אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתקת מיקרו-רנ"א מבוססת וירוסים (VbMS) היא כלי מהיר ויעיל לאפיון פונקציונלי של מיקרו-רנ"א (miRNAs) בצמחים. מערכת VbMS פותחה ויישמה עבור מיני צמחים שונים כולל ניקוטיאנה בנתמיאנה, עגבניות, Arabidopsis, כותנה, וצמחי מונוקוט כגון חיטה ותירס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט באמצעות וקטורים VbMS מבוססי PVX כדי להשתיק miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה. כדי להפיל את הביטוי של miRNA ספציפי, מולקולות חיקוי יעד (TM) של miRNA של עניין מתוכננים, משולבים בווקטורים וירוס הצמח, ובא לידי ביטוי תפוח אדמה על ידי חדירת אגרובקטריום להיקשר ישירות miRNA אנדוגני של עניין ולחסום את הפונקציה שלה.
מבוא
מיקרו-רנ"א צמחיים (miRNAs) מאופיינים כ-RNAs רגולטוריים באורך 20-24 נוקלאוטידים, המקודדים לגרעין1 וממלאים תפקידים בסיסיים כמעט בכל היבט של תהליכים ביולוגיים צמחיים, כולל צמיחה ופיתוח2,3, פוטוסינתזה וחילוף חומרים4,5,6,7, סינתזת הורמונים ותגובות איתות8,9, ביוטיות ואביוטיות10, 11,12,13, ורגולציה תזונתית
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. לגדל צמחי תפוחי אדמה.
- להפיץ צמחים תפוחי אדמה במבחנה בצינורות תרבות (25 x 150 מ"מ) עם Murashige ו Skoog (MS) מדיה בתוספת ויטמין של גמבורג (תערובת מלח בזאלי MS, ויטמין של גמבורג, 30 גרם / L סוכרוז, 3.5 גרם / ליטר אגר, pH = 5.7). מניחים את הצינורות בחדר הצמיחה מתחת ל-20-22 °C (50 °F), 16 שעות אור/8 שעות פוטופריוד כהה, ועוצמת האור 120 מיקרומול/מ"ר 2∙s1.
הערה: יורה חדש ושורשים מתפתחים בדרך כלל 1-2 שבועות מצמחים. להפיץ צמחים עם מדיה ויטמין טרי MS / גמבורג מדי חודש. - ארבעה שבועות לאחר מכן, להשתיל בצמחי במבחנה לתוך האדמה ולגדל אותם בחממה תחת 20-22 °C (20 °F), 16 שעות אור / 8 שעות פוטופריוד כהה, ועוצמת האור 120 מיקרומול / m2<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מציג את צמחי תפוחי האדמה PVX-STTM165/166 (קטהדין) עם צמיחה חוץ רחמית של רקמות עלים מהצד האבקסיאלי של למינה עלים לאורך הוורידים. פנוטיפים חמורים יותר כגון היווצרות עלה בצורת חצוצרה נצפו גם. לעומת זאת, לא נצפתה חריגה פנוטיפית במפעלי הבקרה של PVX. תוצאות אלה מראות כי מערכת VbMS הייתה יעילה בדיכוי תפקוד miRNA אנדוגני בצמחי תפוחי אדמה טטרפלואידים ומערכת PVX-VbMS הייתה כלי גנטי חזק כדי לקבוע את הפונקציה של miRNAs ספציפיים או משפחות miRNA.
איו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מציגים מערכת השתקה miRNA מבוססת PVX כדי לאפיין את הפונקציה של miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה על ידי שילוב עיצוב STTM לתוך וקטור PVX. מערכת VbMS הוכיחה את עצמה כיעילה בהשתקת miRNA165/166 בתפוחי אדמה, משפחת מירנ"א שמורה ביותר על פני מיני צמחים.
גישת TM פותחה כדי להפריע לביטוי של miRNAs המבוסס על חיקוי יעד miRNA מלאכותי שנועד ליצור לולאת אי התאמה באתר המחשוף הצפוי בתוך רצף ההשלמה של miRNA המביא לפירוק של miRNA ממוקד ומעצר פעילותה22,35,78,79
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים לד"ר יול ליו מאוניברסיטת צינגחואה על שסיפק את וקטור PVX-LIC. עבודה זו נתמכה על ידי קרן סטארט-אפ מטקסס A&M AgriLife Research ופרויקט האץ' TEX0-1-9675 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות האמריקאי ל- JS.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 100 ומיקרו; M dATP ו-100 ומיקרו; M dTTP | אומגה ביו-טק, בע"מ, נורקרוס, נורקרוס, GA 30071, ארה"ב | TQAC136 | |
| 3 M נתרן אצטט, pH 4.0. | Teknova, Hollister, CA 95023, ארה"ב | ||
| Acetosyringone | TCI America, פורטלנד, OR 97203, ארה"ב | D2666-25G | |
| Agrobacterium tumefaciens זנים: GV3101, GV2260 או EHA105. | |||
| כלורופורם | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב | VWRV0757-950ML | |
| דימתיל סולפוקסיד, DMSO | TCI America, פורטלנד, OR 97203, ארה"ב | D0798-25G | |
| DTT | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב | VWRV0281-25G | |
| E. coli DB3.1 | לתחזוקה של PVX-LIC ו-pTRV2e המכילים את הגן ccdB | ||
| אי קולי DH5 ואלפא; | עבור מבני היעד הנוצרים על ידי דשן שיבוט LIC | ||
| : Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed | ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA | G99260 | |
| ריאגנטים PCR בנאמנות גבוהה: KAPA HiFi DNA Polymerase עם dNTPs | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA | 7958960001 | |
| אלכוהול | איזואמילVWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב | VWRV0944-1L | |
| Koptec אתנול טהור – 200 Proof | Decon Labs, King of Prussia, PA 19406, USA | V1005M | |
| MES | TCI AMERICA, פורטלנד, OR 97203, ארה"ב | M0606-250G | |
| MgCl2 | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | MFCD00149781 | |
| M-MuLV Reverse Transcriptase | ניו אינגלנד BioLabs, איפסוויץ', MA 01938-2723 ארה"ב | M0253L | |
| ספקטרומטר ננו-טיפה: NanoDrop OneC ספקטרופוטומטר UV-Vis מיקרונפיום עם Wi-Fi | ThermoFisher, וולת'אם, MA 02451, ארה"ב | ND-ONEC-W | |
| PCR: Bio-Rad MyCycler PCR System | Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה 94547, ארה"ב | 170-9703 | |
| מכונת PCR: Eppendorf Mastercycler pro | Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, ארה"ב | מד pH 950030010 | |
| Sper Scientific, סקוטסדייל, AZ 85260, ארה"ב | מד pH / mV שולחני - 860031 | ||
| פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1), pH 6.7 / 8.0. | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, ארה"ב | VWRV0883-400ML | |
| פיטאג'ל: Gellan Gum | Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, ארה"ב | J63423-A1 | |
| PVX וקטור VIGS: PVX-LIC | Zhao et al., 2016 | ||
| מכונת PCR בזמן אמת: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | 4485697 | |
| מגיב PCR בזמן אמת: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) ערכת | ריצוף רוש ומדעי החיים, Kapa Biosystems, ווילמינגטון, MA 01887, ארה"ב | 7959389001 | |
| אנזים הגבלה: SmaI | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 ארה"ב | R0141S | |
| ריאגנטים לשעתוק הפוך: qScript cDNA SuperMix | Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA | 95107-100 | |
| ערכת מיצוי RNA: E.Z.N.A. RNA צמחי Kit | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, ארה"ב | מק"ט: D3485-01 | |
| מעכב RNase Murine | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0314L | |
| RNAzol RT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA | R4533 | |
| אדמה: Metro-Mix 360 | Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA | Metro-Mix 360 | |
| T4 DNA פולימראז ו מאגר | ניו אינגלנד BioLabs, איפסוויץ', MA 01938-2723 ארה"ב | M0203S |
מקורות
- Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
- Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
