מאמר שיטה

חסימת זרימת הלימפה על ידי תפירת כלי לימפה אפילנט בעכברים

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61178

⸱

14 במאי 2020

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול לחסום את זרימת הלימפה על ידי תפירה כירורגית של כלי לימפה שונים מוצג.

תקציר

כלי הלימפה הם קריטיים בשמירה על איזון נוזל רקמות אופטימיזציה של ההגנה החיסונית על ידי הובלת אנטיגן, ציטוקינים, ותאים לתעלות הלימפה ניקוז (LNs). הפרעה של זרימת הלימפה היא שיטה חשובה בעת לימוד הפונקציה של כלי לימפה. כלי הלימפה האדמטיים האדיבים ממשטח הרגליים של המריין ועד לבלוטות הלימפה הפופוליליות (pLNs) מוגדרות היטב בשם המסלולים היחידים לניקוז הלימפה לתוך ה-pLNs. תפירת כלי לימפה שונים אלה יכולה למנוע באופן סלקטיבי את זרימת הלימפה ל-pLNs. שיטה זו מאפשרת הפרעה בזרימת הלימפה עם נזק מינימלי לתאי הלימפה הלימפה בpLN המתנקז, כלי הלימפה אפרנטיים, כמו גם כלי לימפה אחרים באזור. שיטה זו שימשה כדי ללמוד כיצד משפיע הלימפה venules אנדותל גבוה (HEV) וביטוי chemokine ב LN, ואיך הלימפה זורמת דרך רקמת שומן המקיפה את LN בהיעדר כלי לימפה פונקציונליים. עם ההכרה הגוברת בחשיבות של תפקוד הלימפה, שיטה זו תהיה יישומים רחבים יותר כדי לפענח עוד יותר את הפונקציה של כלי לימפה בוויסות microenvironment LN ותגובות חיסוניות.

מבוא

הארגון המרחבי של מערכת הלימפה מספק תמיכה מבנית ופונקציונלית כדי להסיר ביעילות נוגדנים נוזלים חוץ תאיים והובלה ותאים אנטיגן הצגת (APCs) ל- LNs ניקוז. כלי הלימפה הראשוניים (הנקראים גם נימי לימפה) חדירים מאוד בשל הצמתים הבין-תאיים הבלתי רציפים שלהם, המקלים על האיסוף היעיל של נוזלים, תאים וחומרים אחרים מהחללים החוץ-תאייםשמסביב 1. כלי הלימפה הראשוניים מתמזגים לאיסוף כלי לימפה, בעלי צמתים בין-תאיים הדוקים, קרום מרתף רציף וכיסוי שריר הלימפה. איסוף כלי לימפה אחראים על הובלת לימפה שנאספו ל-LNs המתנקז ובסופו של דבר חזרה לימפה למחזור2,3. כלי הלימפה הנאספים שהניעו את הלימפה לתוך ה-LN המתנקז הם כלי הלימפההאדירים 4,5,6,7. חסימה של כלי לימפה אפילנטיים יכול לחסום את זרימת הלימפה לתוך LNs, שהיא טכניקה שימושית בעת לימוד הפונקציה של זרימת הלימפה.

מחקרים קודמים הראו כי זרימת הלימפה ממלאת תפקיד משמעותי בהעברת אנטיגן וAPCs, כמו גם שמירה על הומוסטאזיס LN. זה מובן היטב כי APCs נגזר רקמות, מופעל בדרך כלל נדידה תאים דנדריטיים (DCs), לנסוע דרך כלי לימפה אפרנטיים LN כדי להפעיל תאי T8. הרעיון כי אנטיגן בצורה חופשית, כגון חיידקים או אנטיגן מסיס, באופן פסיבי לזרום עם הלימפה ל LN כדי להפעיל APCs תושב LN כבר צובר קבלהבעשור האחרון 9,10,11,12. אנטיגן בצורה חופשית נסיעה עם לימפה לקחת דקות לאחר הזיהום לנסוע LN, ואת הפעלת התא תושב LN עלולה להתרחש בתוך 20 דקות לאחר הגירוי. זה הרבה יותר מהר מאשר ההפעלה של מחשבי מחשבים נודדים, אשר לוקח יותר מ 8 שעות כדי להיכנס LN9 ניקוז. מלבד הובלת אנטיגן ליזום הגנה חיסונית, הלימפה נושאת גם ציטוקינות ו-DCs ל LN כדי לשמור על המיקרו-סביבה שלה, ולתמוך בהומפואוסטזיס של תאימערכת החיסון 13,14. בעבר, חסימת זרימת הלימפה על ידי תפירת כלי הלימפה afferent הוכיח כי הלימפה נדרשת כדי לשמור על פנוטיפ HEV הנדרש לתמיכה בתא T הומאוסטטי ותא B ביות LN15,16,17. CCL21 הוא צ'מוקין קריטי הכוון את מיקום תאי DC ו- T ב- LN8,18. חסימת זרימת הלימפה מפריעה לביטוי CCL21 ב- LN ועלולה להפריע למיקום תאי DC ו-T ו/או אינטראקציה ב- LN19. לכן, חסימת זרימת הלימפה יכולה במישרין או בעקיפין לחסום את הגישה אנטיגן / DC ל LN ניקוז על ידי שיבוש microenvironment LN המסדיר את התגובות החיסוניות ב LN. כדי לחקור טוב יותר את הפונקציה של זרימת הלימפה, פרוטוקול ניסיוני מוצג(איור 1) כדילחסום את זרימת הלימפה בעכברים על ידי תפירת כלי הלימפה אפרנטיים ממשטח הרגל לpLN. שיטה זו יכולה להיות טכניקה חשובה עבור מחקרים עתידיים על תפקוד הלימפה בתנאים בריאים ומחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל עבודת בעלי חיים צריכה להיות מאושרת על ידי ועדת האתיקה המוסדית והבריתית והטיפול בבעלי חיים.  זה ניתוח שלא הישרדות.

1. הכנת חומרים

  1. להכין 100 מ"ל של 70% אתנול על ידי ערבוב 70 מ"ל של 100% אתנול עם 30 מ"ל של מים סטריליים. Autoclave כל הכלים הכירורגיים לפני הניתוח ולשמור את הכלים ב 70% אתנול לפני ובמהלך הניתוח כדי לשמור על עיקור.
  2. הכן מערכת הזרקה.
    1. חתוך ~ 30 ס"מ של צינורות פוליאתילן (0.28 מ"מ קוטר). חבר את קצה מחט 30 G x 1/2 (מחט A) לקצה אחד של צינורות פוליאתילן. בזהירות לנתק עוד 30 G x 1/2 מחט (מחט B) ולחבר את הצד השבור לקצה השני של צינורות פוליאתילן.
    2. חבר מחט א' למזרק שחפת של מ"ל.
      הערה: עבור צינורות פוליאתילן זה, 1.6 ס"מ של נוזל בצינורות מתאים 1 μL20.
  3. להכין 10:1 קטמין / xylazine תערובת (10 מ"ג / מ"ל קטמין 1 מ"ג / מ"ל xylazine) בתמיסת מלח (bacteriostatic 0.9% [w / v] נתרן כלוריד). הכן את הפתרון באופן טרי לפני השימוש.

2. הכנת החיה לניתוח

הערה: השתמש בעכברים בגילאי 6-10 שבועות. ניתן להשתמש בעכברים ונקבה וזכרים. במחקר זה, 6-10 שבועות, C57BL /6 עכברים נקבה שימשו. שיטה זו יכולה להיות מותאמת זנים אחרים של עכברים.

  1. להנות את העכבר על ידי הזרקת 250 μL של תערובת קטמין / xylazine תוך-אפרטון. חכה עד שהעכבר ישן לגמרי. ודא שהעכבר לא יגיב לצביטת בהון כדי לזהות ההרמה מלאה.
  2. לגלח פרווה סביב הרגליים עם קוצץ שיער.
  3. מורחים את הקרם המשפיל סביב הרגל והמתינו 5 דקות. נגבו את הפרווה השיורית ואת הקרם המשפיל בעזרת רקמה לחה ונקי את הרגל במים סטריליים. לרסס 70% אתנול סביב הרגל כדי לחטא את אזור ההפעלה. האתנול מוגבל לאתר החתך.

3. תפירה כירורגית של כלי לימפה שונים

הערה: הרגל הימנית תופרת, והרגל השמאלית משמשת כפקד מזויף. פרוטוקול התפר הלימפה (שלבים 3.1-3.8) תיוו 20-30 דקות.

  1. שמור על העכבר בתנוחה נוטה ולתקן אותו עם סרט כירורגי כדי לחשוף את אזור הפעולה על הרגל הימנית.
  2. Intradermally להזריק 5 μL של 1% אוונס צבע כחול או 9 ס"מ של הנוזל של מערכת ההזרקה צינורות לתוך משטח הרגליים. לעסות בעדינות את משטח הרגליים כדי לעזור אוונס כחול להיכנס כלי הלימפה.
    הערה: מזרק האינסולין לא קל לשלוט עבור הזרקת נפח קטן. ניתן לשלוט בעוצמה בצורה מדויקת יותר באמצעות אפליקציית ההזרקה. כלי לימפה מדמיינת על ידי צבע כחול מתחת לעור. עם הכשרה מקיפה, ניתן לראות את שני כלי הלימפה האדירים בעין בלתי ככלי שקוף ברקמת השומן, במקביל לעורק הספני. עם הכשרה מקיפה, ניתן לתפור את כלי מבלי להזריק אוונס כחול צבע במקרים שבהם יש חששות של הפרעות פוטנציאליות מהצבע.
  3. תחת מיקרוסקופ לנתח, לבחור אתר חתך 5 מ"מ מהקצה התחתון של פוסה popliteal. עשה חתך קטן (~ 5 מ"מ) בעור עם מספריים. באמצעות מפסי פעולה עדינים, למתוח את החתך, ולחשוף את כלי הלימפה איסוף(איור 1A).
    הערה: במידת הצורך, ניתן להסיר שבר עור קטן כדי לחשוף את כלי הלימפה.
  4. זהה את שני כלי הלימפה האדיבים המובילים ל-pLNs תחת מיקרוסקופ הפירוק(איור 1B).
    הערה: ישנם שני כלי לימפה שונים מהמשטח עד pLN. שניהם צריכים להיות תפר כדי לחסום את זרימת הלימפה לחלוטין.
  5. באמצעות מחזיק מחט, בזהירות להכניס את מחט התפר (0.7 מטרי או קטן יותר) בין כלי הלימפה אפרנטי עורק Saphenous ולמשוך את המחט בעדינות סביב כלי הלימפה אפר. משוך בעדינות בחוט התפר והותיר כ-2 ס"מ של מיתר התפר מאחור. השתמש במחזיק המחט כדי לעזור לקשור את המחרוזת בחוזקה כדי לתפור כלי לימפה אחד עם קשר מנתח(איור 1C).
    הערה: הרקמה מתחת לחתך עלולה להתייבש עם חשיפה ממושכת לאוויר. הפיכת החתך קטן ככל האפשר וביצוע התפר במהירות (כלומר, בתוך 5 דקות) ימנע את הרקמה מתייבש. לשמור על לחות הרקמה על ידי החלת נפח קטן של תמיסת מלח עם ספוגית כותנה.
  6. לעסות בעדינות את משטח הרגליים כדי להבטיח שום צבע כחול אוונס עובר את אתר התפירה ולאחר מכן לחתוך את המחרוזת העודפת עם מספריים.
  7. לבצע את אותם שלבי תפר (כלומר, שלבים 3.5 ו- 3.6) על כלי הלימפה האדמטי האחר(איור 1D). סגור את חתך העור עם אותו תפר ששימש לתפירת כלי הדם בשלב 3.5(איור 1E).
  8. עבור שליטה בלוף, intradermally להזריק 5 μL של 1% אוונס צבע כחול על משטח הרגליים השמאלית לעסות את משטח הרגל כדי לדמיין את כלי הלימפה. לפתוח את העור עם חתך ולאחר מכן לסגור את הפצע מבלי לתפור את כלי(איור 1F).
  9. לחלופין, לפקח על העכברים המופעלים במשך 2-4 שעות. הצד התפור של הרגל צריך להראות בצקת עם אוונס כחול להתפשט לירך, בעוד רגל הבקרה תראה צבע כחול אוונס מוגבל במשטח הרגל. אם עכברים מתעוררים, תערובת קטמין/קסילאזין נוספת תוזרק כדי לשמור על ההמרמה עד המתת חסד.

4. מעקב אחר זרימת הלימפה

  1. מיד לאחר הניתוח, intradermally להזריק 10 μL של 2% פלואורסצ'ין isothiocyanate (FITC) במשטח הרגל של השליטה והרגל הלימפה תפר.
  2. המתת חסד העכברים עם 400 μL של תערובת קטמין / xylazine ולבצע נקע צוואר הרחם כאשר העכברים הם מותמים באופן מלא.
  3. לאסוף pLNs מן fossa popliteal ולהסיר בזהירות את רקמת שומן perinodal סביב pLNs תחת מיקרוסקופ הניתוק ב 2, 6, ו 12 שעות לאחר הזרקת FITC.
  4. הטבע את pLNs עם אזור הסינוס medullary פונה לצד cryomold בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)(איור 1G,H).
  5. הכן 20 μm חלקים קפואים באמצעות cryotome.
  6. תמונה cryosections תחת מיקרוסקופ confocal כדי לקבוע התפלגות FITC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תפר כלי הלימפה שימשבמחקרים קודמים 15,16,17,19,שם הוא שימש ככלי חשוב כדי ללמוד את הפונקציה של זרימת הלימפה לפני הביולוגיה המולקולרית של כלי הלימפה היה מובן טוב יותר. חסימת זרימת הלימפה מפריעה ל-LN הומאאוסטזיס, מה שמוביל לכך ש-HEVs מאבדת את ביטוי הגנים הקריטי הדרוש ללימפוציטיםאופטימליים ל-LN 15,16,17. מא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חסימת זרימת הלימפה יהיו יישומים רחבים במניפולציה אספקת אנטיגן ל LN בתנאים בריאים ומחלות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לשלוט בתזמון של אספקת אנטיגן על מנת ללמוד כיצד זרימת הלימפה רציפה מווסתת את התגובה החיסונית בניקוז LNs. שיטה זו של הפרעת זרימת הלימפה יכול לשמש גם כדי ללמוד כיצד לימפה משפיעה על מיבוד התא, הפעלת תאים, העברת תאים, ואינטראקציות תא ב LN.

עכברים המביעים במיוחד קולטן רעלן דיפתריה אנושי (DTR) בתאי אנדותל הלימפה שלהם(Flt4-cre-dtr)פותחו; אלה יכולים לשמש כדי לרוקן במיוחד כלי לימפה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחברים מודים לאווה זרדינז'אד על הגהה של כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR, PJT-156035) וקרן קנדה לחדשנות עבור SL (32930), ועל ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין עבור יוג'יה לין (81901576).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>0.9% נתרן כלורי מלוחבקסטרJB1323
<חזק>100% אתנולגרינפילדשירותי הפצה של האוניברסיטה הגלובלית של קלגרי UN1170.
<קרם מסיר שיער חזק>חזקNairNair פורמולה סגישה להסרת שיער Crè אני עם שמן שקדים מתוקים ושמן תינוקות, 200 מ"ל. או מוצר דומה.
Evans Blue dyeSigma Life ScienceE2129-10Gעבור 1 מ"ל של צבע כחול אוונס, יש להוסיף 0.1 גרם כחול אוונס ל-10 מ"ל PBS. תמיסת Evens Blue תסונן דרך מסננים של 0.22 מ"מ ותישמר סטרילית בכמות של 1 מ"ל.
<חזק>פלואורסצאין איזותיוציאנט I (FITC)סיגמא מדעי החייםF7250-1G
<חזק>מלקחיים דומונט #3WPI500337
<חזק>מלקחיים דומונט #5WPI500233
<חזק>מכשיר הזרקהחבר קצה אחד של צינורות פוליאתילן ל-30G ופעמים; ½ מחט. חבר מזרק של 1 מ"ל TB למחט. עקור את פיר המחט מעוד 30G ופעמים; ½ מחט. הכנס את הקצה הבוטה של ה-30G × ½ פיר מחט לקצה השני של הצינור. הקוטר הפנימי של צינור זה הוא 0.28 מ"מ. לפיכך, 1.6 ס"מ של נוזל בצינור הוא 1 μl.
<חזק>מזרק אינסוליןבקטון דיקינסון ושות' (BD)329461
<חזק>מלקחיים איריס ישרWPI15914
<מספריים חזקים>איריסWPI14218-G
<חזק>קטמיןנרקטןDIN 02374994הספקים של קטמין וקסילזין נמצאים בדרך כלל תחת רגולציה מוסדית וממשלתית.
<חזק>מחטים (26Gx3/8)בקטון דיקינסון ושות' (BD)305110
<חזק>מחטים (30Gx1/2)בקטון דיקינסון ושות' (BD)305106
<חזק>מחזיק מחט פאטוןROBOZRS6403ישר, ללא נעילה;
<חזקה>חוצצת פוספט (PBS)Sigma Life ScienceP4417-100TAB
<חזק>צינורות פוליאתילןבקטון דיקינסון ושות' (BD)427401
טרנספור1527-0
<חזק>סרט כירורגי (2.5 ס"מ על 9.1 מ')Transpore1527-1
<חזק>תפירהדייוויס וגק CYANAMID קנדה11/040.7 מונופילמנט מטרי פוליפרופילן
<חזק>מזרק (1 מ"ל)Becton Dickinson and Company (BD)309659
<חזק>VANNAS מספרייםמכשירי דיוק עולמיים (WPI)14122-G
XylazineRompunDIN02169606הספקים של קטמין וקסילזין נמצאים בדרך כלל תחת רגולציה מוסדית וממשלתית.
<חזק>ציוד
<חזק>מיקרוסקופ מנתחאולימפוסאולימפוס S261 (522-STS OH141791) עם מקור אור: Olympus Highlight 3100
<חזק>מיקרוסקופ קונפוקליLeicaSP8
תמיסת מלח משוננת

מקורות

  1. Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
  2. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
  3. Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
  4. Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
  5. Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
  6. Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
  7. Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
  8. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
  9. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
  10. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  11. Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
  12. Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
  13. Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
  14. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
  15. Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
  16. Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
  17. Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
  18. Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
  19. Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
  20. Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).
  21. Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
  22. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FITC

מאמרים קשורים