Method Article

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

DOI:

10.3791/61152

⸱

May 10th, 2020

 ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדונוקלאזות שתוכננו בהתאמה אישית, כגון אשכולות מונחי RNA עם חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)-Cas9, מאפשרות עריכה יעילה של הגנום בתאי יונקים. כאן אנו מתארים הליכים מפורטים לעריכת גנום חלקה של הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) לוקוס כדוגמה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. בשילוב של פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטציה של ניקאז CRISPR-Cas9 בברירה גנטית דו-שלבית, אנו מדגימים מיקוד נכון ויעיל של לוקוס HNF4α.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מייצגים מקור בלתי מוגבל של תאים סומטיים למחקר או למרפאה1. מיקוד גנים ב-hPSCs מציע שיטה רבת עוצמה לחקור את תפקוד הגנים במהלך אפיון התא ולהבין מנגנונים של מחלות. למרות שקיימות שיטות יעילות לעריכת גנום, שינוי גנים ב-hPSCs נותר מאתגר מבחינה טכנית. מיקוד גנים סטנדרטי על ידי רקומבינציה הומולוגית ב-hPSCs מתרחש בתדירות נמוכה או אפילו אינו ניתן לגילוי בגנים מסוימים 2, ולכן יש צורך בשבירת גנים דו-גדיליים של דנ"א (DSB) (המכונה עריכת גנים) בתאים אלה 2,3. בנוסף, העברה של hPSCs ושיבוט חד-תאי לאחר מכן אינה יעילה במיוחד, אף על פי שניתן להפחית אפופטוזיס הקשור לתאים בודדים באמצעות שימוש במעכב החלבון קינאז (ROCK)4 הקשור ל-Rho. לבסוף, המוטציות הפוטנציאליות ממוקדות מטרה ומחוצה להן בגן המעניין יכולות גם הן להיות בעייתיות. לפיכך, פרוטוקול אמין הוא חיוני כדי לבצע שינויים גנטיים מותאמים ב- hPSCs.

טכנולוגיית הקריספר מונחית ה-RNA (אשכולות חוזרים פלינדרומיים קצרים בין-מרחביים באופן קבוע) וחלבון 9 הקשור לקריספר (Cas9) היא כיום כלי מבוסס היטב בעריכת גנים. רנ"א קריספר מתועתק (crRNA) ורנ"א מפעיל טרנס (tracrRNA) יוצרים את ה-RNA המנחה היחיד (sgRNA), אשר מורכב עם חלבון Cas9 המאפשר ביקוע ספציפי לגן5. מערכת CRISPR/Cas9 ניתנת לתכנות, על ידי שינוי רצף מדריך של 20 bp של ה-sgRNA, כלומר ניתן לערוך כמעט כל לוקוס הממלא את דרישת המוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר (PAM). עם זאת, ה-Cas9 מהסוג הפראי יכול לסבול כמה אי-התאמות בין רצף ההנחיה שלו לבין מטרת הדנ"א, מה שעלול לגרום להשפעות לא רצויות מחוץ למטרה. כדי לשפר את הספציפיות שלו, מוטציה ניקאז (Cas9n) פותחה. מוטציית Cas9n המכילה D10A או N863A היא בעלת תחום נוקלאז פונקציונלי אחד בלבד וכתוצאה מכך יכולה לנקר דנ"א רק על גדיל אחד. זוג Cas9n מרווח ומכוון כראוי יכול לגרום ביעילות ל- DNA DSB וההשפעות מחוץ למטרה מופחתות באופן דרמטי6. כדי להבטיח שינוי יעיל של Cas9n, הוכח כי שני Cas9n-sgRNA צריכים להיות ממוקמים באופן אידיאלי עם היסט של -4 עד 20 bp ותמיד ליצור תקרהשל 5' 6.

ניתן להשתמש ב-DSB המושרה על ידי Cas9(n)-sgRNA לעריכת גנוםב-hPSCs 7,8. הוא יכול ליצור נוקאאוט גנים באמצעות תיקון הצטרפות קצה לא הומולוגי, או להכניס שינוי גנים באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) אם קיימת תבנית DNA של תורם. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בפלסמיד תורם מבוסס טרנספוזון piggyBac (או וקטור מיקוד) עבור HDR, שבו סמן עמידות לתרופות מוקף בחזרות הפוכות טרנספוזון. היתרון של גישה זו כולל סינון יעיל ועריכת גנים חלקה כפי שהוכח לראשונה על ידי Yusa et al.9,10. קלטת בחירת התרופה מאפשרת העשרה של תאים עם וקטור משולב, אשר לאחר מכן נבדקים על ידי צומת PCR כדי לזהות את אלה שמקורם ב- HDR. בנוסף, ניתן למקם את קלטת בחירת התרופות כך שתחליף את רצפי המטרה עבור ביקוע Cas9(n), כך שלא תתרחש שבירת דנ"א נוספת לאחר HDR, ובכך תבטל מוטציות מטרה 'על' הנובעות ממחשוף מחדש של Cas9(n). יתר על כן, על ידי ניצול הכריתה המדויקת המזורזת על ידי טרנספוזאז piggyBac, סמן הבחירה נכרת מהגנום מבלי להשאיר צלקת. רק רצף ה- TTAA האנדוגני המקורי להחדרת piggyBac נשאר לאחר הסרת סמן בחירת התרופה9. גם אם יש ליצור את אתרי TTAA על ידי הצגת החלפות, הסיכויים לאלמנטים רגולטוריים מטרידים מצטמצמים בהשוואה לשיטות אחרות10.

כאן אנו מתארים נהלים מפורטים ליישום עריכת גנום חלקה ב- hPSCs. בשילוב של פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטציה של ניקאז CRISPR-Cas9 בברירה גנטית דו-שלבית, החדרנו שתי מוטציות נקודתיות קבועות מראש לגן ההפטוציטים הגרעיני פקטור 4 אלפא (HNF4α)11. גישה זו אמינה ויעילה, ואפשרה ניתוח מעמיק של התפקידים החשובים שממלא HNF4α במפרט אנדודרם והפטוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון ובניית פלסמידי ביטוי CRISPR/Cas9n-sgRNA

  1. חפש רצפי מדריך של 20 bp ישירות במעלה הזרם של כל 5'-NGG ליד האתר לשינוי. יש צורך בזוג רנ"א חד-מנחה (sgRNAs) כאשר נעשה שימוש בניקאז Cas9 (Cas9n) מסטרפטוקוקוס פיוגנס . זוג ה-sgRNAs חייבים להיות מסוגלים לייצר 5' overhangs עם ניקינג עם היסט של -4 עד 20 bp6.
  2. סדר אוליגוס הכרחי ו pSpCas9n-2A-puro וקטור.
  3. שכפל sgRNA לתוך וקטור pSpCas9n לביטוי משותף עם Cas9n בעקבות פרוטוקולשפורסם 12.

2. תכנון ובניית וקטור מיקוד מבוסס piggyBac

  1. הורד את רצף גני היעד וחפש אתר TTAA ליד האתר לשינוי.
    הערה: המרחק בין אתר TTAA לבין האתר המיועד לשינוי צריך להיות קטן ככל האפשר. אם בתוך רצף קידוד ואין אתר TTAA קיים במרחק של 100 bp, יש צורך להציג אחד על ידי ביצוע תחליפי נוקלאוטידים נרדפים.
  2. תכננו זרועות הומולוגיות (HAs) ושלבו מוטציות נקודתיות רצויות ב-HAs. האורך האופטימלי של HAs צריך להיות סביב 500 - 1200 bp.
    הערה: מומלץ להכניס תחליפי נוקלאוטידים נרדפים כדי לבצע מוטציה ברצף PAM על מנת למנוע ביקוע מחדש פוטנציאלי של Cas9n.
  3. בנה את וקטור המיקוד הסופי בהתאם לפרוטוקול10 שנקבע.
    הערה: בווקטור המיקוד המשמש כאן, קלטת בחירה של מקדם PGK המונעת על ידי puro-deltaTK מוקפת בחזרות הפוכות טרנספוזון.

3. עריכה גנטית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

  1. שמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 על משטחים רקומביננטיים מצופים למינין 521 (5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-mTeSR1 בינוני13. התאים אמורים להגיע למפגש של 70-85% לאחר 72 שעות לאחר יחס פיצול של 1:3.
    הערה: אם הם קיימים, הסר תאים שהתמייננו באופן ספונטני לפני שינוי בינוני יומיומי על-ידי שאיפתם בעדינות.
  2. ביום ההעברה, צפו מספיק בארות של צלחת 24 בארות עם 300 μL של תמיסת laminin 521 (5 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפחות.
  3. הסר את תמיסת הציפוי בעדינות והוסף 300 μL של מדיום mTeSR1 טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 μM לכל באר, ולאחר מכן החזיר את הצלחת לאינקובטור כדי לקבל תאים.
    הערה: אין לאפשר לצלחות להתייבש בשום שלב בעת הסרת תמיסת ציפוי הלמינין.
  4. להעביר את hPSCs המניות מן האינקובטור, להסיר בינוני בילה, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת באמצעות 1 מ"ל של סטרילי 1x DPBS.
  5. הוסיפו 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה עדינה של תאים לכל באר של צלחת 6 בארות ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6-8 דקות כדי לנתק את התאים.
    הערה: הקש בעדינות על הצלחת ובדוק אם התאים יכולים להתנתק בקלות כדי להחליט אם העיכול ארוך מספיק.
  6. פיפטה עדינה למעלה ולמטה באמצעות קצה P1000 כדי להרים את כל ה-hPSCs.
  7. סיים את הדיסוציאציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום mTeSR1 טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 μM (Y-27632) לתרחיף התא.
  8. מערבבים היטב ומעבירים את המתלה החד-תאי לצינור של 50 מ"ל, וצנטריפוגה בגודל 200 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את הסופרנטנט, והחזיר את התאים היטב במדיום mTeSR1 טרי של 2 מ"ל בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר.
  10. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer. השתמש ב-Trypan Blue כדי להכתים ולהוציא תאים מתים.
  11. העבר 8 x 10 5 עד 1 x 106 תאים חיים לצינור1.5 מ"ל עבור כל תגובת נוקלאופקציה וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 3 דקות. ואז בזהירות לשאוף את supernatant.
  12. ערבבו 3 מיקרוגרם של פלסמידי הביטוי Cas9n-sgRNA הזוגיים ו-5 מיקרוגרם של פלסמיד וקטורי מיקוד ב-100 μL של תמיסת נוקלאוקציה מעורבת / תוסף מתוך ערכת הנוקלאופקציה של תאי גזע אנושיים. השתמש בפלסמיד בקרת GFP מהערכה והכן גם תערובת פלסמיד לבקרת GFP.
    הערה: חשוב להכין מקסי של כל הפלסמידים כדי להפחית את זיהום האנדוטוקסין לפני הנוקלאופקציה. ריכוז הפלסמידים צריך להיות בערך 1 מיקרוגרם / μL.
  13. השתמש בתערובת הדנ"א (נפח ~ 111 μL) כדי להשעות את התאים המוכנים ולהעביר אותו לקובט אלקטרופורציה (המסופק עם ערכת הנוקלאופקציה), תוך הימנעות מבועות.
  14. אלקטרופולציה של התאים באמצעות מכשיר הגרעין על ידי בחירת התנאים האופטימליים לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
    הערה: אם משתמשים בערכת הגרעין לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בפעם הראשונה, יש צורך לבדוק את תוכנית האלקטרופורציה ולבחור את היעילה ביותר.
  15. יש להוסיף מיד 500 μL של צבע טרי וחם ל-37°C mTeSR1 בינוני בתוספת מעכב ROCK של 10 μM לתאים האלקטרופורטיביים. מעבירים את התערובת ל-2 בארות של צלחת בת 24 בארות שהוכנה משלבים 3.2 ו-3.3.
  16. החזירו במהירות את הצלחת לאינקובטור 37 °C / 5% CO2 ואפשרו לתאים להתאושש.
  17. 12-16 שעות מאוחר יותר, שנה את אמצעי תחזוקת התא. אם התאים יצרו קשר בין התא, משכו את מעכב ה-ROCK, אם לא, המשיכו להשלים את התווך עם המעכב.
  18. בין 24-48 שעות, בדוק את יעילות הגרעין על ידי בחינת ביטוי GFP בתאי הביקורת. תאים חיוביים GFP צריך להיות לפחות 30 אחוזים.
  19. 48 שעות לאחר הנוקלאופקציה, התחל לבחור תאים על ידי השלמת מדיום mTeSR1 עם 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin.
  20. 72 שעות לאחר נטילת נוקלאופקציה, יש להשלים את המדיום mTeSR1 עם 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין. אם מפגש התאים נמוך מ -30%, גם להשלים את המדיום עם מעכב 10 μM ROCK.
  21. 4-6 ימים לאחר הנוקלאופקציה, מעבירים את התאים העמידים לפורומיצין לצלחות של 10-15 x 96-באר בריכוז של 0.8 תאים/באר.
    הערה: חיוני להשלים את המדיום עם מעכב ROCK של 10 μM ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.
  22. שמור על תאים אלה בטמפרטורה של 37 °C / 10% CO2 למשך 10-12 ימים כדי ליצור מושבות שמקורן בתאים בודדים. יש לטעון את המדיום פעם אחת 7 ימים לאחר הזריעה.
    הערה: רמת CO2 מוגברת מסייעת ל-hPSCs בודדים ליצור מושבות מניסיוננו.
  23. מסמנים בארות המכילות מושבה אחת ומחליפים את המדיום במדיום mTeSR1 טרי המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין אך ללא מעכב ROCK.
    הערה: מנקודה זו ואילך, התאים יגדלו מתחת ל-37 °C/5% CO2.
  24. יומיים לאחר מכן, החליפו מדיום לבארות המכילות מושבות לא מובחנות. תוסף למדיום עם מעכב ROCK של 10 μM ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.
    הערה: בבארות מסוימות, ייתכן שהתאים התמינו ויש להשליך אותם.
  25. השתמש בקצות פיפטה P2 כדי לגרד את המושבות בעדינות. מעבירים את תרחיף התאים שמקורו במושבה אחת ל-2 בארות חדשות על לוחות נפרדים של 96 בארות, ומשתמשים באחת לגנוטיפ ואחת לתחזוקה.
    הערה: חשוב לשמור בקפידה על המושבות ולשמור על רמת ההבחנה הספונטנית למינימום.
  26. הוציאו את הצלחת המכילה תאים לגנוטיפ ברגע שהמפגש ברוב הבארות הגיע ל-50% ומעלה. לזרוק את המדיום בילה ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS.
  27. Lyse התאים היטב באמצעות Bradley lysis buffer ולבודד דנ"א גנומי מכל באר בצלחת בעקבות פרוטוקול נלווה (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).
  28. השתמש בשיטת PCR של צומת שלושה פריימרים כדי לבצע גנוטיפ של זרועות הומולוגיה שמאליות וימניות באופן עצמאי10.
    הערה: סכימה המציגה את שיטת ה-PCR מוצגת באיור 2.
  29. שלח את מוצרי ה- PCR של הצומת עבור שתי זרועות הומולוגיה מ 4-5 מושבות לריצוף סנגר וקבל את הרצפים.
    הערה: תוצאת הריצוף של 2 מושבות מבוססות מוצגת באיור 3A.
  30. שמור על מושבות עם הגנוטיפ הנכון והשלך את השאר.
  31. הרחיבו את המושבות הנכונות תחת בחירת פורומיצין רציפה והקפיאו אותן במעבר המוקדם ביותר האפשרי.

4. הסרת טרנספוזון מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ממוקדים

  1. שמור על מושבה אחת עם גנוטיפ נכון תחת 0.5 מיקרוגרם / מ"ל בחירת פורומיצין.
  2. Nucleofect 8 x 10 5 עד 1 x 106 תאים עם5 מיקרוגרם טרנספוזאז היפראקטיבי (pCMV-hyPBase) כמתואר לעיל (סעיף 3, שלבים 3.4-3.18). בצע גרעין בקרת GFP במקביל.
    הערה: יש להסיר את פורומיצין מהמדיום mTeSR1 מיד לאחר יצירת הגרעין של תאים אלה.
  3. לגדול ולסנן תאים עם קלטת הבחירה puro-deltaTK הוסרה בעקבות נהלים שפורסמו10.
    הערה: חשוב לעקוב בקפידה אחר ההליכים המקוריים. FIAU, או 1-(2-deoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-יודוראציל), שימש כאנלוגיה של תימידין עבור הרפס סימפלקס מבוסס וירוס תימידין קינאז (HSV-tk).
  4. רצף את האזור שהשתנה כדי לאשר את הסרת הטרנספוזון.
    הערה: תוצאת הרצף של 3 מושבות מבוססות מוצגת באיור 3B.
  5. שמור על מושבות עם הגנוטיפ הנכון והתרחב לשימוש נוסף.
  6. לבצע אפיון של סמני פלוריפוטנטיות במושבות הנבחרות לפני השימוש בהם לניתוח נוסף.
    הערה: האפיון של שתי מושבות מבוססות מוצג באיור 4.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמקדות באסטרטגיית דפיקה מבוססת וקטורים
הגן ההפטוציטים הגרעיני פקטור 4 אלפא (HNF4α) נבחר לעריכת גנום ממוקדת כדי להכניס שתי מוטציות נקודתיות לאקסון 8. זוג Cas9n-sgRNA עם היסט של 11 bp תוכנן קרוב לאתר לשינוי. וקטור המיקוד מבוסס piggyBac עבד כתבנית תיקון מכוונת הומולוגיה להצגת מוטציות הנקודה הרצויות. 967 bp 5'-HA ו-1142 bp 3'-HA המשלבים תחליפי נוקלאוטידים נרדפים או מוטציות הנקודה הרצויה הוגברו ושוכפלו לווקטור המיקוד הסופי. אתר ההחדרה של piggyBac היה במרחק של 16 bp ו-22 bp משתי המוטציות הנקודתיות הרצויות. מושבות המכילות את קלטת הבחירה puro-deltaTK נבחרו עם פורומיצין בסיבוב הראשון. לאחר שקלטת הברירה הוסרה על-ידי כריתת טרנספוזאז בסיבוב השני, האתר הממוקד שונה בצורה חלקה כאשר רק מוטציות הנקודה הרצויות שולבו בגן (איור 1).

עריכה גנטית בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
כדי לסנן תאים ממוקדים כהלכה, נעשה שימוש בשיטת PCR מבוססת פריימר לגנוטיפ (איור 2). ריצוף סנגר בוצע כדי לאשר את תוצאות ה-PCR (איור 3A). לאחר הסרת קלטת הבחירה, האזור שהשתנה רוצף שוב כדי לאשר את ההקדמה הנכונה של מוטציות נקודה רצויות (איור 3B).

הקמת מושבה ואפיון תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ערוכים
מושבות עם הגנוטיפ הנכון נבחרו והורחבו לפי הצורך. יש לאפיין את המושבות שהוקמו לפני שישמשו לניתוח נוסף. לתאים הערוכים יש אותה מורפולוגיה כמו לתאי ההורים (איור 4A). הם גם מבטאים סמנים מייצגים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, כולל גורמי שעתוק NANOG ו-OCT4 (איור 4 B), כמו גם סמני פני השטח של התא SSEA4 ו-TRA-1-60 (איור 4C).

figure-results-1
איור 1: מיקוד אסטרטגיית דפיקה מבוססת וקטורים11. זוג פלסמידים לביטוי Cas9n-sgRNA שימשו כדי לגרום לשבירת דנ"א דו-גדילי באקסון 8 של הגן HNF4α. וקטור מיקוד עם קלטת סלקציה שימש להחדרת מוטציות נקודתיות קבועות מראש הממוקמות במרחק של 16 bp ו-22 bp. קלטת בחירה זו נכללה בתוך הטרנספוזון piggyBac , המורכב מסמן בחירה חיובי-שלילי (puro-deltaTK) המונע על ידי מקדם פעיל (PGK). באמצעות מסלול תיקון מכוון הומולוגיה, התאים הממוקדים שילבו את קלטת הבחירה. כריתת טרנספוזון בתיווך טרנספוז גורמת לשינוי חלק כאשר רק המוטציות הנקודתיות קיימות. הצלב האדום מציין את המיקום של מוטציות הנקודה הרצויה. HA = זרוע הומולוגיה; PB = חזיריבאק; PM = מוטציה נקודתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: שלוש שיטות PCR מבוססות פריימר. כדי לסנן תאים ממוקדי גנים, נעשה שימוש בגנוטיפ מבוסס PCR. שלושה פריימרים, LA-F1, -R1 ו-R2 שימשו להגברת אזור זרוע ההומולוגיה השמאלית. באופן עצמאי, RA-F1, -F2 ו-R1 שימשו להגברת אזור זרוע ההומולוגיה הימנית. בהתבסס על תוצאת האלקטרופורזה בג'ל, תאים שאינם ממוקדים, ותאים הטרוזיגוטיים והומוזיגוטיים, נבדלו זה מזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: תוצאות ריצוף של תאים מהונדסים גנטית11. תוצרי PCR משני שיבוטים רוצפו ואישרו את ההכנסה הנכונה של קלטת הבחירה בלוקוס הממוקד (A). 5' ו-3' piggyBac חזרות מסוף הפוכות (ITR) היו מוקפות על ידי החזרות הישירות של TTAA. שלושה שיבוטים היו רצף לאחר כריתת טרנספוזון (B). זוג Cas9n-sgRNA עם היסט של 11 bp שימש להחדרת שבר דו-גדילי של DNA. שתי מוטציות נקודתיות קבועות מראש (A עד G ו-A עד C) הוכנסו לגן. מוטציה נרדפת אחת הוכנסה כדי לשנות את מוטיב הפרוטו-ספייסר הסמוך (PAM), ומוטיב אחר כדי ליצור את אתר TTAA הנחוץ לכריתת piggyBac . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4
איור 4: אפיון של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ערוכים. מורפולוגיה של שתי שורות תאים ערוכות ותאי האב (A), סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הביטוי של סמני תאי גזע פלוריפוטנטיים NANOG ו-OCT4 שנבדקו על ידי אימונוסטינינג (B, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר), בנוסף ל-SSEA4 ו-TRA-1-60 על ידי ציטומטריה של זרימה (C) בשני קווי תאים שעברו שינוי ובתאי ההורים. IgG שימש כבקרה שלילית. DAPI שימש כדי להכתים את הגרעין. האחוזים חושבו כממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש להחדרת מוטציות נקודתיות קבועות מראש לתוך מוקד אנדוגני ב- hPSCs. השילוב של וקטור מיקוד מבוסס piggyBac ופלסמידי ביטוי CRISPR/Cas9n מזווגים הוכיח את עצמו כאמין ויעיל11. לאחר עריכת גנים של HNF4α, 12 מתוך 43 שיבוטים שנותחו היו ממוקדים בצורה נכונה כפי שנקבע על ידי בדיקת PCR בצומת. באופן ספציפי, יעילות המיקוד הדו-אלילי הייתה כ-21% (9/43) ויעילות המיקוד המונואלילית הייתה סביב 7% (3/43).

בעקבות ניסויי מיקוד, חיוני לשמור על בחירת פורומיצין כדי לשמור על הלוקוס הממוקד נגיש לטרנספוזאז piggyBac במהלך הסיבוב הראשון של ההקרנה. זה ימזער את ההשתקה של קלטת הבחירה Puro-deltaTK המונעת על ידי מקדם PGK ויפחית את הרקע בסיבוב השני של ההקרנה10. דו"ח שפורסם לאחרונה הראה כי מקדם CAG עמיד יותר להשתקה מאשר מקדם PGK ב-hPSCs14. שינוי המקדם לקלטת הבחירה יכול אפוא לשפר מערכת זו בעתיד. כמו כן, חשוב להשוות את מספר המושבות העמידות של תאים שעברו טרנספקציה של HyPBase ו-GFP. לאחר הסרה מוצלחת של הטרנספוזון, אמורות להיות יותר מושבות ששרדו מה-hyPBase- מאשר תאים שעברו טרנספקציה של GFP. בנוסף לניתוח PCR של כריתת טרנספוזון, נדרש רצף ישיר של האזור שהשתנה כדי לאשר את נאמנות הכריתה.

בהתבסס על אסטרטגיית וקטור המיקוד מבוססת ה-piggyBac של Yusa, 9,10, ההליכים המפורטים לעיל התמקדו בשיפור הנוקלאוקציה של hPSCs ויעילות השיבוט של תאים בודדים. צפיפות זריעת התאים עברה אופטימיזציה כדי להפחית את הסבירות להיווצרות מושבות הטרוגניות. השתמשנו גם בתרבית של 10-12 ימים תחת 10% CO2 כדי לשפר את ייצור המושבה לבדיקת גנוטיפ. מניסיוננו, ניתן היה להשיג כ-20 מושבות מכל צלחת 96 בארות. למרות שצעד זה עשוי להימשך זמן רב יותר משיטות אחרות, הוא אמין ויעיל ביותר.

בהתבסס על הצורך, וקטורים ממוקדים יכולים להיות מתוכננים כדי להציג או לתקן מוטציות נקודה, כדי ליצור קווי תאים מדווחים, כמו גם ביטוי גנים נוקאאוט. לסיכום, השילוב של מערכת CRISPR/Cas9(n) ווקטור מיקוד הוא דרך יעילה לספק סוגים שונים של hPSCs מהונדסים גנטית.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.C.H הוא מייסד שותף, בעל מניות ודירקטור של Stemnovate Limited.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקוסוקה יוסה על שיתוף הפלסמידים pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK ו- pCMV-hyPBase. אנו מודים לג'יה-יין יאנג ולקרמג'יט סינג-דולט על דיונים מועילים בנושא עריכת גנום. מעבדת D.C.H. נתמכת על ידי פרס ממשרד המדען הראשי (TC/16/37) ופלטפורמת הרפואה הרגנרטיבית בבריטניה (MR/L022974/1). Y.W. נתמך על ידי מלגת דוקטורט במימון מועצת המלגות הסינית ואוניברסיטת אדינבורו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אנטי אנושי SSEA4 PEeBioscience12-8843-42
אנטי אנושי TRA-1-60 PEeBioscience11-0159-42
DPBSThermo Fisher Scientific14190144
DPBS עם סידן ומגנזיוםThermo Fisher Scientific14040133
FIAUMoravekM251
תא עדין מגיב דיסוציאציהטכנולוגיות תאי גזע07174
H9 תאי גזע עובריים אנושייםWiCellWA09
נוגדן NANOG אנושיR& מערכות DAF1997
נוגדן OCT4 אנושיAbcamAB19857
ערכת נוקלאופקטור תאי גזע אנושיים 1LonzaVPH-5012
בקרת איזוטיפ IgG3 עכבר PEeBioscience12-4742-41
mTeSR1 טכנולוגיותתאי גזע85850
מכשיר Nucleofector 2bLonzaAAB-1001
pCMV-hyPBaseWellcome Trust Sanger InstituteN/A
pMCS-AAT_PBPGKpuroTKWellcome Trust Sanger InstituteN/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)AddgenePX462
Puromycin dihydrochlorideThermo Fisher ScientificA11138-03
QIAprep ספין maxiprep ערכתQiagen12162
ערכת מיני-הכנה לסיבוב QIAprepQiagen27106
למינין רקומביננטי 521BioLaminaLN521
תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%תרמו פישר סיינטיפיק15250061
Y-27632 (דיהידרוכלוריד)MilliporeSCM075
בינוניות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rashidi, H., et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
  2. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  3. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763(2003).
  4. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  6. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  7. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-824 (2013).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  10. Yusa, K. Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon. Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).
  11. Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
  12. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).
  14. Eggenschwiler, R., et al. Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase. Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsCRISPR Cas9 NickaseSeamless Genome EditingHNF4A LocusPiggyBac Donor PlasmidTwo Step Genetic SelectionNucleofection ProcedurePuromycin SelectionROCK Inhibitor SupplementSanger Sequencing Confirmation

Related Articles