מאמר שיטה

מעקב אחר חלקיקים תלת מימדיים לניתוח לא פולשני in vivo של דינמיקת מיקרו-צינורות סינפטיים בדנדריטים ובצמתים עצביים-שריריים של דרוזופילה

DOI:

10.3791/61159

⸱

12 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, 2DRVision Technologies LLC

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג אסטרטגיית הדמיה עצבית תוך-חיונית לא פולשנית בשילוב עם אסטרטגיית תוכנה חדשה להשגת מעקב וניתוח אוטומטיים ובלתי משוחדים של דינמיקת מיקרו-צינוריות (MT) פלוס קצה בדנדריטים החושיים ובצמתים העצביים-שריריים של דרוזופילה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-צינורות (MTs) ממלאים תפקידים קריטיים בהתפתחות עצבית, אך נותרו שאלות רבות לגבי המנגנונים המולקולריים של ויסות ותפקודם. יתר על כן, למרות ההתקדמות בהבנת MTs פוסט-סינפטי, הרבה פחות ידוע על התרומות של MTs פרה-סינפטי למורפוגנזה עצבית. בפרט, מחקרים על דינמיקת MT in vivo בדנדריטים חושיים של דרוזופילה הניבו תובנות משמעותיות לגבי התנהגות ברמת הפולימר. עם זאת, האתגרים הטכניים והאנליטיים הקשורים להדמיה חיה של הצומת העצבי-שרירי של הזבוב (NMJ) הגבילו מחקרים דומים של דינמיקת MT פרה-סינפטית. יתר על כן, בעוד שישנן אסטרטגיות תוכנה יעילות רבות לניתוח אוטומטי של דינמיקת MT במבחנה וב-ex vivo, נתוני in vivo דורשים לעתים קרובות קלט מפעיל משמעותי או ניתוח ידני לחלוטין עקב יחס אות לרעש נחות מטבעו בתמונות ומורפולוגיה תאית מורכבת.  כדי לטפל בכך, מחקר זה אופטימיזציה של פלטפורמת תוכנה חדשה לזיהוי חלקיקים אוטומטי וחסר פניות in vivo. ניתוח רב-פרמטרי של תמונות קונפוקליות חיות של EB1-GFP המסומנות MTS בוצע הן בדנדריטים והן ב-NMJ של זחלי דרוזופילה ומצא הבדלים בולטים בהתנהגויות MT. דינמיקת MT נותחה בנוסף לאחר הפלת החלבון הקשור ל-MT (MAP) dTACC, מווסת מרכזי של התפתחות סינפסות דרוזופילה, וזיהתה שינויים מובהקים סטטיסטית בדינמיקת MT בהשוואה לסוג הפראי. תוצאות אלה מדגימות כי אסטרטגיה חדשה זו לניתוח רב-פרמטרי אוטומטי של דינמיקת MT קדם-סינפטית ופוסט-סינפטית ברמת הפולימר מפחיתה משמעותית את הקריטריונים של אדם בלולאה. המחקר מראה עוד את התועלת של שיטה זו בזיהוי התנהגויות MT מובחנות בעת נוקדאון dTACC, מה שמצביע על יישום עתידי אפשרי עבור מסכים פונקציונליים של גורמים המווסתים את דינמיקת MT in vivo. יישומים עתידיים של שיטה זו עשויים להתמקד גם בהבהרת סוג התא ו/או התנהגויות MT ספציפיות לתא, והדמיה מתאמת רב-צבעונית של EB1-GFP עם סמנים תאיים ותת-תאיים אחרים מעניינים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים מתארגנים ליצירת מבנים פונקציונליים באמצעות תיאום של שינויים תוך-תאיים ובין-תאיים באמצעות מורפוגנזה. דוגמה יוצאת דופן למורפוגנזה היא התפתחות המבנה העצבי המיוחד ביותר. נוירונים מציגים קיטוב יוצא דופן, שבו הם מרחיבים שני סוגים שונים של תהליכים מבניים ותפקודיים, דנדריטים ואקסונים1, שיכולים להשיג אורכים עצומים. המורכבות של התפתחות עצבית נובעת לא רק מהגודל העצום של דנדריטים ואקסונים אלא גם מהקושי ליצור את הגיאומטריות המסועפות המורכבות שלהם 2,3. מורפוגנזה עצבית והשלכותיה על למידה וזיכרון4 מניעים את החקירה המתמשכת הן של הבקרה הגנטית והן של המנגנונים הביולוגיים של התא הבסיסיים. מנגנונים כאלה כוללים, אך אינם מוגבלים להובלה תוך-תאית של הממברנה והסידורים מחדש הרבים של השלד הציטולוגי הדרושים לשינויים במורפולוגיה העצבית 1,2,3.

מחקרים על מורפוגנזה עצבית הניבו מגוון טכניקות הדמיה מתקדמות. שיטות סטטיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים או מיקרוסקופ פלואורסצנטי של בדיקות קבועות, נמצאות בשימוש נרחב לביצוע ניתוח מורפולוגי ומבני ברזולוציה גבוהה. עם זאת, מלבד החפצים הבלתי נמנעים לכל שיטת שימור, הדמיה סטטית אינה יכולה ללכוד את השינויים הדינמיים העומדים בבסיס המורפוגנזה. לפיכך, תובנות מרכזיות רבות מקורן במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של רקמות חיות. עבודה מוקדמת של ליכטמן ועמיתיו 5,6,7 השתמשה בהדמיה in vivo של מערכת העצבים של היונקים כדי לחקור התחדשות/ניוון אקסונים, ארגון רכיבים סינפטיים והובלה אקסונלית ארוכת טווח. יתר על כן, מחקרים מכוננים באקספלנטים עצביים ראשוניים היו קריטיים לביסוס החשיבות של דינמיקת מיקרו-צינוריות (MT) להתארכות אקסונלית ותנועתיות 8,9. באופן מכריע, מחקרי אקספלנט עצביים מוקדמים ביססו את השימוש בחלבונים משפחתיים קושרים קצה (EBs) מתויגים פלואורסצנטיים כדי להשיג תובנות יקרות ערך לגבי דינמיקת MT פלוס קצה בפיתוח נוירונים ברמה של פולימרי MT בודדים10. מחקרים אלה נבעו מתצפיות שבן משפחת EB EB1 מתמקם באופן מועדף ל-MT plus מסתיים11 ב-S. cerevisiae12 ובתאים מתורבתים13. מאז, EB1 וחלבונים אחרים למעקב אחר קצה פלוס (+TIPs)14,15 היו בשימוש נרחב במחקרי in vivo של חוסר יציבות דינמית של MT16, כולל בהקשר של התפתחות עצבית17.

דרוזופילה הוא מודל רב עוצמה למחקרי הדמיה in vivo של דינמיקת MT במהלך התפתחות עצבית בשל הכלים הגנטיים וההדמיה העצומים הזמינים למחקרי זבובים18,19 כמו גם הדמיון במבנה ובתפקוד בין דרוזופילה לנוירונים של בעלי חוליות1. מחקר מוקדם מרכזי של הצומת העצבי-שרירי (NMJ) של זחלי דרוזופילה ביצע הדמיה לא פולשנית חוזרת ונשנית של סמן ממברנה פלואורסצנטית דרך הציפורן השקופה של בעלי חיים שלמים כדי לתעד מורפוגנזה טרמינלית פרה-סינפטית20. באמצעות שיטה דומה להדמיית זחלי דרוזופילה חיים שלמים, ניתנה הדגמה ראשונית של ניתוח תת-תאי ברמת החלקיקים של תנועה תהליכית של מטענים ממונעים באקסונים21. לאחרונה, מחקרים קפדניים של רולס ועמיתיו בדנדריטים החושיים של זחלי דרוזופילה שלמים 22,23,24,25,26,27 אפיינו דינמיקה פוסט-סינפטית של MT פלוס-קצה על ידי ביצוע מעקב אחר חלקיקים וניתוח של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג EB1. מחקרים כאלה בדרוזופילה 22,23,24,25,26,27 ומערכות אחרות 28,29,30,31,32 קידמו משמעותית את ההבנה של התנהגות פולימר יחיד של MT פלוס מסתיים בדנדריטים של נוירונים מתפתחים 33.

למרות מחקרי in vivo המרשימים של דינמיקת MT פוסט-סינפטית 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31, היו הרבה פחות מחקרים דומים של דינמיקת MT פרה-סינפטית במסוף האקסון המתפתח. דינמיקת MT בזחל הדרוזופילה NMJ נחקרה באמצעות מיקרוסקופ כתמים פלואורסצנטי (FSM) והתאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטוהלבנה (FRAP)34. טכניקות אלה מעריכות את הקינטיקה הכוללת של טובולין אך לא את ההתנהגות של קצוות MT פלוס בודדים. נכון לכתיבת שורות אלה, הייתה חקירה אחת יחידה של MT פלוס בודד ב-Drosophila NMJ: מחקר זה שילב הדמיה חיה עם ניתוח ידני של קימוגרפים כדי לאפיין אוכלוסייה של דינמי, EB1-GFP המסומנת כ"MTs חלוצית" שנראתה נבדלת מאוכלוסייה רחבה יותר של MTs35 מיוצבים. היעדר מחקר זה על דינמיקת MT פרה-סינפטית עשוי לנבוע לפחות בחלקו מהאנטומיה: בעוד שזה פשוט יחסית להשיג תמונות של דנדריטים בשל קרבתם לציפורן הזחל, NMJs חסומים על ידי רקמות אחרות, מה שמקשה על רכישת תמונות עם יחס אות לרעש מספיק לניתוח רמת החלקיקים. עם זאת, בהתחשב בחשיבותם המבוססת של ה-MTs הקדם-סינפטי למורפוגנזה וייצוב סינפטי36, כמו גם הקשרים שלהם להפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות37, סביר להניח שגישור על הפער הזה בין הבנת MTs קדם-סינפטי ופוסט-סינפטי יניב תובנות יקרות ערך.

אתגר נוסף לניתוח דינמיקת MT in vivo באופן כללי, בניגוד לניתוח in vitro או ex vivo, הוא כלי התוכנה האוטומטיים המוגבלים שיכולים לחלץ פרמטרים של דינמיקה מנתונים in vivo. כיום, אחת הטכניקות הפופולריות והחזקות ביותר לניתוח קצוות MT פלוס עם תווית +TIP היא plusTipTracker38,39, תוכנה מבוססת MATLAB המאפשרת מעקב וניתוח אוטומטי של פרמטרים דינמיים מרובים. יש לציין כי plusTipTracker מודד לא רק את צמיחת MT אלא גם התכווצות והצלה: בעוד שתוויות +TIP כגון EB1-GFP מקשרות רק לקצוות פלוס גדלים, plusTipTracker יכול להסיק באופן אלגוריתמי שיעורי הצטמקות ואירועי הצלה. עם זאת, בעוד ש- plusTripTracker יושם בהצלחה רבה בהקשרים רבים, כולל ניתוח רב-פרמטרי קודם של דינמיקת MT ex vivo בתאי Drosophila S240, plusTipTracker אינו אופטימלי לניתוח נתוני in vivo בהתחשב ביחס האות לרעש הנמוך שלהם. כתוצאה מכך, מחקרי in vivo של דינמיקת פלוס-קצה בדנדריטים 22,23,24,25,26,27 וב-NMJ 35 של דרוזופילה הסתמכו על יצירה ידנית וניתוח של קימוגרפים באמצעות תוכנה כגון ImageJ41, או על אסטרטגיות אוטומטיות למחצה הכוללות רכיבים אנושיים רבים בלולאה.

מחקר זה מציג זרימת עבודה ניסויית ואנליטית המפחיתה את התקורה הניסיונית והאנליטית הנדרשת לביצוע ניתוח לא פולשני ברמת הפולימר של דינמיקת MT פרה-סינפטית הן בדנדריטים חושיים והן במסוף האקסון המוטורי של זחלי דרוזופילה כוכב שלישי. הפרוטוקול משתמש בזחלים משותקים ושלמים ולכן נמנע מפציעות הידועות כמעוררות תגובות לחץ כמו גם מצבים לא פיזיולוגיים אחרים שעלולים להפריע לדינמיקה של MT in vivo. כדי לתייג MT פלוס-קצוות דינמיים, EB1-GFP מתבטא פאן-נוירוני באמצעות מערכת Gal4/UAS 42, המאפשרת הדמיה של MTs הן בדנדריטים והן ב-NMJ עם דרייבר יחיד. בעוד שחלק מהצעדים המוקדמים כפופים באופן בלתי נמנע לקבלת החלטות אנושיות, כגון בחירת דגימות בעלי חיים וזיהוי אזורים לתמונה, השלבים לאחר רכישת הנתונים הם אוטומטיים ברובם. באופן מכריע, אופטימיזציה של תוכנה חדשה אפשרה ניתוח אוטומטי וחסר פניות הדורש קלט אנושי מינימלי. בעוד ששיטות אחרות למעקב אחר חלקיקים זמינות 43,44,45, מחקר זה משתמש בתוכנה קניינית מכיוון שהיא התאימה היטב מבחינה אלגוריתמית כדי להתמודד עם האתגרים הספציפיים של מערך הנתונים הספציפי הזה. התוכנה זמינה כעת למשתמשים עבור מגוון יישומים. באופן ספציפי, השימוש בסינון דיפוזיה משפר קוהרנטיות46 הוא חלק בלתי נפרד מפילוח אוטומטי והסרת רקע, ואלגוריתמים מותאמים אישית מיושמים במיוחד כדי להפוך את זיהוי החלקיקים לאוטומטי. אסטרטגיה זו יכולה להתמודד ביעילות עם יחס האות לרעש הנמוך הטמון בנתונים במחקר זה, כמו גם אתגרים אחרים, כגון תנועה של שביטים EB1-GFP דרך מישורי מוקד שונים. אמנם לא ניתן לבדוק באופן ממצה את הביצועים של תוכנה זו מול כל תוכנות ניתוח החלקיקים האחרות, אך הביצועים של האסטרטגיה הנוכחית השתוו או התקרבו לביצועים האנושיים הסטנדרטיים. יתר על כן, למיטב ידיעת המחברים, לא הייתה תוכנה אחרת שהוכשרה במיוחד על נתוני in vivo מדנדריטים חושיים ומהטרמינל הפרה-סינפטי. בהתחשב בכך שהביצועים של אלגוריתמים לניתוח תמונה הם לרוב ספציפיים מאוד לנתונים שעבורם הם תוכננו וכי ראייה ממוחשבת כללית עדיין אינה אפשרית, צפוי כי אימון התוכנה המתוארת לנתוני in vivo הספציפיים המעניינים הוא הגישה הנכונה ביותר מבחינה אלגוריתמית.

בהתחשב בעבודה הנרחבת על MTsדנדריטי 22,23,24,25,26,27 כמו גם האיכות העקבית של הנתונים שניתן לרכוש ממערכת זו, אסטרטגיית רכישת התמונה וניתוח התוכנה אומתה לראשונה בדנדריטים חושיים של דרוזופילה. חשוב לציין, נמצא בדנדריטים כי השימוש במניעי Gal4 עצביים שונים, אפילו ברקע פראי זהה, מביא להבדלים משמעותיים בדינמיקה של EB1-GFP עקב הבדלים ברקע הגנטי, תוך הדגשת החשיבות של שימוש במנהל התקן Gal4 יחיד לתוצאות עקביות. אסטרטגיה זו שימשה לאחר מכן לניתוח רב-פרמטרי של דינמיקת EB1-GFP במסוף הפרה-סינפטי של NMJ. כדי להמחיש עוד יותר את הערך החקירתי של שיטה זו, נעשה שימוש באסטרטגיית הדמיה ותוכנה זו כדי להעריך את דינמיקת EB1-GFP הקדם-סינפטית והפוסט-סינפטית לאחר הפלת dTACC, הומולוג הדרוזופילה של משפחת TACC (טרנספורמציה של סליל מפותל חומצי)47,48. עבודה קודמת בתאי Drosophila S240, כמו גם עבודה של לאורי ועמיתיו בחרוט הגידול Xenopus 49,50,51, הראו שבני משפחת TACC מווסתים את הדינמיקה של MT plus-end. יתר על כן, עדויות שדווחו לאחרונה מהדמיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית וסופר-רזולוציה הראו כי dTACC הוא מווסת מרכזי של MTs פרה-סינפטי במהלך מורפוגנזה עצבית52, מה שמעלה את השאלה האם dTACC מווסת דינמיקת MT חיה. דוח זה מדגים שיטה שאכן יכולה לזהות הבדלים בהתנהגויות MT חיות עם נוק-דאון dTACC. לפיכך, מחקר זה מציג שיטה in vivo שיכולה לזהות ולאפיין ביעילות מווסתים מרכזיים של דינמיקת MT בתוך הנוירון המתפתח, במיוחד בתא הפרה-סינפטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. דור דגימות דרוזופילה

  1. בחר סמן MT פלוס מתאים. מחקר זה השתמש ב-EB1 מתויג GFP, סמן פלוס קצה מאופיין היטב עם אות חזק וברור11,12. חלופות כוללות +TIPs אחרים כגון EB310,13, CLASP/Orbit53 ו-CLIP-17054.
  2. השג או צור זבובים עם סמן MT בשליטה של מקדם כטב"מים (למשל, UAS-EB1-GFP).
  3. בחר את מנהל ההתקן המתאים לרקמה הספציפי לרקמה. מחקר זה השתמש במניע הפאן-עצבי elaV-Gal458,59 כדי להניע ביטוי הן בדנדריטים חושיים והן ב-NMJ וב-221-Gal460,61 לביטוי ספציפי לדנדריטים.
  4. גידול זבובים באמצעות טכניקות גידול זבובים סטנדרטיות55,56. מומלץ להחזיק את הזבובים באינקובטורים לחים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס לביטוי אופטימלי של Gal4/UAS.
  5. באמצעות טכניקות גנטיות סטנדרטיות של זבובים55,56, בצע צלבים ליצירת זבובים כדי לבטא את סמן ה-MT plus-end בתאים/רקמות הרצויים.
    הערה: עבור כל שילוב של דוחף Gal4 ו-transgene, התכנון הניסיוני צריך לכלול ניסויי הוכחת היתכנות ואימות כדי לאפיין את המערכת ולמנוע ביטוי יתר של חפצים.

2. הגדרת ציוד

  1. הקימו תחנת עבודה, הכוללת את הזבובים, ריאגנטים להרדמה, חומרי בנייה לשקופיות, סטריאומיקרוסקופ ומקור תאורה, קרוב למיקרוסקופ הקונפוקלי (כלומר, באותו החדר) כדי למזער את הזמן המושקע בין הכנת הדגימה להדמיה כדי להאריך את בריאותם וחיותם של הזחלים.
  2. מכינים את חומר ההרדמה על ידי ערבוב תערובת כלורופורם של 9% (0.1 מ"ל כלורופורם ו-1.0 מ"ל שמן הלוקרבון) בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. כדי למנוע היפרדות, ערבבו היטב על ידי היפוך השפופרת לפני הכנת כל שקופית חדשה.
  3. הכן את שקופית הזכוכית: חותכים ארבע רצועות של סרט דו צדדי (רוחב ~15 מ"מ). יישר שניים מהחלקים על מגלשת הזכוכית, והשאיר רווח של ~5 מ"מ בין הרצועות. שכבו את שני החלקים הנותרים על גבי השניים הראשונים כדי להכפיל את עובי הסרט (איור 1C).
  4. הוסף טיפה גדולה (~100 מיקרוליטר) של תערובת כלורופורם/שמן על מגלשת הזכוכית ברווח של 5 מ"מ בין חלקי הסרט (איור 1C).

3. הכנת דגימות זחל להדמיה

  1. מלאו מיכל (למשל, צלחת 6 בארות) ב-1x PBS.
  2. אסוף זחלי כוכב 3 מבקבוקון הזבוב באמצעות מלקחיים או מכשיר דומה. זהה זחלים בשלב המתאים על ידי התנהגות הזחילה שלהם ועל ידי נוכחותם של 9-12 ווים משוננים בולטים בפה. השתמשו בסטריאומיקרוסקופ כדי לסייע בבימוי הזחלים (איור 1D).
  3. הניחו זחל ב-PBS והזיזו אותו בעדינות כדי לשטוף שאריות מזון או פסולת אחרת. יבש את הזחל בעדינות על רקמה עדינה.
  4. הרדמו את הזחל על ידי הנחתו לתוך טיפת כלורופורם/שמן על השקופית מקטע 2 (איור 1C).
    הערה: הכיוון הגבי/גחוני של הזחל אינו קריטי מכיוון שניתן לזהות נוירונים חושיים ומוטוריים דרך הקוטיקולה השקופה על ידי הגדרת שלב המיקרוסקופ למישור המוקד המתאים, ללא קשר לכיוון הדגימה.
  5. הניחו כיסוי #1.5 מעל. הדביקו את הכיסוי לסרט על ידי הפעלת לחץ עדין, ובכך שיתקו את הזחל מבלי לפגוע בו (איור 1C).
  6. אטמו את החדר עם ג'לי נפט או לק.

4. הדמיה קונפוקלית בזמן-lapse של דגימות חיות

  1. הכן מיקרוסקופ קונפוקלי ואת עדשת האובייקט פי 60 עם טבילה בשמן. הנח את הדגימה על הבמה (איור 1A,B).
  2. השתמש בתוכנת הרכישה כדי להגדיר ניסויים.
    הערה: במחקר זה, כל סדרת הדמיה נרכשה במישור מוקד יחיד בניגוד למחסנית z.
    1. הגדר את משך קיטועי הזמן ל-30 שניות במרווח של 2 שניות, בסך הכל 16 פריימים.
    2. הגדר את החשיפה והעוצמה של הלייזר כדי להבטיח אות מספיק תוך הימנעות מרוויה והלבנת אור.
    3. עבור הדמיית EB1-GFP, הלייזר של 488 ננומטר הוגדר לזמן חשיפה של 100 אלפיות השנייה ולעוצמה של 30%. ערכים אלה עשויים להשתנות עבור שימושים שונים בפרוטוקול זה ויש לשנות אותם באופן אמפירי.
  3. השתמש בעיניות המיקרוסקופ כדי למצוא את הזחל בתאורה ירוקה רחבה. מצא את הדנדריטים או ה-NMJs על ידי התאמת השלב לאט. אין לחשוף את הזחל לתאורה (שדה רחב או קונפוקלי) למשך זמן רב מהנדרש.
    1. דנדריטים נראים כרשתות דקיקות בצבע ירוק בהיר של עצבים שאפשר להבחין בהן בקלות מצרורות אקסונים ארוכים ועבים (איור 1E).
    2. NMJs מופיעים כקבוצות של בוטונים בודדים בצבע ירוק בהיר, בקוטר של כ-5 מיקרומטר, בקצוות של צרורות אקסונים ארוכים ועבים שמתפצלים מחוט העצב (איור 1F).
  4. באמצעות הזנת המצלמה החיה, התמקד במהירות באזור העניין באמצעות תאורה של 488 ננומטר. הפסק מיד את התאורה ברגע שנמצא המיקוד המתאים כדי למנוע פוטוטוקסיות.
  5. התחל רכישת תמונות. ניתן לזהות שביטים EB1 כפונקטות בהירות ותנועתיות.
  6. עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר לפרטים נוספים והנחיות בנושא הדמיה חיה פלואורסצנטית57.

5. עיבוד וניתוח תמונה מבוססי תוכנה

  1. נתח כל קובץ וידאו בנפרד. בתוך התוכנה (ממשק המשתמש מוצג באיור 2), בחר File | יבוא | רצף תמונות וגרור קבצי TIF בתיבה שמופיעה. צפו בתצוגה מקדימה של הסרטון.
  2. בתפריט פרמטרי זיהוי , כוונן את פרמטרי התוכנה כדי להבטיח זיהוי של נקודות פיסוק גלויות בבירור בלבד והימנע מזיהוי אובייקטים מזויפים. לדוגמה, הפחתת עוצמת החלקיקים מביאה לרגישות רבה יותר של תוכנה לפיסוק אך מגדילה את התוצאות החיוביות השגויות הפוטנציאליות. הערכים המדויקים של הפרמטרים ישתנו באופן אמפירי. תיאורים של פרמטרי הזיהוי והמעקב זמינים מהמחברים על פי בקשה.
  3. השתמשו במתכון מעקב אחר חלקיקי תאי עצב כדי לנתח את התמונה באמצעות הכפתור 'מהתחלה ' (חץ כחול, איור 2B). התוכנה תפיק תוצאות עבור פרמטרי המעקב המפורטים בטבלה 1 לגיליון האלקטרוני של התוצאות (תיבה ירוקה, איור 2B). כדי להקל על ניתוח ופרשנות מאוחרים יותר, ניתן לאחסן את התוצאות בתוכנת גיליון אלקטרוני באמצעות פונקציית הייצוא שנמצאת בסעיף גיליון אלקטרוני של תוצאות .
  4. נווט את הסמן לנקודה שזוהתה בשלב הקודם ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי לבחור או לבטל את הבחירה. ניתן לבחור מספר פונקטה בו זמנית באמצעות Ctrl + לחיצה שמאלית.
    הערה: בהתאם למטרות הפרויקט וליישומים, ניתן להשתמש בהיוריסטיקה נוספת כדי לסנן את הפיסוק. לדוגמה, נקודות עם אורך חיים של פחות מ-8-10 שניות (4-5 פריימים) עשויות להיות מושמטות מכיוון שהן אינן מציגות מידע מספיק על כל אירוע הגדילה. הצורך בהיוריסטיקות כאלה ישתנה מבחינה אמפירית. פרטים נוספים על פונקציונליות התוכנה זמינים מהמחברים על פי בקשה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זבובים גודלו ממאגרים יציבים המבטאים באופן מכונן את הטרנסגן UAS-EB1-GFP באופן פאן-נוירוני (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 או בנוירונים חושיים (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1 נבחר למחקר זה מכיוון שהוא מתמקם באופן ספציפי בקצוות הגידול ומתנתק מיד עם הפסקה והתכווצות14,15 והוכח במחקרים מרובים, כולל בדרוזופילה 22,23,24,25,26,27,35

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה דן בפרוטוקול לביצוע הדמיה תוך-חיונית לא פולשנית של דינמיקת MT בדנדריטים וב-NMJ במהלך ההתפתחות. קלט אנושי נדרש במהלך שלבי הניסוי, כגון בבחירת בעלי חיים לתמונה, ועלול להכניס הטיה בתהליך איסוף הנתונים שלא ניתן להסיר באופן סביר. לפיכך, מטרה מרכזית של הפרוטוקול היא למזער הטיה במידת האפשר על ידי ביצוע ניתוח אוטומטי עם תוכנה חדשה (סעיף 5) שאופטימיזציה לטפל ביחס האות לרעש הנמוך הטמון בנתוני in vivo. חשוב לציין, האלגוריתמים ששימשו במחקר זה מאפשרים זיהוי חלקיקים מבוסס מכונה, יצירת קימוגרף ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הויין לאי, מייקל ג'ונס, הידקי ססאקי, לוצ'יאנו א.ג. לוקאס, סם אלוורת' (לשעבר) וג'יימס שי-ג'ונג לי הם עובדים של DRVision Technologies LLC, המייצרת את התוכנה המשמשת בפרוטוקול זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לעמיתינו במעבדת Van Vactor וב-DRVision בנוסף לד"ר מקס היימן, פסקל קייזר, דיוויד פלמן ותומאס שוורץ על דיון מועיל. אנו מודים לד"ר מליסה רולס על שסיפקה בנדיבות את ה-elaV-Gal4; כטב"ם-EB1-GFP; UAS-DCR2 ו-221-Gal4; מניות UAS-EB1-GFP ששימשו במחקר זה. אנו מודים לד"ר ג'ניפר ווטרס ואנה ג'וסט ממרכז ההדמיה של Nikon בהרווארד על המומחיות במיקרוסקופ אור. עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (F31 NS101756-03 ל-V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D ל-J.S.L).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לEppendorf21008-959הכנת מדגם
1000 ומיקרו; טיפים לפיפטה L TipOneUSA Scientific1111-2721הכנת דגימה
200 ומיקרו; L טיפ טיפ פיפטהארה"ב מדעי1120-8710הכנת דגימה
221-Gal4 זבוביםבלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר (ארה"ב)26259דרוזופילה גנטיקה/צלבים
60x עדשת אובייקטיביתNikonPlan Apo 60xרכישת תמונת
צלחת 6 בארותBD Falcon353224הכנת דגימה
AgarMoorAgar41084מזון דרוזופילה
AiviaDRVision LLCמותאם כחלק ממחקר זה
כלורופורם (מיוצב עם עמילנים)Sigma-AldrichC2432הכנת דגימה
אקדח נשיפה CO2 (לבחירת זבובים לצלבים)Genesee54-104גנטיקה של דרוזופילה / צלבים
CO2 מבעבע (לבחירת זבובים לצלבים)Genesee59-180גנטיקה/צלבים של דרוזופילה
מצלמת CCD מקוררתHamamatsuORCA-R2רכישת תמונה
קמח תירסGenesee62-101מזון דרוזופילה
מזוקקיםמזון דרוזופילה
סרט דו צדדיסקוטשהכנת מדגם
בקבוקוני דרוזופילהGenesee32-109מזון דרוזופילה
פקקי דרוסו (פקקי קצף לבקבוקונים)Genesee59-200מזון דרוזופילה
Dumont #5 Biologie Inox מלקחייםFine Science Tools11252-20הכנת דגימה
elaV-Gal4; כטב"ם-EB1-GFP; זבובי UAS-Dcr2מתנת גלילי מליסה (אוניברסיטת פן סטייט)N/Aגנטיקה של דרוזופילה / צלבים
אתנול (95%)VWR75811-022מזון דרוזופילה
סיבים אופטיים תאורה / מקור אור לסטריאומיקרוסקופNikonNI-150הכנת דגימה
Flypad (לבחירת זבובים לצלבים)Genesee59-172גנטיקה / צלבים של דרוזופילה
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898הכנת מדגם
שמן טבילהניקוןMXA22168רכישת תמונה
Kimwipe מגבונים עדיניםFisher Scientific34120הכנת מדגם
לייזר מיזוג מודולספקטרלי מחקר יישומיLMM-5מקור אור לרכישת תמונה
לומנקורקונפוקליSOLA 54-10021רכישת תמונה
MetaMorph מיקרוסקופיה אוטומציה & תוכנה לניתוח תמונהמולקולרייםרכישת תמונה
מיקרו כיסוי משקפיים, מרובעים, מס' 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205הכנת דגימה
מיקרוסקופ הפוך ממונע עם מערכת מיקוד מושלמתNikonTI-ND6-PFS-Sרכישת תמונה
במה ותריסים ממונעיםרכישת
תמונה Prescan IIIמספריים רב תכליתייםסקוטיMMM1428הכנת דגימה
לקסאלי הנסן784179032016 074170382839הכנת דגימה
מסנן אופטיChromaET480/40mרכישת תמונה
P1000 PipetmanGilsonF123602הכנת מדגם
P200 PipetmanGilsonהכנת F123601לדוגמא
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044הכנת מדגם
חומצה פרופיוניתפישרA258-500מזון דרוזופילה
יחידת סורק קונפוקלי דיסק מסתובבYokagawaCSU-X1רכישת תמונה
סטריאומיקרוסקופניקוןSMZ800Nהכנת דגימה
סוכר (סוכרוז)Genesee62-112מזון דרוזופילה
שקופית סופרפרוסטVWR48311-600הכנת מדגם
TegoseptGenesee20-258מזון דרוזופילה
UAS-dtacc-RNAi זבוביםמרכז המשאבים של וינה דרוזופילה (וינה, אוסטריה)VDRC-101439גנטיקה של דרוזופילה / צלבים
וזלין וזלין ג'לי נפטWB מייסוןDVOCB311003הכנת
דגימהWinsor & ניוטון מברשת ריג'נסי זהב 520, גודל 0סיכות5012000גנטיקה / צלבים של דרוזופילה
שמריםVWRטורולה שמרים IC90308580מזון דרוזופילה
מפצל קרן דיכרואי יוקוגאווהSemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5רכישת תמונה
שמן מים עבור מכשירים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rolls, M. M. Neuronal polarity in Drosophila: Sorting out axons and dendrites. Developmental Neurobiology. 71 (6), 419-429 (2011).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: Mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Lewis, T. L., Courchet, J., Polleux, F. Cell biology in neuroscience: Cellular and molecular mechanisms underlying axon formation, growth, and branching. Journal of Cell Biology. 202 (6), 837-848 (2013).
  4. Kandel, E. R. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialogue Between Genes and Synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  5. Turney, S. G., Lichtman, J. W. Chapter 11: Imaging Fluorescent Mice In Vivo Using Confocal Microscopy. Methods in Cell Biology. 89 (8), 309-327 (2008).
  6. McCann, C. M., Lichtman, J. W. In vivo imaging of presynaptic terminals and postsynaptic sites in the mouse submandibular ganglion. Developmental Neurobiology. 68 (6), 760-770 (2008).
  7. Turney, S. G., Walsh, M. K., Lichtman, J. W. In vivo imaging of the developing neuromuscular junction in neonatal mice. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1166-1176 (2012).
  8. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. Journal of Cell Biology. 128 (1-2), 139-155 (1995).
  9. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. Journal of Cell Biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  10. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  11. Tirnauer, J. S., Bierer, B. E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. Journal of Cell Biology. 149 (4), 761-766 (2000).
  12. Schwartz, K., Richards, K., Botstein, D. BIM1 encodes a microtubule-binding protein in yeast. Molecular Biology of the Cell. 8 (12), 2677-2691 (1997).
  13. Juwana, J. P., et al. EB/RP gene family encodes tubulin binding proteins. International Journal of Cancer. 81 (2), 275-284 (1999).
  14. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 309-322 (2008).
  15. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  16. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic Instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  17. Van De Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Rebollo, E., Karkali, K., Mangione, F., Martín-Blanco, E. Live imaging in Drosophila: The optical and genetic toolkits. Methods. 68 (1), 48-59 (2014).
  19. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  20. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22 (4), 719-729 (1999).
  21. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Current Biology. 15 (7), 684-689 (2005).
  22. Rao, K., et al. Spastin, atlastin, and ER relocalization are involved in axon but not dendrite regeneration. Molecular Biology of the Cell. 27 (21), 3245-3256 (2016).
  23. Hill, S. E., et al. Development of dendrite polarity in Drosophila neurons. Neural Development. 7, 34(2012).
  24. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Molecular Biology of the Cell. 21 (5), 767-777 (2010).
  25. Mattie, F. J., et al. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Current Biology. 20 (24), 2169-2177 (2010).
  26. Stone, M. C., Roegiers, F., Rolls, M. M. Microtubules Have Opposite Orientation in Axons and Dendrites of Drosophila Neurons. Molecular Biology of the Cell. 19 (10), 4122-4129 (2008).
  27. Rolls, M. M., et al. Polarity and intracellular compartmentalization of Drosophila neurons. Neural Development. 2, 7(2007).
  28. Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. Journal of Neuroscience. 28 (49), 13094-13105 (2008).
  29. Merriam, E. B., et al. Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PLoS One. 6 (11), 27688(2011).
  30. Hu, X., et al. BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. Journal of Neuroscience. 31 (43), 15597-15603 (2011).
  31. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  32. Jaworski, J., et al. Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  33. Dent, E. W. Of microtubules and memory: Implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  34. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 198-205 (2007).
  35. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. Journal of Neuroscience. 28 (44), 11111-11123 (2008).
  36. Ruiz-Cañada, C., Budnik, V. Synaptic cytoskeleton at the neuromuscular junction. International Review of Neurobiology. 75 (6), 217-236 (2006).
  37. Bodaleo, F. J., Gonzalez-Billault, C. The presynaptic microtubule cytoskeleton in physiological and pathological conditions: lessons from Drosophila Fragile X syndrome and hereditary spastic paraplegias. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 60(2016).
  38. Applegate, K. T., et al. PlusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  39. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  40. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and Cellular Biology. 33 (8), 1528-1545 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  42. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  43. Ma, Y., Wang, X., Liu, H., Wei, L., Xiao, L. Recent advances in optical microscopic methods for single-particle tracking in biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4445-4463 (2019).
  44. Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
  45. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  46. Weickert, J. Coherence-Enhancing Diffusion Filtering. International Journal of Computer Vision. 31 (2-3), 111-127 (1999).
  47. Peset, I., Vernos, I. The TACC proteins: TACC-ling microtubule dynamics and centrosome function. Trends in Cell Biology. 18 (8), 379-388 (2008).
  48. Hood, F. E., Royle, S. J. Pulling it together. Bioarchitecture. 1 (3), 105-109 (2011).
  49. Lucaj, C. M., et al. Xenopus TACC1 is a microtubule plus-end tracking protein that can regulate microtubule dynamics during embryonic development. Cytoskeleton. 72 (5), 225-234 (2015).
  50. Nwagbara, B. U., et al. TACC3 is a microtubule plus end-tracking protein that promotes axon elongation and also regulates microtubule plus end dynamics in multiple embryonic cell types. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3350-3362 (2014).
  51. Rutherford, E. L., et al. Xenopus TACC2 is a microtubule plus end-tracking protein that can promote microtubule polymerization during embryonic development. Molecular Biology of the Cell. 27 (20), 3013-3020 (2016).
  52. Chou, V. T., Johnson, S., Long, J., Vounatsos, M. dTACC restricts bouton addition and regulates microtubule organization at the Drosophila neuromuscular junction. Cytoskeleton. 77 (1-2), 4-15 (2019).
  53. Maiato, H., et al. Human CLASP1 Is an Outer Kinetochore Component that Regulates Spindle Microtubule Dynamics. Cell. 113 (7), 891-904 (2003).
  54. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs persistent growth in the cell interior , asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115, Pt 17 3527-3539 (2002).
  55. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  56. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  57. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2007).
  58. Berger, C., Renner, S., Lüer, K., Technau, G. M. The commonly used marker ELAV is transiently expressed in neuroblasts and glial cells in the Drosophila embryonic CNS. Developmental Dynamics. 236 (12), 3562-3568 (2007).
  59. Robinow, S., White, K. Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila melanogaster development. Journal of Neurobiology. 22 (5), 443-461 (1991).
  60. Parrish, J. Z., Kim, M. D., Lily, Y. J., Yuh, N. J. Genome-wide analyses identify transcription factors required for proper morphogenesis of Drosophila sensory neuron dendrites. Genes and Development. 20 (7), 820-835 (2006).
  61. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  62. Zhang, T., et al. Microtubule plus-end binding protein EB1 is necessary for muscle cell differentiation, elongation and fusion. Journal of Cell Science. 122 (9), 1401-1409 (2009).
  63. Yang, C., et al. EB1 and EB3 regulate microtubule minus end organization and Golgi morphology. Journal of Cell Biology. 216 (10), 3179-3198 (2017).
  64. Allison, A., Nunn, J. Effect of general anaesthetics on microtubules. Lancet. 292 (7582), 1326-1329 (1968).
  65. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (67), e3780(2012).
  66. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).
  67. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible neurotechnique cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (5), 451-461 (1999).
  68. Resh, M. D. Fatty acylation of proteins: New insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1451 (1), 1-16 (1999).
  69. Edwards, K. A., Demsky, M., Montague, R. A., Weymouth, N., Kiehart, D. P. GFP-moesin illuminates actin cytoskeleton dynamics in living tissue and demonstrates cell shape changes during morphogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 191 (1), 103-117 (1997).
  70. Riedl, J., et al. Lifeact a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  71. Dent, E. W., Kalil, K. Axon Branching Requires Interactions between Dynamic Microtubules and Actin Filaments. Journal of Neuroscience. 21 (24), 9757-9769 (2001).
  72. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. Journal of Cell Biology. 158 (1), 139-152 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DrosophilaEB1 GFPdTACCTime Lapse
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים