הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ב סיטו Chemotaxis אסאי לבחון התנהגות מיקרוביאלית במערכות אקולוגיות מימיות

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61062

⸱

5 במאי 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zürich, 2Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 3School of Oceanography, University of Washington

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן הוא הפרוטוקול עבור סיסאי chemotaxis סיטו, מכשיר מיקרופלויד שפותח לאחרונה המאפשר מחקרים של התנהגות מיקרוביאלית ישירות בסביבה.

תקציר

התנהגויות מיקרוביאליות, כגון תנועתיות וchemotaxis (היכולת של תא לשנות את תנועתו בתגובה הדרגתי כימי), נפוצים על פני התחומים חיידקיים וארכאיים. Chemotaxis יכול לגרום יתרונות משמעותיים רכישת משאבים בסביבות הטרוגניות. הוא גם ממלא תפקיד מכריע באינטראקציות סימביוטיות, מחלות, ותהליכים גלובליים, כגון רכיבה ביו-גיאוכימית. עם זאת, הטכניקות הנוכחיות להגביל את המחקר chemotaxis למעבדה והם לא ישימים בקלות בתחום. מוצג כאן הוא פרוטוקול שלב אחר שלב לפריסה של סיסטו chemotaxis assay (ISCA), מכשיר המאפשר חקירה חזקה של chemotaxis מיקרוביאלי ישירות בסביבה הטבעית. ISCA הוא מכשיר מיקרו-נוזלים המורכב ממערך של 20 בארות, שבו ניתן לטעון כימיקלים בעלי עניין. לאחר הפריסה בסביבות מימיות, כימיקלים לפזר מתוך הבארים, יצירת מעברי ריכוז כי חיידקים תחושה ולהגיב על ידי שחייה לתוך הבארים באמצעות chemotaxis. לאחר מכן ניתן לדגום את תכולת הבאר ולהשתמש בה כדי לכמת (1) את עוצמת התגובות הכימותרפיות לתרכובות ספציפיות באמצעות ציטומטריית זרימה, (2) לבודד ולתרבות מיקרואורגניזמים מגיבים, ו-(3) לאפיין את הזהות והפוטנציאל הגנומי של האוכלוסיות המגיבות באמצעות טכניקות מולקולריות. ISCA היא פלטפורמה גמישה שניתן לפרוס בכל מערכת עם שלב מים, כולל סביבות ימיות, מים מתוקים וקרקע.

מבוא

מיקרואורגניזמים מגוונים להשתמש בתנועתיות ו chemotaxis כדי לנצל סביבות תזונתיות לא אחידות, למצוא מארחים, או להימנעתנאים מזיקים 1,,2,,3. התנהגויות מיקרוביאליות אלה יכולות בתורן להשפיע על שיעוריהטרנספורמציה הכימית 4 ולקדם שותפויות סימביוטיות על פני מערכות אקולוגיות ארציות, מים מתוקיםומערכות אקולוגיות ימיות 2,5.

Chemotaxis נחקר בהרחבה בתנאי מעבדה במשך 60 השנים האחרונות6. השיטה הכמותית הראשונה ללמוד chemotaxis, תסיסה נימי, כרוך צינור נימי מלא כימותרפיה putative שקוע השעיה שלחיידקים 6. דיפוזיה של הכימיקל מתוך הצינור יוצר מעבר צבע כימי, וחיידקים chemotactic להגיב הדרגתי זה על ידי נדידה לתוך צינור7. מאז הפיתוח של תסיסה נימי, עדיין בשימוש נרחב כיום, טכניקות רבות אחרות פותחו כדי ללמוד chemotaxis בתנאים פיזיים / כימיים מבוקרים יותר ויותר, עם האחרונה מעורבים בשימוש microfluidics8,,9,,10.

מיקרו-נוזלים, יחד עם מיקרוסקופית וידאו במהירות גבוהה, מאפשרים מעקב אחר התנהגותם של תאים בודדים בתגובה לשינועים מבוקרים בקפידה. למרות טכניקות אלה שיפרו במידה רבה את ההבנה שלנו של chemotaxis, הם הוגבלו לשימוש במעבדה ולא לתרגם בקלות פריסת שדה במערכות סביבתיות. כתוצאה מכך, היכולת של קהילות טבעיות של חיידקים להשתמש chemotaxis בתוך מערכות אקולוגיות טבעיות לא נבדקה; לפיכך, ההבנה הנוכחית של החשיבות האקולוגית הפוטנציאלית של chemotaxis מוטה כלפי תנאי מעבדה מלאכותיים ומספר מוגבל של מבודדים חיידקיים במעבדה.תרבית. ISCA שפותח לאחרונה מתגבר על מגבלות אלה11.

ISCA בונה על העיקרון הכללי של ההתכחה ניח; עם זאת, הוא עושה שימוש בטכניקות microfabrication מודרניות כדי לספק פלטפורמה ניסיונית משוכפלת מאוד, לפריסה בקלות לכימות של chemotaxis כלפי תרכובות של עניין בסביבה הטבעית. הוא גם מאפשר זיהוי ואפיון של מיקרואורגניזמים כימיים על ידי בידוד ישיר או טכניקות מולקולריות. בעוד מכשיר העבודה הראשון היה מפוברק עצמו ונבנה זכוכית PDMS11, הגרסה האחרונה הזרקה מעוצב מורכב פוליקרבונט, באמצעות הליך ייצור מתוקן מאוד (לעניין בגרסה העדכנית ביותר של המכשיר, המחברים המתאימים ניתן ליצור קשר).

ISCA הוא בגודל כרטיס אשראי ומורכב 20 בארות מופץ במערך 5 x 4 בארות, כל המקושר לסביבה הימית החיצונית על ידי נמל קטן (800 μm קוטר; איור 1). כימותרפיה פוטטיבית נטען לתוך בארות מפוזרים לתוך הסביבה דרך הנמל, וחיידקים chemotactic להגיב על ידי שחייה דרך הנמל לתוך הבאר. כמו גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה של ניסוי ISCA בסביבה הטבעית, פרוטוקול שלב אחר שלב זה יסייע למשתמשים חדשים להתגבר על מכשולים פוטנציאליים ולהקל על פריסות יעילות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אנו ממליצים לבצע את סעיף 1 לפני ניסויי שדה כדי למטב את התוצאות.

1. אופטימיזציה של המעבדה

הערה: אמצעי האחסון המתוארים בהליך המיטוב מספיקים עבור ISCA יחיד (המורכב מ- 20 בארות).

  1. הכנת הכימיקל של עניין
    הערה: הריכוז האופטימלי עבור כל כימותרפיה לעתים קרובות צריך להיקבע בתנאי מעבדה לפני פריסות שדה. שדה הריכוז הכימי יקטן בעוצמה עם מרחק מהמקור (ISCA היטב), מה שאומר כי הריכוז שחוו מיקרואורגניזמים בסביבה יהיה נמוך יותר מזה הנוכחי בתוך המכשיר. הריכוז האופטימלי לשימוש ב-ISCA תלוי בקצב ההתהודה של הכימותרפיה. אם הריכוז בבאר הוא נמוך מדי (קרוב למגבלת הגילוי של החיידקים), לא יבחינו בכימותרפיה חיובית. לעומת זאת, אם הריכוז בבאר הוא גבוה מדי, הריכוז יהיה גם גבוה בסביבה הקרובה והצטברות מיקרוביאלית תתרחש מעל בארות ISCA ולא בפנים. לכן, סדרת דילול צריכה להתבצע בתנאי מעבדה עבור כל מתחם על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור פריסות שדה. באופן אידיאלי, טווח ריכוז צריך להיבדק גם בשטח כדי לאשר את תוצאות המעבדה.
    1. הכן 2.5 ל' של מדיום מתאים המכיל את ריכוז המלח המתאים (לדוגמה, תמיסת מלח עם חוצץ פוספט [PBS] או מי ים מלאכותיים). סנן את המדיום באמצעות מסנן 0.2 μm באמצעות משאבת פריסלטי או ואקום ו autoclave.
    2. הכן תמיסת 10 מ"מ של כימותרפיה ב-1 מ"ל של המדיום הסטרילי. לסנן את הפתרון chemoattractant עם מסנן מזרק 0.2 μm כדי להסיר חלקיקים ומזהמים פוטנציאליים.
      הערה: באופן אידיאלי, אין תרכובות אורגניות מלבד כימותרפיה צריך להיות נוכח בפתרון הסופי.
  2. טווח ריכוז לפי סדרת דילול
    1. תדלל את פתרון המניות המסונן chemoattractant בסדרות, החל (לדוגמה) מ- 10 mM עד 100 μM.
      הערה: לפחות נפח סופי של 0.7 מ"ל נדרש לכל ריכוז שנבדק.
  3. טעינת ISCA
    1. מלא מזרק של 1 מ"ל עם הכימותרפיה המסוננת וחבר אותו למזרק 27 G. החזקת ISCA עם היציאה פונה כלפי מעלה, לאט להזריק את החומר עד טיפה קטנה מופיעה על גבי היציאה.
      הערה: 1) כל דילול או חומר חייב להיות מוזרק עם מזרק ומחט נפרדים כדי למנוע זיהום צולב. 2) טיפה קטנה זו חשובה משום שהיא מבטיחה כי אין בועת אוויר לכודה בתוך הנמל, אשר עלול לפגוע ביכולת של חיידקים לנדוד דרך הנמל. 3) מומלץ למלא שורה שלמה לכל חומר או ריכוז (חמש בארות) כדי לספק נפח מינימלי הולם לניתוחים נוספים. 4) שורה אחת לכל ISCA צריך לפעול כפקד שלילי ויש למלא עם המדיום מסונן שבו החיידקים יושעו. טיפול זה מסביר את ההשפעה של תנועבת אקראית על ידי חיידקים לתוך בארות ISCA ויש להשתמש בו כדי לנרמל את הטיפולים המכילים כימותרפיה.
  4. פריסה במעבדה
    1. בין לילה, דגירה תרבות 5 מ"ל מועשר 1% מרק ימי (עבור חיידקים ימיים) או 1% מרק ליזוגני (LB, עבור חיידקים מים מתוקים).
      הערה: מבודד חיידקים מוטיב או קהילות חיידקים טבעיים יכול לשמש עבור פריסות מעבדה.
    2. דגירה את התרבות במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר (RT) ו 180 סל"ד. לאחר 12 שעות, ודא כי הקהילות המיקרוביאליות הן מוטיב על ידי תצפית ישירה תחת מיקרוסקופ.
    3. סובבו את התרבות ב-1,500 x גרם למשך 10 דקות ו-1/100 ב-150 מ"ל של מדיום מתאים (לדוגמה, מי ים מסוננים, מים מתוקים מסוננים).
    4. מניחים שתי חתיכות קטנות של סרט דבק דו-צדדי על המשטח השטוח של מגש קיבולת של 200 מ"ל (המכסים של קופסאות קצה של 1 מ"ל יש את הממדים האידיאליים למטרה זו, ניתן בקלות autoclaved). מקם ISCA אחד למעלה, כדי להבטיח שהוא מתחבר באופן מאובטח לקלטת. מלא לאט את מגש הפריסה בתמיסה החיידקית באמצעות פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל.
      הערה: מלאו את המגש עד שה-ISCA תשקע תחת כ-1-2 ס"מ של נוזל. אם אתה משתמש במגשים מרובים, השתמש באותו אמצעי אחסון על-פני כולם.
    5. השאר את ISCA לתגנר במשך 1 שעות כדי לאפשר chemotaxis חיידקים. לאחר שעה אחת, הסר את המדיום בעדינות רבה עם פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל כדי למזער את הזרימה הסוערת.
    6. אחזר את ה- ISCA ממגש הפריסה מבלי לגעת במשטח העליון. השתמש בפיפטה ובגבים חד-פעמיים כדי להסיר את הנוזל הנותר על משטח ISCA.
      הערה: חשוב להימנע מלגעת בנמלים במהלך תהליך זה, כמו השינויים וכתוצאה מכך בלחץ יכול להסיר או להוסיף חיידקים מהסביבה החיצונית לתוך הבאר ובכך להטות את הצפיפות החיידקית והרכב בתוך הבאר.
  5. אחזור הדגימות
    1. מחזיק את ISCA עם היציאה פונה כלפי מטה, לאחזר את נפח הבארים באמצעות מחט סטרילית 27 G מזרק מחובר מזרק 1 מ"ל.
      הערה: כל שורה (אם מכילה את אותו חומר) ניתן לאסוף כדי לספק מדגם עבודה של כ 550 μL. מדגם זה לאחר מכן ניתן לצטט לתוך צינורות שונים בהתאם ליישומים במורד הזרם הנדרשים.
    2. לקבוע את מספר החיידקים נמשכים לכל ריכוז chemoattractant על ידי ניתוח הדגימות עם ציתום זרימה12. בחר את הריכוז של כימותרפיה הממקסמת את הכימותרפיה עבור פריסות שדה עוקבות.

2. הכנה לפריסת שדה

הערה: יש לבצע הכנת חומר ובנייה של מארז שיכוך הזרימה (סעיף 2) לפני הפריסה.

  1. הכנת חומרים
    1. הכן את כל החומרים המפורטים בטבלה 1.
      הערה: כמויות חומרים מסופקות עבור ISCA אחד.
  2. בנייה והכנה של מתחם שיכוך הזרימה
    הערה: מארז שיכוך הזרימה ממזער מערבולות לא רצויות המונעות אחרת הקמת מעברי צבע כימיים הבוקעים מה-ISCA.
    1. חותכים את החלקים עבור מארז הפריסה עם חותך לייזר מסדין אקריליק 3 מ"מ.
      הערה: ניתן למצוא את הקובץ עבור החלקים באמצעות הקישור הבא: .
    2. להרכיב את החלקים בחיתוך לייזר כפי שהוכח איור 2 באמצעות דבק אקרילי.
      הערה: להרכיב את החלקים בזהירות. חורים או אי-יישור יכולים ליצור דליפות בעת הפריסה, דבר המשפיע ישירות על איכות הנתונים.
    3. השאר את המתחם המורכב להתייבש בן לילה.
    4. לשטוף את המתחם עם מים deionized.
    5. זהה דליפה אפשרית על ידי שפיכת מים מנוים לתוך המתחם. לתקן את כל המפרקים דולף פוטנציאלי על ידי הוספת דבק אקריליק יותר, ולאחר מכן לחזור על שלבים 2.2.3–2.2.5.
    6. חותכים את חוטי הבורג לתוך חתיכת אקריליק שישמש כדי לאבטח את ISCA. ניתן להשיג זאת באמצעות ברז בקוטר ועם גובה התואם את ברגי ההרכבה.
      1. ראשית, הדבק את הברז לתוך מפתח ברגים, לאחר מכן לאבטח את חתיכת אקריליק להיות טפח בסגן ספסל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ודא פיסת אקריליק הוא ברמה ככל האפשר. ודא כי הברז הוא ניצב על פיסת אקרילי ולהתחיל לסובב את מפתח הברז (בכיוון השעון), הפעלת לחץ קל על הברז.
      2. לאחר כמה מהפכות מלאות בחתיכה אקריליק, להפוך את הסיבוב של הברז (נגד כיוון השעון) עבור רבע סיבוב כדי לנקות אקריליק מהברז. חזור על התהליך עד כל העומק של חתיכת אקריליק הוא טפח.
      3. לבסוף, הסר את הברז (פונה נגד כיוון השעון) ובדוק את הליכי המשנה באמצעות בורג.

3. נוהל בתחום

  1. סינון מים
    1. לאסוף מים מאתר השדה כאשר מוכן להתחיל את הניסוי. מסנן 5 מ"ל מים לכל ISCA באמצעות מסנן מזרק 0.2 μm (עם מזרק 50 מ"ל) לתוך צינור צנטריפוגה חרלי 50 מ"ל.
      הערה: כ-3 מ"ל של מים מסוננים נדרשים למלא את כל בארות ISCA; עם זאת, מומלץ 1) מסנן 5 מ"ל לכל מכשיר כדי להסביר הפסדים במהלך תהליך סינון מרובע, ו 2) לשמר aliquots של filtrates כמו פקדים שליליים עבור שני ציטומטריה זרימה והליכים מולקולריים.
    2. לסנן את הסינון פעמיים דרך מחסנית מסנן GP הידרופילי 0.2 μm (באמצעות אותו אחד, בשתי הפעמים) עם מזרק חדש 50 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה חרסית 50 מ"ל חדש. לסנן את הסינון דרך מסנן מזרק 0.02 μm (עם מזרק חדש 50 מ"ל) לתוך צינור חרס חדש 50 מ"ל.
      הערה: סינון מרובע זה צריך להסיר כמעט את כל מיקרואורגניזמים וחלקיקים מהמים. להרחיק את הסינון הסופי מכל מקור חום עד לשימוש. מים אלה ישמשו לשימוש חוזר של כל הכימיקלים המשמשים ב-ISCA, ויש לשמור עליהם באותה טמפרטורה כמו המים באתר הפריסה. זרמים קונבקטיביים המופעלים על ידי הבדלים בטמפרטורה בין בארות ISCA והסביבה החיצונית עלולים להתרחש אחרת.
    3. השתמש aliquots של הסינון כדי לתפור מחדש את כל chemoattractants של עניין (בדרך כלל יבש) לריכוזים הרצויים בצינורות צנטריפוגה חרסית 15 מ"ל.
    4. לסנן את הכימותרפיה מחדש דרך מסנן מזרק 0.2 μm עם מזרק 10 מ"ל לתוך צינורות צנטריפוגה חסין 15 מ"ל כדי להסיר חלקיקים לא רצויים או תרכובות מסיסות מים (אם באמצעות תמציות).
      הערה: סנן בעדינות כדי למנוע מחלקיקים לעבור דרך המסנן. חשוב לתבל מחדש את הכימותרפיה במים המנוננים במיוחד מאתר השדה ולא להסב את היציבות שלהם לפתרונות אחרים. שימוש במים מאתר השדה הכרחי כדי (1) להשיג את אותו ריכוז מלח בתוך הבארים כמו זה במים הסביבתיים בתפזורת כדי למנוע זרימה מונעת צפיפות, ו-(2) להבטיח כי רמות החומרים המזינים ברקע שוות בתוך הבאר ומחוצה לה.
  2. מילוי ISCA
    1. בצע את סעיף 1.3 כדי למלא את ה- ISCA.
      הערה: מומלץ למלא שורה אחת (חמש בארות) לכל חומר (כלומר, שלושה חומרים שונים לכל ISCA ובקרת מי ים אחת מסונון במיוחד).
  3. פריסה בשדה
    1. בורג ISCA(איור 3A)לחתיכה 9 של המתחם (איור 2K ו איור 3B).
      הערה: מארז שיכוך הזרימה המתואר לעיל יכול להכיל שני תתי-יחידות קאי זה לצד זה או ISCA אחד הממוקם במרכזו.
    2. סגור את המארז(איור 3C)ולאטום אותו עם סרט דבק(איור 3D).
      הערה: יש להימנע מקמטים כדי להבטיח אטם מושלם. אטמו תחילה את כל הצדדים, ולאחר מכן (בשלב שני) לאטום את החורים הצדדיים, אשר ישמשו לנקז מים מהמתחם בסוף הדגימה. אל תאטמו את החורים העליונים והתחתון. אין למקם את ISCA הפוך, כמו זרימה מונעת צפיפות יכול להתרחש בארות המכילות כימותרפיה, אשר יהיה להטות את מספר התאים בארות.
    3. מכיוון שהמתחם חייב להישאר יציב במהלך הפריסה, מומלץ לחבר אותו למבנים בעבודת אדם (לדוגמה, פונטון, סולם) באמצעות כבלי בנג'י.
      הערה: ניתן לחבר את המארז לזרוע פריסה (כאן, מלחציים מותאמים עם פלטפורמה ניצבת) באמצעות כבלי בנג'י לפני הטבילה במים. לחלופין, ניתן למלא את המתחם ולאבטח אותו עם משקל קטן על מצעים רדודים. אם פריסות מיועדות באוקיינוס הפלגי, ניתן לחבר את המתחם לרשת עם מצוף בצד אחד ולצלול במשקל בצד השני.
    4. לשקוע במתחם לחלוטין כדי להתחיל למלא. בעת מילוי, החזק את המתחם בחוזקה כדי למנוע תנועת מים מוגזמת בפנים. ברגע שמפלס המים מגיע לראש המתחם, ודא שאין אוויר לכוד בפנים.
      הערה: במקרה כמה בועות אוויר לכודים, להטות את המתחם בעדינות עם חור האוורור פונה כלפי מעלה, אשר יאפשר בועות לברוח.
    5. לאחר מלא לחלוטין, לאטום את החורים התחתית והלמעלה עם שני תקעים, אשר יכול להיות עשוי סיליקון או גומי או על ידי איטום הגפיים של 20 μL פיפט טיפים(איור 4).
      הערה: שלב זה מונע זרימה בתוך המארז במהלך הדגימה.
    6. השאר את ISCA במקום לדגימת עבור 1-3 שעות.
      הערה: זמן הפריסה האידיאלי מוכתב בעיקר על ידי טמפרטורת המים והכפלת זמן הקהילה החיידקית. כאשר טמפרטורת המים היא מעל 20 °C, לא מומלץ לפרוס את ISCA עבור יותר מ שעה אחת, מכיוון חלוקת תאים יכול להתרחש בארות המכילות כימותרפיה לאחר 1.5-2.0 שעות. עם זאת, זמן פריסה אופטימלי ניתן לבדוק לפני הניסוי ISCA על ידי תיקון קהילות טבעיות עם כימיקלים טעונים וכמת את מספר התאים לאורך זמן.
    7. הסר את המתחם מהמים. מניחים אותו מעל מיכל המאפשר לרוקן את המים מהמתחם.
    8. הסר את החלק העליון של סרט הדבק מהחורים הקדמיים בעדינות רבה.
      הערה: זרימת המים העוזבת את המתחם חייבת להיות במהירות נוטפת. המשיכו חור אחד בכל פעם, מההעליון של המתחם לתחתית. זה צריך לקחת בערך 10-15 דקות כדי לרוקן את המתחם לחלוטין.
    9. לאחר שקווי המים עוברים מתחת לראש ISCA, הסר את התקע התחתון ורוקן את שאר המים.
    10. בעוד ISCAs עדיין מחוברים למתחם, בזהירות להסיר את המים לכודים על גבי ISCA עם פיפטה 1 מ"ל.
    11. הסר את ISCA מבלי לגעת במשטח העליון והשתמש במגבונים חד-פעמיים כדי להסיר את כל הנוזלים הנותרים על פני השטח.
      הערה: חשוב לא לגעת בנמלים במהלך תהליך זה, כמו השינויים וכתוצאה מכך בלחץ יכול להסיר או להוסיף חיידקים בתפזורת לתוך הבאר ולהטיה ספירות חיידקים.
    12. אחזר את הדגימות מה-ISCA על-ידי חזרה על שלב 1.5.1.

4. יישומים במורד הזרם

הערה: אמצעי אחסון ניתנים בהתבסס על מדגם μL 550 (שורה אחת של ISCA).

  1. לתקן 100 μL של תוכן טוב עם גלוטרלדהייד (2% ריכוז סופי) עבור ציתום זרימה לכמת chemotaxis לכל מושך.
    הערה: לאחסן על קרח (או ב- 4 °C) ולנתח את הדגימות באותו היום. לחלופין, דגימות יכול להיות פלאש קפוא חנקן נוזלי בעקבות קיבעון אם הניתוח אינו אפשרי באותו היום. ציתום זרימה היא השיטה המומלצת לכמת את מספר התאים בארות ISCA, כפי שהוא פשוט, מהיר, ומדויק12.
  2. הצמד להקפיא 300 μL של תוכן טוב חנקן נוזלי עבור הפקת DNA עוקבות וניתוח11.
    הערה: אחסן את הדגימות ב- -80 °C עד לניתוח.
  3. הוסף 90 μL של תוכן באר 10 μL של מאגר TE-גליצטרול והצמד-להקפיא את הדגימות עבור גנומיקה של תא יחיד13.
  4. מורחים 10-20 μL על לוחות אגר המכילים את המדיום הרצוי לבידוד חיידקי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סעיף זה מציג תוצאות מעבדה באמצעות ISCA כדי לבדוק את התגובה chemotactic של חיידקים ימיים לטווח ריכוז של גלוטמין, חומצת אמינו ידוע למשוךחיידקים קרקע 14. ריכוז הגרלוטמין שהביע את התגובה הכימית החזקה ביותר בבדיקות המעבדה שימש לביצוע תסיסה כימית בסביבה הימית.

כדי לבצע את בדיקות המעבדה, קהילות מי ים שנדגמו ממי החוף בסידני, אוסטרליה, הועשרו עבור תאיםצייתנים באמצעות תיקון תזונתי פשוט 4, כמתואר בשלב 1.4. גלוטמין היה מדולל באופן סדרתי במי ים אולטרה מסוננים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בקנה מידה של מיקרואורגניזמים ימיים, הסביבה רחוקה מלהיות הומוגנית ומאופיינת לעתים קרובות על ידי מעברי צבע פיזיים/כימיים המוסיינים קהילות מיקרוביאליות1,15. היכולת של מיקרואורגניזמים מוטיב להשתמש בהתנהגות (כלומר, chemotaxis) מקל על חיפוש מזון בתוך מיקרו מיקרו-סביבה הטרוגנית אלה1. לימוד chemotaxis ישירות בסביבה יש פוטנציאל לזהות אינטראקציות בין ספציפיות חשובות והעדפות כימיות, וזה יכול לעזור להתיר את התרומות של חיידקים ספציפיים לתהליכים ביו-כימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה מומן בחלקו על ידי יוזמת המיקרוביולוגיה הימית של קרן גורדון ובטי מור, באמצעות מענק GBMF3801 לג'יי.אר.ס ו-ר.ס, ופרס חוקר (GBMF3783) ל-R.S., כמו גם מלגת מועצת המחקר האוסטרלית (DE160100636) לג'יי.בי.אר, פרס מקרן סימונס ל-B.S.L. (594111) ומענק מקרן סימונס (542395) ל-R.S. כחלק מעקרונות המערכות האקולוגיות המיקרוביאליות (PriME).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דבק אקריליEvonik1133Acrifix 1S 0116
גיליון אקריליMcMaster-Carr8505K725או חברה אחרת
סרט דבקסקוטש3M 810סקוטש קסם קלטת
חיטויSystecD-200או חברה אחרת
צנטריפוגה ספסלפישר סיינטיפיק75002451או חברה אחרת
כבל באנג'יParacord Planet667569184000או
צינור צנטריפוגה של חברה אחרת - 2 מ"לצינור סיגמא אולדריץ'BR780546-500EAEppendorf
צינור צנטריפוגה חרוטי - 15 מ"לחרוטי 11507411 פישר סיינטיפיק
צינור צנטריפוגה חרוטי - 50 מ"לפלקוןפישר סיינטיפיק10788561
זרוע פריסהאירווין1964719או חברה אחרת
תקע מארז פריסהפישר סיינטיפיק21-236-4ראה חלופות בכתב היד
מגבים חד פעמייםKimtech - Fisher Scientific06-666Kimwipes
Flowcytometer בקמןC09756CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%Sigma AldrichG5882או חברה אחרת
צבע פלורסנט ירוקSigma AldrichS9430SYBR Green I - דילול סופי של 1:10,000
מחסנית מסנן GP הידרופילי - 0.2 ומיקרו; mMerckC3235Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)-צור קשר עם מחברים מקבילים
חותך לייזרEpilogLaser Fusion pro 32או חברה אחרת
Luria Bertani BrothSigma AldrichL3022או חברה אחרת
מרק ימי 2216VWR90004-006Difco
ניילון ברגים עם ראש שטוח מחורץMcMaster-Carr92929A243M 2 ופעמים; 4 ופעמים; סט פיפטה 8 מ"מ
פישר סיינטיפיק05-403-151או
קצות פיפטה של חברה אחרת - 1 מ"לפישר סיינטיפיק21-236-2Aאו טיפים לפיפטה של חברה אחרת
- 20 ומיקרו; Lפישר סיינטיפיק21-236-4או טיפים לפיפטות של חברה אחרת
- 200 ומיקרו; Lפישר סיינטיפיק21-236-1או חברה אחרת
מלח יםסיגמא אולדריץ'S9883למי ים מלאכותיים
פיפטה סרולוגית - 50 מ"לסיגמא אולדריץ'SIAL1490-100EAאו מסנן מזרק של חברה אחרת
- 0.02 ומיקרו; mWhatmanWHA68091002מסנן Anatop
מסנן מזרק - 0.2 & מיקרו; mפישר סיינטיפיק10695211או מחט מזרק של חברה אחרת
27GHenke Sass Wolf47100040200.4 & פעמים; מזרקים 12 מ"מ
- 1 מ"לCodau329650מזרקי אינסולין Luer U-100
- 10 מ"לBD303134של חברה אחרת
- 50 מ"לBD15899152או צינור חברה אחרת
מתלה - 15 מ"לתומאס סיינטיפיק1159V80או חברה אחרת
מתלה צינורות - 50 מ"לתומאס סיינטיפיק1159V80או חברה אחרת
פלדה במהירות גבוהה לא מצופה ברז לשימוש כללימקמאסטר-קאר8305A77או חברה אחרת
מסנן ואקום - 0.2 ומיקרו; mMerckSCGPS05REמסנן Steritop
צינור צנטריפוגה צינור או מזרקים

מקורות

  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
  2. Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
  3. Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
  4. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
  5. Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
  6. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
  7. Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
  8. Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
  9. Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821(2014).
  10. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
  11. Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
  12. Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
  13. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
  14. Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
  15. Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

כימוטקסיס מיקרוביאליניתוח באמצעות ציטומטריה זורמתריכוז חומר משיכה כימימצע גידול חיידקיפרוטוקול פריסה בשטחמערך התקני מיקרופלואידיקהכימות תגובה כימוטקטיתסינון תמיסות סטרילידגימה של מערכת אקולוגית מימית
ב סיטו Chemotaxis אסאי לבחון התנהגות מיקרוביאלית במערכות אקולוגיות מימיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.