.4 והחתך השני בקיר הבטן, הפעם בצד שמאל של החיה. בזהירות לחשוף את הרחם על גבי רקמת חיטוי כמתואר בשלב 2.5.
הערה: היזהרו לא להתערב בחתך שנעשה בעבר בצד השני. - הכנס סביב 0.5 μL לכל העובר של פתרון ה-DNA לתוך החדר המוח לרוחב של האונה בעבר electroporated במקרה של אסטרטגיה A ו החדר המוח הצדדי של האונה הצדדית הצלעות עבור אסטרטגיה B.
הערה: השתמש רק בעוברים המציגים פיתוח רגיל ואין סימנים לספיגה חוזרת. - מניחים את האלקטרודות סביב ראשו של העובר כמתואר בשלב 2.7, מכוון את האלקטרודה החיובית כלפי קליפת לרוחב ולהחיל את הפולסים המתאימים בעקבות הסימנים המוצגים בטבלה 1 (אסטרטגיה e 13.5 עוברים: חמישה פולסים של 35 V ו-60 ms מופרדים על-ידי 950 ms 50 מרווחי זמן; אסטרטגיה B e 15.5 עוברים: חמישה פולסים של
- המשך וסיים את הניתוח כמתואר בשלבים 2.8-2.10.
4. מסיק רקמה
- אסטרטגיה A
- ארבעה ימים לאחר האלקטרופורציה השנייה (e 17.5), לבצע נקע בצוואר הרחם של האישה ההרה ומניחים אותו במצב פרקדן.
- באמצעות מספריים, לעשות חתך הגחוני כדי לחלץ את קרני הרחם ועם מלקחיים למקם אותם בצלחת פטרי ממולא 1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) ממוקם על קרח.
הערה: הטמפרטורה הנמוכה הופכת את ההרדמה של העוברים לאפשריים. - שימוש בפינצטה, מחלץ את העוברים מתוך שק השפיר ומעביר אותם עם מלקחיים לצלחת פטרי חדשה מלאה מתחת לטווח מבתר. בזהירות להחזיק את הראש של העוברים באמצעות מלקחיים ולבצע ניתוח מוחי עם מלקחיים כדי להסיר תחילה את העור מעל הראש ולאחר מכן את הגולגולת. השתמש במרית כדי. להוציא את המוח החשוף
- לאסוף את המוח עם כפית ולהפקיד אותם בצלחת 48 היטב מלא הפתרון הקבע (4% [w/v] פאראפורמלדהיד [החצי הראשון] ב-1x PBS). בדוק מיידית את התוצאה המוצלחת של שתי האלקטרופורציות על ידי בדיקת המוח באמצעות מיקרוסקופ אפיפאני הפוך, למשל.
- לקבוע את המוח עובריים לילה ב 4 ° c ב שייקר מסלולית. לשטוף עם PBS 1x כדי לחסל את העקבות של התחתית. ואז להעביר אותם PBS עם חומרים משמרים נגד פטריות (1x PBS-0.05% (w/v) נתרן azide).
התראה: המטה והנתרן אזידה הם תרכובות ציטוטוקסיות הדורשות אמצעי זהירות מיוחדים במהלך הניצול שלהם. - להטביע את המוחות מקובע ב 4% (w/v) נקודת התכה נמוכה agarose ב-1x PBS ולחכות ~ 10 דקות עד שהוא מתגבש. לתקוע אותם בנרתיק רקמת רטט באמצעות דבק ציאנואקרילי עם נורות הריח פונה כלפי מעלה כדי להשיג סעיפים ילתית.
- להפעיל את הרטט atome ולבחור את הפרמטרים הרצויים: 100 יקרומטר רוחב, 0.60 יקרומטר/s מהירות, ו 0.60 mm של משרעת.
- לאבטח את המוח בתוך המיכל הרטט, למלא אותו עם פתרון PBS 1x, ולהתחיל לאסוף סעיפים סידוריים ילתית בעזרת מברשת בצלחת 48 היטב מלא עם 1x PBS-0.05% (w/v) נתרן אזיד כדי לקבל תיאור מלא של המוח (למשל, סביב שבעה חלקים לטוב ושש בארות לעובר).
- הר את הסעיפים הרצויים בתוך שקופיות זכוכית מיקרוסקופ באמצעות מברשת יפה. . כסו אותם בכיסויים של הזכוכית עבור אחסון לטווח ארוך להוסיף בינונית הרכבה, אשר מונע הלבנת ופוטוחמצון. שימו לב לשקופיות שמתחת למיקרוסקופ אפיאונטית זקוף כדי להעריך את יעילות האלקטרופורציה.
- אסטרטגיה ב'
- בואו הגורים בעבר electroporated ב-e 13.5 ו-e 15.5 להיוולד ולחכות עד P15 כדי לבצע perscardial הפרזיה באמצעות אותו פתרון קבע בשימוש בשלב 4.1.4.
- ממש לפני perfusion, intraperitoneally לספק מנה של 75/1 mg/ק"ג/מדטומדין. כאשר רפלקס הדוושה הוא איבד, לאבטח את העכבר במצב פרקדן ולעשות חתך הגחוני לאחר הקו האמצעי באמצעות מספריים כדי לחשוף הן את כלוב הצלעות ואת הסרעפת.
- חותכים את הסרעפת ופותחים את כלוב הצלעות כדי לקבל גישה ללב. החזיקו את כלוב הצלעות בעזרת הדימום ועשו חתך באטריום הימני עם מספריים עדינים.
- חודרים לחדר השמאלי עם מחט המחוברת לצינור גמיש למשאבת היתוך פריסטטית. התחל לבצע הפרזיה, אספקת לפחות 25 מ ל של 4% כלפי התחתית בשטף קבוע של 5.5 mL/min (סה כ זמן ~ 5 דקות).
- . מנתח את המוח של בעלי חיים ראשית, להסיר את העור מעל הראש עם מספריים ומלקחיים. התחל לחתוך את הגולגולת באמצעות מספריים ובזהירות למשוך קטעים של עצמות הגולגולת עד שהם יוסרו לחלוטין. לבסוף, לחלץ את המוח בעזרת מרית.
- להעביר את המוח לצלחת 24 שעות ולתקן אותם עם 4% בכיוון הבית בחצי הרחוב ב 4 ° c על שייקר מסלולית. להפסיק את הקיבעון על ידי החלפת ה0.05 בלבד (w/v) נתרן אזיד ב PBS.
הערה: כפי שמצוין בשלב 4.1.5, מומלץ לבצע שטיפת ביניים עם 1x PBS. - חזור על הצעדים 4.1.6-4.1.9, שינוי הפרמטרים הרטט עבור המוח לאחר הלידה (40 יקרומטר רוחב, 1.20 יקרומטר/s מהירות, 0.5 מ"מ משרעת).
הערה: אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence ניתן לבצע כדי לזהות סמנים תא ספציפיים או לשפר את האות של חלבונים פלורסנט המשמשים אלקטרופורציה.
5. הדמיה ואנליזה של מוקד הקרינה הפלואורסצנטית
- הפעל את המיקרוסקופ קונפוקלית וקד, במקום את שקופיות המיקרוסקופ המכיל את מקטעי המוח רכוב על מחזיק שקופיות מיקרוסקופ ובחר את הערוצים שבו תמונות הזריחה יילקח (כלומר, 420 על-ידי 460 ננומטר עבור bfp, 490-540 ננומטר עבור gfp, ו 570-620 ננומטר עבור mcherry ו-tdtomato).
- לבצע סריקה לדוגמה כדי לקבל תמונות מיפוי של כל מקטע המוח בשני אורכי גל שונים לתצוגה כללית של פלט אלקטרופורציה כפול. לאחר סיום, בחר בעדשת 10x ובמצב התצפית רב-תחומי-Z-מחסנית-שחלוף. זה יאפשר תכנות הרכישה האוטומטית של תמונות הזריחה ב XYZ לוקליזציה שונים בתוך מקטעי המוח.
- בכל אחד מהאזורים הנבחרים (XY), קבעו את פרמטרי ההדמיה המתאימים (כלומר, עוצמת לייזר, רגישות פוטופרטיפת, ורזולוציה מינימלית של 1,024 x 1,024), כמו גם את עומק הסריקה (Z) לפי מטוסי המדגם, כאשר הקרינה הפלואורסצנטית גלויה.
- להשיג תמונות בהגדלה נמוכה (10x) של כל האזורים שנבחרו ולייצא אותם מ-OIF לפורמט TIFF באמצעות תוכנת מציג המיקרוסקופ.
- שנה את עדשת 60x, חזור על שלב 5.3 ולכוד תמונות בהגדלה גבוהה כדי לבחון את האינטראקציות של תאי התא באופן מפורט יותר. יצא אותם כפי שמצוין בשלב 5.4.
- פתח את התמונות שנרכשו עם כל תוכנת דימות (למשל פיג'י) לניתוח נוסף.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אינטראקציות בין תאים שכנים מקורו במקומות האלה ובזמנים שונים: תאים Cajal-רטינוס (CR-תאים) ו הגירה מוקדם הקרנה נוירונים (אסטרטגיה A)
האינטראקציה של ה-CR-תאים ונוירונים הקרנה מוקדם ההטלה תוארה בעבר כנדרש כדי להסדיר את הטרנסלוקציה הזומבית באמצעות nectin ומולקולות הדבקה של קדרין באמצעות האסטרטגיה כפולה אלקטרופורציה8. CR-תאים מקורם נוירואפיתל בקצות הפליום ולהעביר באופן שטחי לאכלס את החלק השטחית ביותר של קליפת המוח, אזור שוליים17,<...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המחקר של אינטראקציות תא תא בvivo באזורים עם צפיפות תאית גבוהה כמו קליפת המוח היא משימה מורכבת. גישות מסורתיות כולל שימוש בנוגדנים לתווית neurites אינם מתאימים בגלל העדר סמנים ספציפיים עבור אוכלוסיות תאים שונות. השימוש במודלים מורגניים, כאשר סוג תא מסוים מבטא חלבון פלורסנט, הוא שימושי להמחיש את התהליכים העצביים, אבל זה תלוי בזמינות של מודלים כאלה. משימה זו מסובכת עוד יותר כאשר מנסים להמחיש את ההבדלים האפשריים באינטראקציות בין שני סוגי תאים מסוימים על-פי הנטייה של הגנים המעניינים, משום שהיא כרוכה בשימוש במודלים אחרים של בע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מודים לכריסטינה אנדרס קרבונל ולחברי המכון לטיפול בבעלי חיים באוניברסידה ולנסיה לקבלת סיוע טכני. כמו כן, אנו רוצים להודות לאיזבל פריניאס ולסקרמנטו ר. פריון לריאגנטים ולשיתוף הציוד שלהם איתנו. אני ממומן על ידי חוזה Juvenil Garantía מתוך Conselleria דה ולנסיה (GJIDI/2018/A/221), D. dA ממומן על ידי Ministerio de Ciencia, חדשנות האוניברסיטה (MICINN) (FPI-PRE2018 086150). ג. גיל-צאנז מחזיק רמון מגרנט (RYC-2015-19058) מ Ministerio de Ciencia הספרדי, האוניברסיטה האנגלית (MICINN). עבודה זו ממומנת RYC-2015-19058 ו-SAF2017-82880-R (MICINN).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מלח נתרן אמפיצילין | סיגמא-אולדריץ' | A9518-25G | |
| צינור שואב | סיגמא-אולדריץ' | A5177-5EA | |
| מיקסטר תינוקות המוסטט (זלוף) | כלי מדע עדינים (FST) | 13013-14 | |
| נימי זכוכית בורוסיליקט | WPI | 1B100-6 | |
| בופרנורפין (בופרקס 0,3 מ"ג/מ"ל) | Rb Pharmaceuticals Limited | ||
| פלסמיד CAG-BFP | מסופק באדיבות על ידי U.Mü ller Lab | ||
| CAG-EGFP פלסמיד | מסופק באדיבות על ידי U.Mü ller Lab | ||
| CAG-mCherry פלסמיד | מסופק בחביבות על ידי U.Mü ller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP פלסמיד | מסופק באדיבות על ידי U.Mü ller Lab | ||
| מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס | FV10i | |
| ספוגיות כותנה | BFHCVDF | ||
| דבק ציאנואקרילט | B. בראון 1050044 | ||
| ניתוח היקף | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont מלקחיים #5 מלקחיים עדינים | כלים מדעיים עדינים (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 מרובע גל אלקטרופורטור | BTX | 45-0052 | |
| סכין גילוח חשמלי | אוסטר | 76998 | |
| מאגר TE נטול אנדוטוקסין | QIAGEN | 1018499 | |
| מגבוני אתנול | BFHCVDF | ||
| מלקחיים עדינים במיוחד של Graefe | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| משחת עיניים | Alcon | 682542.6 | |
| צבע ירוק מהיר | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| מספריים עדינים | כלי מדע עדינים (FST) | 14069-09 | |
| נוריות פלואורסצנטיות | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure פלסמיד ערכת מקסי | Roche | 3143422001 | |
| הלסטד-יתושים המוסטטים (תפר) | כלי מדע עדינים (FST) | 91308-12 | |
| כרית | חימוםUFESA | AL5514 | |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| מגבוני יוד | Lorsoul | ||
| Isofluorane Isofluorane | A15B5001 | ||
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| קטמין (אנסטמין) | Fatro Ibé rica SL | 583889-2 | |
| מגבונים מדויקים של Kimtech | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) מרק GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| נקודת התכה נמוכה agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| כיסויי מיקרוסקופ | Menel-Glä שקופיות | 15747592 | |
| ser Labbox | SLIB-F10-050 | ||
| הרכבה בינונית | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 17984-25 | |
| לוחות Mutiwell (24) | SPL מדעי החיים | 32024 | |
| לוחות Mutiwell (48) | SPL מדעי החיים | 32048 | |
| NaCl (לתמיסת מלח) | פישר סיינטיפיק | 10112640 | |
| מחט 25 גרם (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| חממת אורביטל S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | ||
| 0485472 Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא -Aldrich | P4333 | |
| משאבת זלוף פריסטלטית | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| פינצטה פלטינום, 5 מ"מ קוטר | Btx | 45-0489 | |
| מערכת סגירת עור רפלקס - קליפסים 7 מ"מ, קופסה של 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| מערכת סגירת עור רפלקס - מיישם קליפ, 7 מ"מ | AgnThos | 204-1000 | |
| מלקחיים טבעתיים | כלים מדעיים עדינים (FST) | 11103-09 | |
| נתרן אזיד | PanReac Applied Chem | 122712-1608 | |
| כרית סופגת כירורגית (סטריל) | HK תפר | PD-M | |
| (Surgicryl PGA 6-0) | חומרי תפר SMI | ||
| מזרק BYD11071512 1 מ"ל (BD plastipak) | בקטון, דיקינסון ושות' | צלחת | |
| 100 x 20 מ"מ | פלקון | 353003 | |
| חולץ מיקרופיפטה אנכי | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| מיקרוסקופ אנכי | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
מקורות
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139(2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
