מאמר שיטה

ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61133

⸱

20 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Institut Pasteur, Unité Environnement et Risques Infectieux, Cellule d'Intervention Biologique d'Urgence (CIBU), 3Cellule Pasteur, Université de Paris

במאמר זה

סיכום

דיווח כאן הוא פרוטוקול לכימות של חלקיקים ויראליים זיהומיות באמצעות ניטור בזמן אמת של עכבה חשמלית של תאים נגועים. יישום מעשי של שיטה זו מוצג על ידי כימות שפעת A וירוס ריקבון תחת פרמטרים פיסיקוכימיים שונים המחקים תנאים סביבתיים.

תקציר

שיטות לכימות חלקיקי וירוס מייצגות היבט קריטי של מחקרים וירולוגיים רבים. למרות שקיימות מספר טכניקות אמינות, הן גוזלות זמן רב או אינן מסוגלות לזהות וריאציות קטנות. מוצג כאן פרוטוקול לכימות מדויק של טיטר ויראלי על ידי ניתוח וריאציות עכבה חשמלית של תאים נגועים בזמן אמת. עכבה תאית נמדדת באמצעות ביו-סנסורים מיקרואלקטרודים מזהב הממוקמים מתחת לתאים במיקרופלסטיק, שבהם הגודל תלוי במספר התאים, כמו גם בגודלם ובצורתם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח בזמן אמת של התפשטות תאים, כדאיות, מורפולוגיה והגירה עם רגישות מוגברת. כמו כן מסופקת דוגמה ליישום מעשי על ידי כימות הריקבון של וירוס שפעת A (IAV) שהוגש לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים המשפיעים על זיהום ויראלי לאורך זמן (כלומר, טמפרטורה, מליחות, pH). עבור יישומים כאלה, הפרוטוקול מפחית את עומס העבודה הדרוש תוך יצירת נתוני כימות מדויקים של חלקיקי וירוס זיהומיות. זה מאפשר השוואה של מדרונות אי-השבתה בין IAV שונים, אשר משקף את יכולתם להתמיד בסביבה נתונה. פרוטוקול זה קל לביצוע, ניתן לשחזור מאוד, והוא יכול להיות מיושם על כל וירוס המייצר אפקטים ציטופתיים בתרבית התא.

מבוא

העברת וירוס מסתמכת על שילוב של מספר גורמים. עבור וירוס המופרש בסביבה, העברתו תלויה גם ביכולת להתמיד בתנאים מחוץ למארח. לימוד אי-ההשבתה הנגיפית באופן כללי הוא, אם כן, צעד מכריע בסיוע לרשויות הבריאות הלאומיות ולקובעי המדיניות ליישם אמצעי בקרה ובטיחות ביולוגית.

הידע על התמדה בנגיף בהגדרות טבעיות ומעבדה גדל במידה ניכרת בעשור האחרון. במקרה של וירוסי שפעת A (IAV), נתיבי ההולכה שלהם מגישים חלקיקים ויראליים למגוון רחב של תנאים סביבתיים. באופן ספציפי, הם יכולים להיות מועברים באמצעות 1) מסלולים צואתיים דרך מים (כלומר, וירוסי עופות), או 2) מגע ישיר או עקיף על ידי fomites מזוהמים, כמו גם אירוסולים וטיפות נשימה (כלומר, עופות ווירוסים יונקים)1. בכל מקרה, IAV מוגשים לפרמטרים פיסיקוכימיים שונים (כלומר, pH, מליחות, טמפרטורה ולחות), אשר משפיעים פחות או יותר במהירות על הזיהום שלהם2,3,4,5,5,6,7,8,9. יש חשיבות רבה, במיוחד לגבי וירוסים זואונוטיים ומגיפה, כדי להעריך את הפוטנציאל של גורמים סביבתיים להשפיע על הדינמיקה של וירוס ואת הסיכונים של חשיפה והעברה בין מינים.

עד כה, טכניקות וירולוגיה מסורתיות (כלומר, קביעת טיטר ויראלי באמצעות בדיקות פלאק או 50% תרבות רקמות הערכת מינון זיהומיות) שימשו להערכת זיהום IAV לאורך זמן; אבל טכניקות אלה גוזלות זמן רב ודורשות אספקה רבה 10,11,12. מדידת עכבה תאים נגועים לאורך זמן עם microelectrodes משמש ככלי שימושי כדי לפקח על הישרדות IAV בתנאים סביבתיים שונים, כמו גם איון ויראלי בכלל. שיטה זו מספקת נתונים אובייקטיביים בזמן אמת המחליפים התבוננות אנושית סובייקטיבית של השפעות ציטופתיות. זה יכול לשמש כדי לקבוע את טיטר וירוס, ובכך להחליף מדידות מסורתיות עם מרווחי ביטחון נמוכים יותר והימנעות בדיקות נקודות קצה אינטנסיביות עבודה.

קיים מתאם ליניארי בין תוצאות טיטרציה המתקבלות על ידי מדידה של עכבה בתא ועל ידי בדיקת פלאק קלאסית או שיטות TCID50. לכן, נתונים המתקבלים בשיטת טיטרציה מבוססת עכבה ניתן לשנות בקלות ערכי TCID50 או pfu על ידי יצירת עקומה סטנדרטית עם דילול סדרתי של הנגיף13,14,14,15,16,17. זיהוי, כימות ויעילות של נטרול נוגדנים הנמצאים בדגימות סרום ניתן להשיג גם באמצעות גישה ניסיונית זו18,19. לאחרונה, בדיקות תאיות מבוססות עכבה שימשו כדי לסנן ולהעריך תרכובות אנטי ויראליות נגד Equid alphaherpesviruses20.

טכנולוגיה זו שימשה להערכת ההתמדה של IAVs במים מלוחים בטמפרטורות שונות וכדי לזהות מוטציות hemagglutinin של IAV להגדיל או להקטין את ההתמדה IAV בסביבה21. סינון כזה ידרוש עבודה נרחבת אם משתמשים בשיטות טיטרציה מסורתיות. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה זו עבור כל וירוס בעל השפעה על מורפולוגיה של תאים, מספר תא ועוצמת ההתקשרות של פני התא. זה יכול לשמש גם כדי לפקח על התמדה בתנאים סביבתיים שונים (כלומר, באוויר, במים, או על משטחים).

הפרוטוקול המתואר כאן מיישם את הישרדות IAV במים כדוגמה. נגיפי שפעת אנושית נחשפים לפרמטרים פיזיקוכימיים שונים בתקופות ממושכות. מי מלוחים (35 גרם / L NaCl) בטמפרטורה של 35 °C (35 °F) נבחרו כמודל הסביבתי בהתבסס על תוצאות קודמות9. הדבקה שיורית של וירוסים חשופים מכמתת בנקודות זמן שונות באמצעות זיהום תאים. תאי MDCK, סוג תא הייחוס להגברת IAV, נזרעים על 16 לוחות מיקרוטיטר היטב מצופים בחיישני מיקרואלקטרודים ומודבקים בווירוסים חשופים 24 שעות מאוחר יותר. עכבה תאית נמדדת כל 15 דקות ומתבטאת כיחידה שרירותית הנקראת אינדקס התא (CI). השפעות ציטוטפתיות הנגרמות על ידי וירוס שפעת, שקצב הופעתו תלוי ישירות במספר החלקיקים הנגיפיים הזיהומיים המחוסנים לתרבית התאים, מוביל לירידה ב- CI, אשר לאחר מכן מכמת כערך CIT50 . ערך זה מתאים לזמן הדרוש כדי למדוד הפחתה של 50% מה- CI הראשוני (כלומר, לפני הוספת וירוס). ערכי CIT50 המחושב עבור מספר פעמים חשיפה סביבתית מאפשרים ניכוי של שיפוע ההשבתה של וירוס לאחר רגרסיה ליניארית של ערכי CIT50 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לטפל בכל וירוסי שפעת על פי דרישות רמת בטיחות ביולוגית מתאימה (BSL-2 ומעלה בהתאם לסוג המשנה). השתמש בזני IAV עם היסטוריית מעבר נמוכה (פחות מפי 5 בתאי MDCK) כדי להבטיח שונות נמוכה בין ניסויים.

1. הכנת ריאגנטים וחומרי התחלה

  1. הכנת תאי MDCK ומדיום תרבית תאים סטריליים
    1. טפחו תאי כליות כלבים של מאדין-דארבי (MDCK) במדיום של הנשר (MEM) שעבר שעברי (FCS) עם 10% חום עם סרום עגל עוברי מומת (FCS) ואנטיביוטיקה (100 יחידות/מ"ל פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין).
    2. לאחר הפשרה, מעבר תאי MDCK לפחות 2x לפני הדבקתם כדי להבטיח התאוששות מלאה (אבל פחות מ 30 קטעים כדי למנוע כל סחיפה פנוטיפים התא).
    3. זרע 75 cm2 רקמות תרבית בקבוקונים המכילים 30 מ"ל של סטרילי 1x MEM עם 7.5 x 106 תאי MDCK ודגרה ב 37 °C (5° C) בחממה לחה 5% CO2 .
  2. הכנת ציוד ניטור עכבה
    1. מניחים את המכשיר באינקובטור בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס ומאפשרים לו להתחמם לפחות 2 שעות.
    2. חבר אותו ליחידת הבקרה הממוקמת מחוץ לאינקובטור.
    3. המשך להליכי ניקוי כפי שהומלץ על ידי היצרן לפני תחילת שארית הניסוי.
  3. ייצור מניות IAV בתאי MDCK
    1. כדי להפיץ ולהגביר וירוסי H1N1, זרע 7.5 x 106 תאי MDCK על שני צלוחיות תרבית רקמות 75 cm2 ודגר במשך 24 שעות ב 37 °C (37 °F) כדי להגיע 90%-100% מפגש.
    2. Decant מדיום תרבית התא מן monolayer התא ב 75 ס"מ2 בקבוקונים. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של סטרילי 1x PBS.
    3. הסר PBS והוסף 5 מ"ל של 1x PBS כדי לשטוף את התאים שוב.
    4. סמן בקבוקון אחד כפקד והסר PBS לפני הוספת 15 מ"ל של מדיית הפצת וירוסים (1x MEM עם 0% FCS) בזהירות על monolayer. דגירה בקבוקון זה בחממה מתוחזקת ב 35 °C (5 ° F) עם 5% CO2. השתמש בו להשוואה לאחר 3 ימים של התפשטות.
    5. להפשיר בקבוקון אחד של מניית IAV ב RT. לדלל את הנגיף לריכוז המתאים בצינור 1.5 מ"ל המכיל מדיה להפצת וירוס (1x MEM עם 0% FCS).
    6. הסר 1x PBS מן הבקבוקון 75 cm2 ולהדביק תאי MDCK בריבוי של זיהום (MOI) של 1 x 10-3 או 1 x 10-4 פלאק להרכיב יחידות לכל תא (pfu / תא) על ידי הוספת 1 מ"ל של הנגיף המדולל למונולייר התא.
    7. וירוס adsorb לתאי MDCK במשך 45 דקות ב RT על ידי ערבוב הבקבוק באופן קבוע כל 15 דקות.
    8. הסר בעדינות את האינקולום והוסף 15 מ"ל של מדיית התפשטות וירוסים לכל בקבוקון המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל TPCK-טריפסין (טריפסין / L-1-tosylamide-2-פנילתיל כלורמתיל קטון), כדי לבקע את ההמגלוטינין הנגיפי HA0 לתוך יחידות המשנה HA1 ו- HA2 (אירוע הנדרש עבור היתוך HA עם הקרום האנדוסומלי ושחרור הגנום הנגיפי)22.
    9. לדגור על הבקבוקונים ב 35 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 לפחות 3 ימים כדי לשכפל את הנגיף.
    10. התבונן בתאי MDCK תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40 וחפש אפקטים ציטופתיים (CPE) על התאים (על ידי השוואה לבקבוק בקרת התא). אם CPE אינו שלם (כלומר, כ -80% מהתאים מנותקים מהמצע), החזירו את הבקבוקונים לאינקובטור למשך 24 שעות נוספות.
    11. כאשר CPE הושלם, decant תרבית התא supernatant וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות כדי גלולה את הפסולת התאית.
    12. מעבירים את הסופר-נרטיב המובהק לצינור 15 מ"ל ווירוסי צאצאי aliquot לבקבוקונים קריוגניים סטריליים לשימוש חד פעמי. מיד למקם את cryotubes ב -80 °C (80 °F) כדי להקפיא ולמלאי וירוסים.

2. קביעת כמות תאים מתאימה להדבקת תאים

הערה: במהלך כל הניסויים, שמור את הלוחות על משטחים לא אלקטרוסטטיים בכל עת, כגון עטיפות הנייר מהאריזה. בצע את סעיף 2 להלן כדי לקבוע את הריכוז המתאים ביותר של תאים להיות זרעים בלוח microtiter אלקטרוני (תוכנן כמו E-צלחת).

  1. הכינו תאי MDCK בבקבוקונים בגודל 75 ס"מ2 כדי להשיג תאים מפוצלים טריים (כ-80% מפגש) 24 שעות לפני הניסוי.
  2. לשטוף תאים עם 5 מ"ל של 1x PBS ולנתק אותם על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA.
  3. הוסיפו 7 מ"ל של תרבית תאים טריים בינוניים וספרו תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי עם כתמים כחולים טריפאן.
  4. התאם את ריכוז התא ל-400,000 תאים/מ"ל עם מדיית תרבית תאים. בצע דילול סדרתי כפול בצינורות נוספים כדי לקבל צפיפות תאים של 200,000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; ו-6,250 תאים/מ"ל. התאם את טווח הדילול של התאים בהתאם לסוג התא והתנהגות הצמיחה שלהם.
  5. השאר את צלחת E (טבלת חומרים) ב RT במשך מספר דקות ולהוסיף 100 μL של מדיה תרבית התא לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. אל תיגע באלקטרודות של הצלחת האלקטרונית.
  6. פתחו את העריסות והכניסו את הקצה הקדמי של הצלחת לכיס העריסה של מכשיר מדידת העכבה (שולחן החומרים). סגור את דלת האינקובטור.
  7. פתח את התוכנה.
    1. בתיבה "הגדרת תבנית ניסוי המהווה ברירת מחדל", בחר את העריסה שנבחרה ולחץ פעמיים על הדף העליון ולאחר מכן הזן את שם הניסוי. לחץ על "פריסה" והזן את המידע לדוגמה הדרוש עבור כל באר שנבחרה של הצלחת; לאחר מכן, לחץ על "החל" בסיום. לחץ על "תזמון" | "צעדים" | "הוסף צעד". התוכנה מוסיפה באופן אוטומטי שלב של 1 s כדי למדוד את עכבה הרקע (CI).
    2. לחץ על "התחל/המשך" בכרטיסייה "בצע". לחץ על "עלילה", להוסיף את כל הדגימות על ידי בחירת הבארות המתאימות, ולהבטיח CI הוא בין -0.1 ו 0.1 לפני שתמשיך לשלב הבא.
  8. הסר את הצלחת מהעריסה.
  9. הוסף 100 μL של כל השעיית תא משלב 2.4 כפול לבארות המתאימות ו 100 μL של מדיה סלולרית בבארות המשמשות פקדים. השאירו את צלחת E במכסה המנוע זרימה למינאר במשך 30 דקות ב RT כדי לאפשר חלוקה אחידה של התאים בתחתית הבארות.
  10. הכנס את הצלחת האלקטרונית לכיס העריסה. לחץ על "תזמון" | "הוסף שלב" בתוכנה והזן ערכים לניטור תאים כל 30 דקות במשך 200 חזרות. לאחר מכן, בחר "התחל/המשך".
  11. בדוק והתווה את נתוני CI על ידי לחיצה על כפתור "התווה" בתוכנה. בחר את ריכוז התאים שנמצאים ממש לפני השלב הנייח 24 שעות לאחר זריעה על הצלחת, על מנת להשיג תאים שעדיין נמצאים בשלב גידול במהלך זיהום ויראלי. שלב נייח הוא הגיע כאשר CI הוא במקסימום שלה.

3. מתאם בין ערכי CIT50 לבין ריבוי הזיהום

  1. הוסף 100 μL של סטרילי 1x MEM תרבות בינוני בכל באר של צלחת E. הכנס צלחת אלקטרונית לכיס העריסה של המכשיר בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס. מדוד את הרקע כמתואר בשלב 2.7.
  2. הסר את הצלחת האלקטרונית מהעריסה.
  3. זרע 3 x 104 של תאי MDCK מפוצלים טריים על כל באר של צלחת microtiter אלקטרונית ולגדל אותם במשך 24 שעות ב 35 °C (35 °F) עם 5% CO2 כך שהם נמצאים בשלב שכפול במהלך זיהום IAV.
  4. להדביק תאי MDCK עם דילולים שונים פי 10 של ידוע 6 log10 TCID50 / mL titer של וירוס H1N1, באמצעות צינורות הפוכים לשחזור על ידי ביצוע השלבים הבאים:
    1. לשטוף את תאי MDCK 2x עם 100 μL של MEM ללא FCS (מדיה להפצת וירוסים). שים לב להסרת כל המדיה לאחר הכביסה השנייה כדי למנוע דילול נוסף של האינוקלום.
    2. הוסף 100 μL של השעיה ויראלית בכל באר באמצעות פיפטה ערוץ יחיד. כדי למנוע זיהום, להמשיך על ידי התחלה משמאל לימין ולאחר מכן מלמעלה למטה בצלחת, תוך כיסוי הבארות הנותרות עם המכסה.
    3. הכנס את הצלחת לכיס העריסה של המכשיר ב 35 °C (50 °F). הייה עדין כדי למנוע תנועות פתאומיות שעלולות להוביל לזיהומים.
    4. התחל לפקח על עכבה תא כל 15 דקות במהלך לפחות 100 שעות כמתואר בשלב 2.10.
    5. לאחר שני מחזורי המדידות (כלומר, 30 דקות), השהה את המנגנון על ידי לחיצה על "השהה" בכרטיסייה "ביצוע" והסר את הצלחת האלקטרונית מהעריסה.
    6. הוסף 1 מיקרוגרם / מ"ל TPCK-טריפסין למדיית התפשטות הנגיף כדי לבקע את המגלוטין הנגיפי.
    7. הוסף 100 μL של מדיה להפצת וירוס המכיל TPCK-טריפסין לתוך כל באר ולהכניס את E-צלחת לכיס העריסה.
    8. לחץ על "התחלה/המשך" בכרטיסיה "ביצוע".
      הערה: אל תשכח ליצור פקד שלילי המתאים לתאים נגועים בחיקוי על ידי החלפת ההשעיה הנגיפית במדיה של הפצת וירוסים.

4. קינטיקה הישרדותית IAV

  1. לחשוף IAV למים מזוקקים מלוחים ב 35 °C (50 °F) ולבדוק את הזיהום שלהם לאורך זמן על ידי מדידת ירידה בעכבה התא.
    1. הכן מים מזוקקים מלוחים על ידי הוספת NaCl לריכוז סופי של 35 גרם / ליטר במים מזוקקים. מוסיפים 900 μL של מים מלוחים לתוך 2 מ"ל cryotubes.
    2. הוסף 100 μL של מלאי ויראלי במים מלוחים ומניחים את cryotubes בחממה (35 °C (35 °C (5% CO2) עבור 1 h, 24 שעות, או 48 שעות.
    3. זרע 100 μL (המכיל 3 x 104) של תאי MDCK מפוצלים טריים על צלחת microtiter 16 היטב לגדול במשך 24 שעות ב 37 °C (37 °C ( (5% CO2).
    4. להדביק תאים עם 100 μL של וירוסים חשופים (בעבר מדולל 10x במדיה תרבותית) באמצעות שיטת צנרת הפוכה לשחזור על ידי חזרה על סעיף 3.4.
  2. ניטור עכבה תא כל 15 דקות לפחות 100 שעות.

5. הערכה של אובדן זיהום

  1. קביעת ערכי CIT50 לכימות CI להקטין עקב השפעות ציטופתיות הנגרמות על ידי וירוס עם הערך CIT50 .
    1. לחץ על "התוויה" והוסף את כל הדוגמאות על-ידי לחיצה על "הוסף הכל". יצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על "ייצוא פרטי ניסוי". שקול CI ראשוני כערך עכבה תאית נמדד 5 שעות לאחר זיהום התא על ידי וירוסים חשופים (כלומר, 24 שעות לאחר זריעת תאי MDCK על צלחת E microtiter).
    2. חשב ערך CIT50 המתאים לזמן הדרוש כדי למדוד ירידה של 50% מה- CI הראשוני. כדי לחשב את ערך CIT50 , שים לב לערך CI ב- 5 כ"ס עבור כל דגימה. לאחר מכן, מצא את נקודת הזמן שבה ערך CI שווה למחצית מערך CI ב- 5 hpi באמצעות האינדקס והתאם פונקציות בגיליון האלקטרוני.
  2. חישוב מדרון ההשבתה הממוצע
    1. קבעו את ערכי CIT50 עבור כל השעיה ויראלית חשופה, בזמני חשיפה שונים (בימים).
    2. חשב שיפוע רגרסיה ליניארי מערכים מותווים של CIT50, המכונה שיפוע ההשבתה ובא לידי ביטוי ב- CIT50.day-1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נתונים גולמיים המתקבלים לאחר 120 שעות עם ריכוזים שונים של תאי MDCK, מ-15,000 ל-120,000 תאים לבאר, מוצגים באיור 1. לאחר 24 שעות, מדדי CI מראים כי תאים בבארות זרעו עם 30,000 תאים היו עדיין בשלב המעריכי של צמיחה, וריכוז התא הזה שימש לניסויים נוספים. איור 2 ממחיש את המתאם הליניארי בין ערכי CIT50 לבין ריבוי הזיהום הראשוני. תאי MDCK הם תרבית במשך 24 שעות, ולאחר מכן נגועים A / פריז / 2590 / 2009 H1N1 זן ויראלי בריבוי שונה של זיהום. CI הראשוני נמדד 5 שעות לאח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

RTCA היא טכנולוגיה מבוססת עכבה המשמשת יותר ויותר לניטור בזמן אמת של תכונות התא, כגון דבקות בתאים, התפשטות, הגירה וציטוטוקסיות. במחקר זה, היכולת של טכנולוגיה זו להעריך את הישרדות IAV מחוץ למארח מודגמת על ידי מדידת מדרון אי-השבתת וירוסים. טכניקות קפדניות כגון TCID50 ובדיקות פלאק מוחלפות על ידי הערכה אובייקטיבית בזמן אמת של הכדאיות של התא, ובכך לשקף השפעות ציטופתיות הנגרמות על ידי הנגיף. בדומה ליחידת יצירת הפלאק TCID50 או הפלאק (pfu), גם ה-CIT50 מתואמים באופן ליניארי עם ריבוי הזיהום (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% TrypsinThermoFisher25200056
75 ס"מ 2 בקבוק תרבית רקמהFalcon430641U
E-Plate 16 (6 צלחות)ACEA Biosciences, Inc5469830001צלחות אלקטרוניות זמינות באריזות שונות
FCSLife technologies (gibco)10270-106
MEM 1XLife technologies (gibco)31095029
PBS 1XLife technologies (gibco)14040091
פניצילין-סטרפטומיציןטכנולוגיות חיים (gibco)11548876
TPCK-TrypsinWorthington
ניתוח תאים בזמן אמת S16ACEA Biosciences, Inc380601310מכשירי xCELLigence RTCA S16 זמינים בפורמטים שונים (16 בארות, 96 בארות, יחיד או רב-לוחות)
LS003740-xCELLigence מכשיר

מקורות

  1. Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
  2. Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
  3. Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
  4. Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
  5. Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
  6. Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
  7. Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
  8. Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
  9. Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043(2011).
  10. Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
  11. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
  12. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
  13. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
  14. Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335(2018).
  15. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
  18. Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965(2012).
  19. Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
  20. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  21. Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496(2018).
  22. Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AMDCK

מאמרים קשורים