מאמר שיטה

מערכת גנוטוביוטית לחקר מכלול המיקרוביאום בפילולספירה ובתסיסה הצמחית

DOI:

10.3791/61149

⸱

3 ביוני 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Tufts University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה של גידול כרוב הנבט ללא חיידקים פותחה המאפשרת לחוקרים להעריך כיצד מינים בודדים או קהילות מיקרוביאלית מינים אינטראקציה על משטחים עלה כרוב. תמצית ירקות סטרילית מוצגת גם אשר ניתן להשתמש כדי למדוד משמרות בקומפוזיציה קהילתית במהלך תסיסה הירקות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The phyיוסה, החלק הקרקע מעל הצמח שיכול להיות הקולוניה על ידי חיידקים, היא מערכת מודל שימושי כדי לזהות תהליכים של האסיפה הקהילה חיידקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת לחקר הדינמיקה הקהילתית מיקרוביאלית של צמחי כרוב נאפה. הוא מתאר כיצד לצמוח צמחים ללא חיידקים בצינורות הבדיקה עם חימר calcined המצע הציר התזונתי. החיסונים של צמחים ללא חיידקים עם תרבויות מסוימות של חיידקים מספקים הזדמנויות למדוד צמיחה חיידקים ודינמיקה קהילתית ב phyיוסה. באמצעות תמצית ירקות סטרילית המיוצרים ממשמרות כרובים בקהילות מיקרוביאלית המתרחשות במהלך החימוץ ניתן גם להעריך. מערכת זו פשוטה יחסית וזולה להקים במעבדה וניתן להשתמש בה לטיפול בשאלות אקולוגיות מרכזיות בהרכבה קהילתית מיקרוביאלית. הוא גם מספק הזדמנויות כדי להבין כיצד הרכב הקהילה phyיוסה יכול להשפיע על מגוון חיידקים ואיכות של fermentations ירקות. גישה זו לפיתוח קהילות הגנוטוביוטיקה כרוב יכול להיות מיושם על מינים אחרים הצמח פראי וחקלאי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגוון מיקרוביאלית של ה phyיוסה ממלא תפקיד חשוב בשמירה על בריאות הצמח והוא יכול גם להשפיע על היכולת של צמחים לעמוד בלחץ סביבתי1,2,3,4,5. בתורו, בריאות היבול משפיע ישירות על בטיחות המזון ואיכות6,7. צמחים לשחק תפקיד בתפקוד המערכת האקולוגית ואת microbiomes המשויכים שלהם הן משפיעות על היכולת של צמחים לבצע פעילויות אלה, כמו גם השפעה ישירה על הסביבה עצמה8. בעוד מדענים החלו לפענח את הפונקציה ואת ההרכב של phyיוסה, התהליכים האקולוגיים המשפיעים על האסיפה הקהילתית של הפילוספירה לא מובנים לגמרי9,10. מיקרובידום phyיוסה היא מערכת ניסיונית מעולה לחקר האקולוגיה של microbiome11. קהילות אלה פשוטות יחסית ורבים מחברי הקהילה יכולים לגדול בתקשורת מעבדה סטנדרטית10,12,13.

ירקות תוססים הם מערכת אחת שבה למבנה הקהילתי של הפיללספירה יש השלכות חשובות. הן בכרוב החמוץ ובקימחי, החיידקים המתרחשים באופן טבעי על עלי הירק (מינים של כרוב כרוב ) משמש כרשת החימוץ לתסיסה14,15. חיידקים חומצה לקטית (LAB) נחשבים חברים בכל מקום של microbiomes ירקות, אולם הם יכולים להיות בשפע נמוך ב phyיוסה כדור16. בחירה מוצקה חזקה במהלך התסיסה כוננים משמרת בקומפוזיציה של הקהילה מיקרוביאלית המאפשרת לחיידקים חומצת חלב להגדיל בשפע. כמו המעבדה לצמוח, הם מייצרים חומצה לקטית אשר יוצר את הסביבה חומצי של מוצרי ירקות תוססים17. הקשר בין phyיוסה ואת התסיסה מספק הזדמנות להשתמש בירקות כמודל כדי להבין כיצד microbiomes בנויים.

פיתחנו שיטות לגדל חיידקים בעלי כרוב נאפה ולאפשר להם לחסן אותם עם קהילות מחיידקים ספציפיים באמצעות בקבוקי ריסוס. זוהי שיטה זולה ואמינה של שווה לדבר על כרוב עם חיידקים בודדים או קהילות מעורבות. תמצית ירקות סטרילית (SVE) פותחה גם משלושה סוגים שונים של כרוב/זנים: כרוב אדום וירוק(כרוב)וכרוב נאפה (ב. ראפא). תוספת המלח לאלה משכפל את סביבת התסיסה ומאפשרת מחקרים ניסיוניים בהיקפים קטנים ובקצב גבוה יחסית של הרכבה מיקרוביזום תסיסה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הרכבה קהילתית מיקרוביאלית בתחום הפילולספירה, וכיצד ניתן לקשר בין הדינמיקה הקהילתית של מיקרוביאלית להצלחת התסיסה הצמחית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול כרובים ללא חיידקים

  1. הכנת ציוד לגידול כרובים ללא חיידקים
    1. ניקוי החימר המכונה להסרת חלקיקי אבק משובחים
      1. לשטוף חימר המכונה (טבלת חומרים) לפחות 3x עם מים ברז; רוקן את המים.
        התראה: פלסטלינה מייצרת אבק משובח מאוד ומומלץ לחבוש מסכת הגנה (שולחן חומרים) בעת הכביסה.
      2. התפשטות חימר calcined החוצה כשכבה דקה (~ 4 ס מ) לתוך מגש החיטוי והחיטוי על מחזור יבש (121 מעלות צלזיוס עבור 20 דקות ו 20 דקות ייבוש זמן) כדי לחטא.
      3. הניחו לחימר להתייבש במלואו לפני השימוש על-ידי הפצת המגשים והצבת בחממה חמה (30-37 ° c) לפחות שבוע. מערבבים כדי לערבב כל 3 ימים כדי לייבש באופן מלא את חימר calcined כך הוא יספוג כמות אפילו של מורראשיג ו Skoog (MS) ציר מזינים (סעיף 1.2).
        הערה: ייבוש גם עוזר לשמור על נפח של חימר calcined גם כאשר הוא שקול לתוך צינורות. ייבוש באמצעים אחרים, כגון תנור ייבוש, יהיה גם מתאים.
    2. ניקוי כלי הזכוכית לגידול כרובים ללא חיידקים
      1. לנקות ולעקר ביסודיות את צינורות הזכוכית (טבלת חומרים) בין כל שימוש. להשרות צינורות עבור 30 דקות ב 30% תמיסת אקונומיקה ולשטוף היטב עם מי ברז לפני ניקוי בשטף חומצה על הגדרת בדיקות. חומצה-לשטוף כובעי בדיקה דוכיוון (טבלת חומרים) בין שימושים.
    3. זרעי כרוב מחוטא
      1. מקום עד 100 כרוב נאפה (ב. ראפה var pekinensis) זרעים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
        הערה: הוספת יותר מ 100 זרעים לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד או שינוי גודל הצינור עשוי להשפיע על שיעורי נביטה של הזרעים עקב חוסר הסרת מעיל זרעים.
      2. הוסף 1 מ ל של 70% אתנול לזרעים ומערבולת עבור 5 דקות. להיפטר אתנול באמצעות פיפטה.
      3. הוסף 1 מ ל של 50% אקונומיקה ומערבולת עבור 5 דקות. למחוק את פתרון אקונומיקה באמצעות פיפטה.
      4. הוסיפו 1 מ ל של מים ומערבולת אוטומטיים במשך 5 דקות. להשליך את המים מוכי באמצעות פיפטה.
      5. חזור על השלב 1.1.3.4 3x לשטוף את כל אקונומיקה. משרים את הזרעים במים מעוקרים ועקרים עבור 2-8 שעות לפני שתילת לריכוך מעיל הזרע.
  2. גידול כרובים ללא חיידקים
    הערה: כרוב נאפה (נולד ב-ראקיאר פקינאנסיס) מגודלים בצינורות זכוכית (15 ס"מ x 2.5 ס מ) המכילים חימר שנספג ב מורראשיג ו Skoog (MS) מרק מזינים (איור 1).
    1. שוקל 10 גר' חימר calcined נקי לתוך צינור זכוכית נקייה (15 ס"מ x 2.5 ס מ).
    2. הכינו ציר תזונתי MS על ידי המסת 4.4 g של MS מדיום ב 1 L של מים מנולים. הוסף ציר מזינים MS (~ 9 מ"ל) על כל צינור זכוכית לכסות את חימר calcined באמצעות פיפטה.
      הערה: עומד נוזל בצינור ימנע את הזרע מן המונטינג כך שהוא עשוי להיות benecessary כדי להוסיף מעט פחות MS ציר לצינורות כמה.
    3. שפופרות זכוכית כיפה באופן רופף עם 22 מ"מ כמוסות מבחנה בשתי כיוון וכובעים (121 ° c עבור 60 דקות). בעת הסרתם מן החיטוי, לדחוף כובעים על צינורות זכוכית כדי לאטום אותם. צינורות מגניב לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    4. בעדינות למקם אחד זרע כרוב סטרילי למרכז של כל צינור באמצעות סטרילי, בתוספת ארוכה (25.4 ס מ) מלקחיים. מניחים את הצינורות במגש של 7 כיוון ולאחר מכן מניחים תחת מתלה קל (ספקטרום מלא T5 נורות פלורסנט או הגדרת תאורה אחרת לצמיחה צמח) עם מחזור 16 h האור ב 24 ° c.
      הערה: זרעים לנבוט לילה ולפתח עלה האמיתי הראשון שלהם אחרי 5 ימים. עלה אמיתי הוא העלה כלי הדם הראשון לאחר שנוצרו הקוטונים. יש לו קצה מקומט יותר וברוב הכרוב מכוסה trichomes.
  3. בדיקת עקרות של כרובים ללא חיידקים
    הערה: כדי לבדוק אם הכרובים הם ללא חיידקים, בחרו מספר כרוב (5 עד 10) מכל אחת מהאצווה והלוח כדי לקבוע אם קיימים מושבות מסוימות.
    1. בעדינות להסיר את הכרוב מצינורות זכוכית על ידי מרתק את הבסיס של הצמח עם מלקחיים מעוקר ומושך אותו החוצה. לפני הסרת כרוב במלואו מן הצינור, לחתוך בזהירות את השורשים באמצעות מספריים לחיתוך מעוקר. לדחוס את הכרוב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
      הערה: כרובים גדולים יותר עשויים לדרוש הסרת אחד או שניים העלים הגדולים בעוד הכרוב הוא עדיין בצינור כדי להקל על הפיכת כרוב לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. אלה עלים גדולים ניתן להוסיף לצינור 1.5 mL לאחר שאר הכרוב הונחו לתוך הצינור אם הכרוב כולו נדרש.
    2. הוסף 400 μL של תמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS) לכל שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL. בעזרת מיקרופטסל סטרילי, המגון משתמש בכרוב על ידי לימון 30x.
    3. לוחית 100 μL של כרוב המגון אכלו על צלחות אגר כדי לקבוע אם יש מזהמים כלשהם במדגם. רוב החיידקים שנמצאו ב-phyיוסה יגדלו על צלחות סויה טריטיות (TS) אגר. השתמש בטיפים לשימוש נרחב בצינורות כאשר כרוב הציפוי המגון כרוב כרוב לאכול עבה והוא יכול לסתום את הטיפים בצנרת רגילה.

2. המשך מענה לפיטוספירה עם פתרונות מיקרוביאלית

  1. הכנת גליצרול למלאי החיסונים
    הערה: טבלה 1 מפרטת את החיידקים שניתן להשתמש בהם בשלב זה. ניתן להשתמש כאן גם בבודד phyיוסה אחרים.
    1. בצפיפות החוצה מושבות בודדות מתוך פס טרי, אל שתיים/שלוש צלחות חדשות של אותו מדיה כדי לקבל הרבה מושבות.
    2. בואו לגדול הפסים עבור 2-5 ימים לאחר מכן לגרד מושבות מכל הצלחות לתוך שפופרת של 15 מ ל המכיל 15 מ ל של 15% גליצרול, ומערבולת לערבב ביסודיות.
    3. העברת סדרת מחלקים של 1 מ ל של מלאי מעורב היטב גליצרול לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולאחסן מניות גליצרול ב-80 ° צ' עד השימוש. שמרו את הנותרים 14 מ ל של מלאי גליצרול ב-80 ° צ' כמויות גדולות יחסית של פתרון חיסונים נדרשים כאשר מנווים כרובים.
    4. שבוע לפני השימוש, להפשיר את הצינור 1.5 mL המכיל 1 מ ל של גליצרול מלאי (משלב 2.1.3) על קרח, לדלל, ואת הצלחת בכמה מדלל שונים (g., 10-4, 10-5, ו 10-6) כדי לקבוע את הריכוז (יחידת המושבה ויוצרים [cfu] לכל μ
  2. בקבוקי ספריי לחיטוי
    1. לפרק את הכתום סביב בקבוקי משאבת בוסטון (59 mL) ולהשרות את כל הרכיבים (משאבה, צינור, כובע ובקבוק) ב 30% תמיסת אקונומיקה עבור 30 דקות במיכל פלסטיק גדול עם מכסה הולם היטב.
    2. לאחר הטבילה, שופכים בזהירות את כל האקונומיקה מן המיכל על ידי הרמת רק פינה אחת של המכסה של המיכל.
    3. שטפו את הבקבוקים על ידי מילוי מיכל הפלסטיק במים מפוהים באופן אוטומטי (~ 1 L תלוי בגודל המיכל) ובזהירות לשפוך מים מפוהים, שוב על ידי הרמת המכסה בפינה אחת.
    4. לחטא את הקבינט אבטחה טיחות על ידי ריסוס עם 70% אתנול פתרון והפעלת אור UV עבור 30 דקות.
      הערה: המשיכו בעבודה זו בארון הביובטיל, כך שאין כל סיכון לזיהום מחיידקים של הבקבוקים כאשר הם יבשים.
    5. הסירו בקבוקים ממיכל הפלסטיק הגדול ומלאו כל בקבוק במים מפוהים באמצעות פיפטה. לכנס את המשאבות ולמקם אחד בכל בקבוק. משאבה את המים הדימיים דרך כל בקבוק (10 תרסיסים לכל בקבוק) כדי להסיר אקונומיקה מרכיב המשאבה של הבקבוק.
    6. חזור על השלב 2.2.5 כדי לוודא שכל האקונומיקה יוסר מבקבוקי הזכוכית.
    7. בדוק אם בקבוקים סטרילי על ידי הצבת מספר על כל בקבוק (דבק קלטת המעבדה בצד של הבקבוק כאשר הוא יבש לגמרי) ולאחר מכן להוסיף 10 מ ל של 1x PBS לכל הבקבוקים ומשאבה 3 תרסיסים על צלחת TS אגר. לאחר הריסוס, מודסת את הצלחות לשבוע אחד בטמפרטורת החדר. אם מושבות כלשהן לגדול על צלחת זה מראה כי הבקבוק המתאים לא סטרילי ולא צריך לשמש ניסויים.
    8. לפני שאתם מאחסנים את הבקבוקים הסטריליים, מסירים את כל ה-PBS ומאפשרים לבקבוקים להתייבש ביסודיות בארונית הביובטיחות. אחסן בקבוקים סטריליים במיכל פלסטיק סטרילי (בדרך כלל המיכל המשמש להלבנת הבקבוקים) עד השימוש.
  3. הכנת החיידקים וריסוס כרובים ללא חיידקים
    התראה: יש לבצע את כל השלבים בארונית ביולוגית, משום שהריסוס מאפשר את פתרונות החיידקים שיכולים לזהם את משטחי העבודה או להוות סיכון בריאותי אם יבוצע על ספסל מעבדה.
    הערה: כרובים יוצרים עלים אמיתיים לאחר 5 ימים, לכן רצוי להמתין שבוע לאחר שתילת הכרוב לפני שהוא מדבר עם פתרונות מיקרוביאלית. כאשר הצינורות חתומים, אין צורך להשקות את הכרובים. ניסויים מבוצעים ביותר תוך חודש של נטיעת, כמו צינורות קטנים להגביל את צמיחת הכרוב.
    1. הפשרת מניות גליצרול על קרח ולדלל ב-1x PBS אל הריכוז הרצוי החיסון (הריכוז נקבע על ידי התפחסותו וציפוי של 1 mL בשלב 2.1.4).
      הערה: ניתן להשתמש במגוון רמות חיסון שונות, אך מבודד מסוג phyיוסה יכול לצמוח מ-104 עד 108 מטרים של כרוב בתוך 10 ימים.
    2. הוסף 10 מ ל של מלאי גליצרול מדולל לבקבוק משאבת סטרילי ומשאבה 5 תרסיסים לתוך הגביע הגדול אוסף פסולת כדי להסיר את כל PBS שיורית מרכיב משאבת בקבוק.
    3. הסר את המכסה מצינור כרוב, להטות את הכרוב כלפי בקבוק ספריי, ולרסס כל כרוב עם 3 משאבות של פתרון החיסונים, אשר מספק ~ 600 μL של האינת.
    4. לאחר שהוא מדבר, הקציר מערכת משנה של הכרובים כדי להעריך את הריכוז של קלט בפועל. להסיר את הכרוב מצינור עם מלקחיים מעוקר. לחתוך את השורשים עם מספריים לחיתוך סטרילי ולאחר מכן בזהירות למקם את הכרוב בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי מראש 1.5 mL. להקליט את המשקל של כרוב לחישובים עתידיים אם הדפוס/g של כרוב נדרש עבור חישובים.
    5. הוסף 400 μL של הערוץ 1x כדי כל שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL המכילה כרוב ולהשתמש micrope, סטרילי כדי המגון לסדר את הכרוב לתוך ה-PBS 1x ידי שיוף זה 30x.
    6. לדלל כרוב המגון (אם נדרש) ולוחית את תערובת כרוב שורק. השתמש בטיפים מלאים ללטף את הכרוב, כי זה יהיה עבה ומלא של חתיכות רקמה צמח.

3. הכנת תמצית ירקות סטרילית

הערה: שיטה זו היא גרסה שונה של ייצור מדיה סטרילית כרוב18,19.

  1. . לרכוש כרוב מסופרמרקט במעבדה, להסיר ולמחוק את העלים החיצוני של הכרוב. קוצצים את כל הכרוב הנותרים כדי להתאים לבלנדר המגון כרוב לעיסה קנס, כלומר, כרוב לא יקבל כל טוב יותר עם מיזוג נוסף.
    הערה: כל בלנדר אשר יכול לקצוץ כרוב לעיסת הומוגנית חלקה צריך להיות מתאים לשיטה זו.
  2. שוקלים את כרוב ממוזג לאכול ולהוסיף 2 מ ל של מים מזוקקים לכל גרם של כרוב. מסננים את הכרוב הממוזג באמצעות 2 שכבות של מסנני קפה סל (נייר לא מולבן).
  3. לוותר על הכרוב כרוב לתוך צינורות צנטריפוגה (גודל תלוי בצנטריפוגה). צנטריפוגה את הכרוב כרוב מסוננים ב 20,000 x g עבור 20 דקות עד חלקיקים גדולים ליישב את הפתרון.
    הערה: הכרחי לצנטריפוגה את הכרוב כרוב במשך תקופה ארוכה כאשר חלקיקי כרוב מסננים במהירות את מסנן הפילטר.
  4. באמצעות הצינורות הסרולוגיים, להסיר את הסופרנטאנט מן הפסולת כרוב כרוב מטפלת לא להפריע כרוב הפלטד. אם במטרה ליצור מחדש תנאי תסיסה בהם ריכוזי מלח סטנדרטיים משמשים, להוסיף 2% w/v בשלב זה (כלומר, לפני הסינון עיקור).
  5. מסנן לעקר את תמצית ירקות באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר (500 mL או 1 L) מחובר ואקום. מדבקות לצינורות סטריליים (או שפופרות צנטריפוגה מ-50 mL או 15 מנורות צנטריפוגה) ומקפיאים ב-80 ° צ' עד השימוש.

4. חיסון לתמצית ירקות סטרילית

  1. הפשרת SVE ולוותר 490 μL לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. השתמש בצינורות מספיקים כדי לקבל לפחות חמש משכפל לכל טיפול לכל נקודת זמן, כאשר כל מדידה של נקודת זמן היא הרסנית.
  2. הפשרת מלאי גליצרול של מיקרוביאלית מבודד על הקרח לדלל עם 1x PBS לריכוז הרצוי. הריכוז של חיידקים חומצה לקטית יכול להיות נמוך כמו 5,000 CFU לכל mL של SVE. כדי להשיג ריכוז זה, לדלל את המניות 250 CFUs/μL מכיוון 10 μL ישמש עבור חיסונים של נפח כולל של 500 μL.
  3. מחסן SVE עם 10 μL של בידוד חיידקים מדולל. הפיפטה עולה ויורדת כמה פעמים כדי לערבב ביסודיות. מודטה בטמפרטורה הרצויה (14 ° צלזיוס לטמפרטורת הייצור של קמחי או 24 ° c לתסיסה חמה בכרוב כבוש).
  4. שיעור מדידה של צמיחה של בידוד חיידקים ב SVE על ידי קצירת שכפול צינורות ביום 1, יום 2, יום 4, יום 7 ויום 14.
    הערה: התסיסה ממשיכה במהירות בהתחלה ומאיטה לאורך זמן. לכן, לאחר שנקודות הזמן הראשוניות יותר מעניקה רזולוציה רבה יותר לדינמיקה של אופן ההכנסות של תסיסה.
  5. בכל פעם, לערבב את הטוב SVE מחוסן על ידי מלטף למעלה ולמטה כמה פעמים. סרילית לדלל את SVE מחוסן ב-1x PBS ו צלחת על צלחות אגר. מודאת צלחות אגר עבור 4-7 ימים לפני ספירת המושבות.
    הערה: אדם, רוגוסה, ו שארפ (גברת) אגר יש להשתמש כדי לספור את כל החיידקים חומצה לקטית, peptone שמרים דקסטרוז (YPD) יש להשתמש עבור שמרים, ו-TS אגר עבור החיידקים האחרים רוב מבודד מתוך phyיוסה הספירה.
  6. הקלט את ה-pH של דגימות בכל פעם באמצעות בדיקה מיקרו pH.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע לאחר הציפוי כי הבדיקה pH יעביר תאים בין צינורות/טיפולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיעורי צמיחה של כרובים נאפה
שיטת סירוס הזרעים נבדקה עם מספר כרוב של נאפה (ב. ראפא בר פקינז; משלימה איור 1) ממספר ספקים שונים וכולם גדלו בעקביות עם קצבי צמיחה דומים. עם זאת, בדיקת השיטות עם מינים שונים של הכרוב (ב. ראפא: העליון הסגול לפת; B. oleracea: קהיר היברידי, היברידית ענק טרופי; ב. קאמסטרis: פאק צ'וי טוי choy היברידית; ב. יונמית: ענק אדום חרדל) נתן הצלחה מוגבלת (איור משלים 2). ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נבט ללא חיידקים צמחים כרוב נאפה שימשו כדי ללמוד הגבלת הפיזור של חיידקים חומצה לקטית בתוך הכרוב נאפה phyיוסה17. נבט חינם נאפה כרובים יכול לשמש גם כדי לבדוק את הצמיחה בודדים או זוג ביותר ב phyיוסה (איור 1). שיטות להכנת תמצית ירקות סטרילית נבדקה עבור שלושה זנים שונים של כרוב: אדום, ירוק ו נאפה. כל אחד מאותם משמשים כאמצעי צמיחה אמינים; חיידקים מחוסן לצמוח בעקביות על פני אמצעי התקשורת השונים. זן אחד שיעורי גדילה ב SVE (איור 2) להראות כי המעבדה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו תמכה במענק משרד החקלאות-NIFA: 2017-67013-26520. טרייסי דבנפורט וקלייר פוגן סיפקו תמיכה טכנית ורובי יה וקייסי Cosetta לספק הערות מועילות על גרסאות מוקדמות של כתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהVWR20170-650
15 מ"ל צינורות חרוטייםפלקון352096
מגש מגש 7 כיווניםסיגמא מג'נטהT8654
ענבר עגול בוסטון בקבוקGPS 712OZSPPK12BRהוזמן Amazon.com מספקים שונים
סל קפה מסנני אםאכפתלך(נייר לא מולבן) נרכש מ- Wholefoods
Bleach (ללא כספית)50-010-45של אוסטין
VWR47729-586
חימר מסולסלMVPהוזמן ב-Amazon.com מ-Root Naturally 6 Quart Bags. גודל חלקיקים כ-3-5 מ"מ
בלנדר Cuisinart Cuisinartמעבד מזון Mini-Prep Plus, מספריים לדיסקציה 3 כוסות
Scientific56-81-5
KleenGuard M10Kimberley-Clark64240
מיכל פלסטיק גדולRubbermaidהוזמן על
Amazon.com מדפי אורGardner's Supply39-357נורות פלורסנט T5 בספקטרום מלא
מג'נטה tm כובעים דו-כיוונייםMillipore SigmaC1934
אדם, רוגוסה ושארפפישר סיינטיפיקDF0881-17-5מדיה זו מיועדת למרק ומוסיפים 15 גרם אגר להכנת צלחות
בדיקת מיקרו pHThermo Scientific8220BNWP
MicropestleCarolina215828נקרא גם Pellet Pestle
MS מרק תזונתיMillipore SigmaM5519Murashige and Skoog Basal Medium
NaClSigma AldrichS9888
זרעי כרוב נאפהJohnny's Select Seeds2814GB. rapa var pekinensis (Bilko)
מנת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מפישרFB0875712משמש להכנת צלחות אגר
מאגר פוספט מלוחFisher Scientific50-842-941
Teknova קופסת תרבית רקמות צמחיותSigmaמג'נטה GA-7
פיפטות סרולוגיותVWR89130-900
דיבל סטריליפוריטני10805-018חיטוי לפני השימוש לעיקור
עיקור 0.2 ומיקרו; m filterNalgene974103
אגר סויה טריפטיFisher ScientificDF0370-17-3מדיה זו מיועדת למרק ומוסיפים 15 גרם אגר להכנת צלחות
קצות פיפטה רחביםRainin17007102
שמרים, פפטון ודקסטרוזFisher ScientificDF0428-17-5מדיה זו מתאימה אך ניתן להכין מדיה גם באמצעות שמרים, פפטון ודקסטרוז, להוסיף 15 גרם אגר בעת הכנת צלחות
זכוכית צינורות זכוכית בורוסיליקט 7-389-A מוצרים חינוכיים אמריקאים הוזמנו ב-Amazon.com אתנול VWR 89125-172 מלקחיים Aven 18434 הוזמן ב-Amazon.com גליצרול פישר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135(2019).
  2. Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
  5. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  6. Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
  7. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
  8. Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486(2015).
  9. Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682(2014).
  10. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
  11. Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
  12. Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
  13. Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564(2014).
  14. Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
  15. Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461(2019).
  16. Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
  17. Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269(2019).
  18. Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
  19. Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
  20. Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77(2018).
  21. Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871(2015).
  22. Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
  23. Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
  24. Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134(2018).
  25. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  26. Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MS Broth

מאמרים קשורים