מודל החיסונים הוא כלי רב ערך לאפיון תגובות נוירודלקתיות המושרה בvivo. בפרט, היא מספקת הערכה ברורה של קינטיקה ויראלית ותהליכים immunopathological משויכים המופעלים במערכת העצבים ההיקפית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עכבר כרית הרגליים מודל לחקר ויראלי המושרה תגובות נוירודלקתיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר מודל החיסון לשימוש לימוד ייזום ופיתוח של תגובות נוירודלקתיות במהלך זיהום וירוס אלפא בעכברים. כמו אלפא וירוסים הם הפולשים העיקריים של מערכת העצבים ההיקפית (היקפית), מודל זה מתאים לאפיין את קינטיקה של שכפול נגיפי, התפשטות שלו מ היקפית ל-CN, ותגובות נוירודלקתיות הקשורים. מודל כרית הרגליים מאפשר חלקיקי וירוס להתפשט מאתר זיהום ראשוני באפידרמיס הfootpad לסיבי עצב חושי ואוהד הinnervate את האפידרמיס, בלוטות זיעה, ו dermis. הזיהום מתפשט דרך העצב המגיד לגנגוליה השורש (DRG) ובסופו של דבר דרך חוט השדרה אל המוח. כאן, footpad העכבר הוא מחוסן עם וירוס פסבדו אקראי (PRV), וירוס אלפהרתקרוב הקשורות וירוס הרפס (HSV) אבעבועות רוח-זוסטר וירוס (VZV). מודל זה ממחיש כי זיהום PRV מעורר דלקת חמורה, מאופיין הסתננות נויטרופילים ב footpad ו DRG. ריכוזים גבוהים של ציטוקינים דלקתיים מזוהים לאחר מכן ברקמות הומוגניים על ידי אליסה. בנוסף, מתאם חזק הוא הבחין בין הגן PRV וביטוי חלבון (דרך qPCR ו IF כתמים) ב DRG וייצור ציטוקינים פרו דלקתיים. לכן, מודל החיסון העצמי מספק הבנה טובה יותר של התהליכים הבסיסיים המושרה על ידי הנגיף אלפא, ועלול להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. בנוסף, המודל יכול להנחות מחקר על neuropathies היקפית, כגון טרשת נפוצה ונזק המושרה ויראלי הקשורים היקפית. בסופו של דבר, זה יכול לשמש ככלי חסכוני vivo לפיתוח התרופה.
מבוא
מחקר זה מתאר מודל כרית החיסון כדי לחקור את השכפול והתפשטות של וירוסים מ היקפית ל-CN ותגובות נוירודלקתיות הקשורים. מודל footpad החיסון השתמשו באופן אינטנסיבי כדי לחקור את הזיהום וירוס אלפא בנוירונים1,2,3. המטרה העיקרית של מודל זה היא לאפשר וירוסים נוירוטרופי לנסוע במרחק מקסימלי דרך היקפית לפני שהגיע ל-CN. כאן, מודל זה משמש כדי להשיג תובנות חדשות בפיתוח נוירופתיה מסוימת (גירוד נוירופתי) בעכברים נגועים בווירוס פסבדו אקראי (PRV).
PRV היא וירוס אלפא הקשורים מספר פתוגנים ידועים (קרי, הרפס סוג 1 ו 2 [HSV1 and HSV2] ו אבעבועות רוח-zoster וירוס [VZV]), אשר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ניסויי בעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול (מספר 2083-16 ו 2083-19) שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים המוסד (IACUC) של אוניברסיטת פרינסטון. עבודה זו נעשתה על ידי בקפדנות הדרישות ברמת בטיחות 2 (BSL-2), אשר יש לנו מעבדה מאובזר באופן מלא אושרה על ידי ועדת אוניברסיטת פרינסטון בטיחות הוועדה. ההליכים כולל שחיקה באמצעות העכבר, החיסון הנגיפי, ניתוח העכבר, ואוסף רקמות בוצעו בארון בטיחות ביולוגי (תואר ראשון) בחדר מתקן ביולוגי באוניברסיטת פרינסטון. אלה המבצעים את ההליך לבשו שמלות חד פעמיות, כיסוי ראש, הגנת עיניים, כפפות סטרילי, מסכות כירורגיות וכיסויי נעליים.
1. משטח העכבר שחיקה
- הרדמה לעכבר C57BL/6 (5 – 7 שבועות) עם מהרדמה גז isof....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
העכבר הfootpad המודל מאפשר אפיון של הimmunopathogenesis של דלקת וירוס אלפא בvivo, כולל שכפול והתפשטות של הזיהום מתוך footpad מחוסן למערכת העצבים אינדוקציה של תגובות נוירודלקתיות ספציפיות.
במחקר זה, אנחנו הראשון שבשנו את העכבר האחוריות footpad ו או ללעוג מחוסן או מחוסן האזור השורק עם זן השני של PRV (PRV-בקר). האתר של שחיקה היה גלוי הfootpad השליטה. קרום נוצר באתר השחיקה כחלק מתהליך הריפוי (איור 1, חץ שחור). לעומת זאת, עכברים שחוסנו עם PRV הראו דלקת חמורה בנקודת הקצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודל החיסונים שמתואר כאן הוא שימושי כדי לחקור את ייזום ופיתוח של תגובות נוירודלקתיות במהלך זיהום וירוס אלפא. יתר על כן, זה במודל vivo משמש כדי ליצור את קינטיקה של שכפול והתפשטות של אלפא וירוס מהיקפית ל-CN. זהו חלופה לדגמים אחרים, כגון העור אגף החיסון, אשר מסתמך על גירוד בעורי עמוק13, או את התוואי התוך-גולגולתי, אשר מציג ישירות את הווירוס לתוך ה-cn14,15,16. כתוצאה מכך, עם דגם footpad, ניתן להשיג הערכה מפור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מכירים במעבדות של שארל ריבר על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם ביצוע ניתוחי histopathology. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (NINDS) (RO1 NS033506 ו RO1 NS060699). לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדנים נגד PRV gB | תוצרת המעבדה | 1/500 דילול | |
| Aqua-hold2 פאפ אדום | פישר מדעי | 2886909 | |
| לוחות אמרי קומפקטיים-24 ספירה (100/180 קבצי ציפורניים חצץ) | Revlon | ||
| קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA | סיגמא-אולדריץ' | 11836170001 | |
| C57BL/6 עכברים (5-7 שבועות) | הג'קסון | ||
| (1 מ"ג/מ"ל) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 דילול |
| צלחת פטרי פוליסטירן סטרילית חד פעמית 100 x 15 מ"מ | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences | SH30022 | |
| תמיסת מלח פופט בופר (PBS) של Dulbecco | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences | SH30028 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Hyclone, GE Healthcare מדעי החיים | SH30088 | |
| מספריים מעוקלים עדינים נירוסטה | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G מדיה הרכבה | Fisher scientific | 0100-01 | |
| תמיסת פורמלין, ניטרלי חוצץ 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| איזותזיה איזופלורן | הנרי שיין | NDC 11695-6776-2 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל | דנוויל סיינטיפיק | 1000945 | |
| מיקרוטיוב 1.5 מ"ל | SARSTEDT | 72692005 | |
| סרום עיזים שלילי | וקטור | S-1000 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 154022 | |
| מחט גלישה מדויקת 18G | BD | 305196 | |
| סכיני גילוח פלדה גב | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| חרוזי נירוסטה, 5 מ"מ | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost / בתוספת שקופיות מיקרוסקופיות | פישר מדעי | 12-550-15 | |
| לייזר רקמות LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (עיזים נגד עכברים) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 דילול |
מקורות
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spr....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
