התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

סיכום

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

תקציר

הבידול העצבי של תאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) הוא כלי פוטנציאלי להבהיר את מנגנוני המפתח המעורבים נוירוגנזה ופוטנציאל לסייע ברפואה רגנרטיבית. כאן, הקמנו שיטה יעילה בעלות נמוכה עבור בידול עצבי מ mESCs במבחנה, באמצעות האסטרטגיה של הקרנה קומבינטורית. בתנאים המוגדרים כאן, היווצרות הגוף העוברי בן היומיים + פרוטוקול אינדוקציה של חומצה רטינואית למשך 6 ימים מאפשרת בידול מהיר ויעיל של MESCs לתאי מבשר עצביים (NPCs), כפי שניתן לראות על ידי היווצרות של A2lox מוערמים היטב דמויי נויריט ו -129 נגזרות שהן חיוביות של נסטין. המצב הבריא של גופים עובריים ואת נקודת הזמן שבה חומצה רטינואית (RA) מוחל, כמו גם ריכוזי RA, הם קריטיים בתהליך. בהבחנה הבאה מ NPCs לתוך נוירונים, N2B27 בינוני II (בתוספת מדיום Neurobasal) יכול לתמוך טוב יותר תחזוקה לטווח ארוך והתבגרות של תאים עצביים. השיטה המוצגת היא יעילה מאוד, בעלות נמוכה וקלה לתפעול, ויכולה להיות כלי רב עוצמה למחקר נוירוביולוגי וביולוגיה התפתחותית.

מבוא

תאי גזע עובריים (ESCs) הם פלוריפוטנטיים ויכולים להבדיל לתאי מבשר עצביים (NPCs) ולאחר מכן לנוירונים בתנאים מסוימים¹. נוירוגנזה מבוססת ESC מספקת את הפלטפורמה הטובה ביותר לחקות נוירוגנזה, ובכך לשמש כלי שימושי למחקרים ביולוגיים התפתחותיים וסיוע פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית^2,3. בעשורים האחרונים, אסטרטגיות רבות דווחו על גרימת נוירוגנזה עוברית, כגון השיטה הטרנסגנית⁴, באמצעות מולקולות קטנות⁵, באמצעות microenvironment מטריצה 3D⁶, ואת טכניקת תרבות משותפת⁷. עם זאת, רוב הפרוטוקולים האלה הם גם תנאי מוגבל או קשה לתפעול, ולכן הם אינם מתאימים לשימוש ברוב המעבדות.

כדי למצוא שיטה קלה לתפעול ועלות נמוכה להשגת בידול עצבי יעיל מ- mESCs, נעשה כאן שימוש באסטרטגיית סינון קומבינטורית. כפי שמתואר באיור 1, כל התהליך של נוירוגנזה עוברית חולק לשני שלבים. שלב I מתייחס לתהליך הבידול מ- mESCs ל- NPCs, והשלב השני מתייחס להבחנה הבאה מ- NPCs לנוירונים. בהתבסס על עקרונות הפעולה הקלה, עלות נמוכה, חומרים זמינים בקלות ויעילות בידול גבוהה, שבעה פרוטוקולים בשלב I ושלושה פרוטוקולים בשלב II נבחרו על סמך מערכת התרבות המונולאייה המסורתית או מערכת היווצרות הגוף העוברי^8,9. יעילות הבידול של פרוטוקולים בשני השלבים הוערכה באמצעות תצפית מורפולוגיה של התא ומבחן כשל חיסוני. באמצעות שילוב הפרוטוקול היעיל ביותר של כל שלב, הקמנו את השיטה האופטימלית לבידול עצבי מ- mESCs.

פרוטוקול

1. תרבות תאי גזע עובריים של עכבר

1. הכינו 0.1% מנות או צלחות של תרביות תאים מצופות ג'לטין.
   1. הוסיפו 2 מ"ל של ג'לטין מעוקר 0.1% (0.1% w/v במים) למנות תרבית תאים 60 מ"מ. רוק בעדינות כדי להבטיח אפילו ציפוי של מנות תרבות התא.
   2. שים את הכלים לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר ציפוי במשך 1 שעה.
   3. הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% לפני זריעת התאים.
      הערה: לאחר הסרת הג'לטין, אין צורך לייבש או לשטוף את הכלים המצופה.
2. תאי גזע עובריים של עכבר (A2lox ו-129) תרבות
   1. דגירה mESCs (A2lox ו 129) תאים ב 0.1% ג'לטין מצופה 60 מ"מ כלי תרבות התא במדיום צמיחה mESC ב 37 °C (79 °F) ב 5% CO₂ חממה, בהתאמה. מדיום הצמיחה mESC מורכב 85% נוקאאוט DMEM/F12, 15% החלפת סרום נוקאאוט (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 1000 U/mL גורם מעכב לוקמיה (LIF), 10 nM CHIR-99021 (מעכב GSK-3) ו 0.33 ננומטר PD0325901 (מעכב MEK).
      התראה: β-מרקפטותנול הוא דליק ויש לו רעילות שאיפה. יש להרחיק ממקורות אש ולחבוש מסכה כדי למנוע שאיפה בעת השימוש.
   2. שנה את מדיום הצמיחה mESC מדי יום לצמיחה טובה יותר של A2lox ו 129.
   3. כאשר התאים מגיעים 80% מפגש, להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1% טריפסין למנה. בעדינות רוק במשך 30 s כדי להבטיח אפילו כיסוי של טריפסין על כל התאים.
   4. השאר את התאים במשך כ 1 דקות כדי לנסותize ולאחר מכן להסיר את טריפסין באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
   5. הוסף 2 מ"ל של מדיום צמיחה mESC למנה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להפוך את השעיית תא יחיד.
   6. לספור את הצפיפות של התאים בהשעיה במדויק ככל האפשר באמצעות hemocytometer.
   7. חלק את התאים ל- 7 קבוצות ו לגרום לבידול באמצעות פרוטוקולים שונים המוצגים בטבלה 1.

2. בידול מ- MESCs ל- NPCs (שלב I)

1. מכינים 0.1% צלחות תרבית תאים מצופות ג'לטין או כיסויים.
   1. לפני השימוש, להכין 0.1% ג'לטין מצופה 6-well צלחות או coverslips כמו בשלב 1.1.
2. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 1 (טבלה 1)
   1. זרעים על 2 x 10⁴ mESCs ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל באר 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ.
   2. דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO₂ אינקובטור עבור 6 שעות כדי לאפשר התקשרות.
   3. לאחר ההחזקה, להוציא את התאים מן האינקובטור, ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.
   4. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I(טבלה 1)לכל באר ומחזירים את התאים לאינקובטור.
   5. השאירו את התאים לבידול במשך 8 ימים. החלף את מדיום הבידול הבסיסי אני כל יומיים.
3. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 2 (טבלה 1)
   1. הוסף 1.5 x 10⁶ mESCs לתוך צלחת חיידקית nonadhesive ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי ב 37 °C (79 °F) באינקובטור 5% CO_2.
   2. לאחר יומיים, להעביר אגרגטים תא לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.
   3. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend הגופים העובריים. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים.
   4. בדקו את היווצרות הגופים העובריים מתחת למיקרוסקופ (איור 2A).
   5. לאסוף גופים עובריים כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3. זרעים על 50 גופים עובריים ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.
   6. הכינו מלאי RA כל-טרנס של 1 מ"מ (ב-DMSO) וחסנו הרחק מהאור במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחר אריזת משנה.
      הערה: RA אינו יציב, ויש להקדיש תשומת לב כדי להרחיק אותו מאור ולצמצם מגע אוויר במהלך הכנת מלאי RA.
   7. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.
   8. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 4 ימים.
   9. לשנות את כל 2 מ"ל של בינוני בידול בסיסי I (עם 1 μM RA) כל 2 ימים.
4. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (טבלה 1)
   1. צמח 1.5 x 10^{6 mESCs} לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I. להשאיר במשך 2 ימים להיווצרות גוף עוברי ב 37 °C (69 °F) באינקובטור 5% CO_2.
   2. בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ (איור 2B).
   3. להעביר צבירות תאים לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.
   4. הסר את supernatant בזהירות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend אותם.
   5. זרעים על 50 גופים עובריים לתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.
   6. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.
   7. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 6 ימים. שנה את כל מדיום הבידול הבסיסי I (עם 1 מיקרומטר RA) כל 2 ימים.
5. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 4 (טבלה 1)
   1. זרעים על 2 x 10⁴ mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
   2. לאחר הקובץ המצורף, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 4 ימים באינקובטור 5% CO₂ ב 37 °C (69 °F).
   3. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר (ריכוז העבודה הוא 1 מיקרומטר) כדי לגרום לבידול עוד 4 ימים.
   4. בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.
6. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 5 (טבלה 1)
   1. זרעים על 2 x 10⁴ mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
   2. לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 2 ימים באינקובטור 5% CO₂ ב 37 °C (69 °F).
   3. עבור אינדוקציה RA הבאים, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של μM 1. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לגרום לבידול עוד 6 ימים.
   4. בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.
7. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 6 (טבלה 1)
   1. צמח 1.5 x 10^{6 mESCs} לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של N2B27 בינוני II (טבלה 1) כדי לאפשר היווצרות גופים עובריים.
   2. ביום^השני, לאסוף את צבירות התא כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3 ולהזרים מחדש את הגופים העובריים באמצעות 10 מ"ל של N2B27 בינוני II טרי.
   3. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים באינקובטור 5% CO₂ ב 37 °C (69 °F). בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ.
   4. ביום הרביעי, לאסוף גופות עובריות. זרעים על 50 גופים עובריים לכל באר על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות עם 2 מ"ל של N2B27 בינוני II.
   5. הוסף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר ולגרום בידול עוד 4 ימים. החלף את המדיום כולו (N2B27 בינוני II עם 1 μM RA) כל יומיים.
8. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 7 (טבלה 1)
   1. זרעים על 2 x 10⁴ mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
   2. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של N2B27 בינוני II לכל באר ולאפשר בידול במשך 8 ימים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO₂ חממה.
   3. שנה את כל המדיום II של N2B27 כל יומיים.

3. התבוננות במורפולוגיה של התא

1. בדוק את מצב הבידול של 7 הקבוצות שהוזכרו לעיל מדי יום תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוך.
2. בחר באופן אקראי לפחות 12 שדות וצלם תמונות כדי לתעד את השינויים המורפולוגיים של כל קבוצה ב- D8.

4. כתמי כשל חיסוני

1. הכנה לדוגמה: זרעי mESCs על 0.1% כריכות מצופות ג'לטין ולאפשר בידול במשך 8 ימים באמצעות הפרוטוקולים שהוזכרו בשלב 2.
2. לשטוף: ביום^8, לקחת את הדגימות מן האינקובטור ולהסיר את מדיום הבידול על ידי שאיפה. יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת ב-1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
3. קיבוע: להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde לכל מדגם ולתקן את התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. לשטוף: לאחר קיבעון, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.
5. חדירה: להוסיף 1 מ"ל של 0.2% TritonX-100 ב PBS לכל מדגם ולהשאיר במשך 8 דקות ב RT.
6. לשטוף: לאחר חדירה, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.
7. חסימה: הוסף 1 מ"ל של סרום עזים 10% ב- PBS לכל מדגם ודגירה ב- RT למשך שעה אחת כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות.
8. דגירה עם נוגדן ראשוני
   1. לדלל את הנוגדן אנטי נסטין ביחס של 1:100 באמצעות 5% סרום עזים ב PBS.
   2. החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
9. לשטוף: להסיר את הנוגדן ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.
10. דגירה עם נוגדן משני
    1. לדלל את אלקסה פלואור 488-שכותרתו עז נגד עכבר IgG ביחס של 1:500 באמצעות 5% סרום עזים ב- PBS.
    2. החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה בחושך במשך 2 שעות ב RT.
       הערה: לאחר החלת נוגדן משני פלואורסצנטי, בצע את כל השלבים הבאים בחושך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.
11. לשטוף: להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.
12. כתמים גרעיניים והרכבה
    1. הנח טיפה אחת של מדיום הרכבה DAPI על המיקרו-מפולת הנקייה.
    2. בזהירות להוציא את הדגימות מן הצלחות ומניחים את המדגם על גבי המדיום הרכבה DAPI עם התא עם הפנים כלפי מטה. השאירו בחושך במשך 5 דקות ב- RT.
    3. הסר מדיום הרכבה עודף של DAPI עם נייר סופג.
13. תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית
    1. מניחים את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות את האות עבור DAPI ואלכסה פלואור 488 באמצעות מסננים נאותים.
    2. בחר באופן שווה ואקראי 10-15 שדות חזותיים שונים עבור כל דגימה והקלט את התמונות במצלמת CCD.

5. בידול מ- NPCs לנוירונים (שלב II)

1. הכן נגזרות mESC תחת בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (8 ימים, טבלה 1) כמפורט בשלב 2.4, בעל יעילות הבידול הגבוהה ביותר (ראה איור 3).
   הערה: לאחר שלב I בידול, בקרת איכות צריכה להתבצע באמצעות תצפית מורפולוגיה התא ו immunofluorescence הבדיקה שהוזכרו לעיל, כדי להבטיח NPCs בריא ותשואה גבוהה.
2. זרעים על 5 x 10⁵ נגזרות mESC בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. חלק באופן אקראי את נגזרות mESC ל- 3 קבוצות, כפרוטוקול שלב II 1, פרוטוקול 2 ופרוטוקול 3, בהתאמה.
3. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO₂ אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות. לשטוף אותם פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.
4. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני I, N2B27 בינוני I ו N2B27 בינוני II(טבלה 2),בהתאמה, לכל באר של הקבוצות לעיל.
5. מניחים את הצלחות לתוך האינקובטור ולאפשר להבדיל עוד 10 ימים. שנה את המדיום המתאים כל יומיים.
6. בדוק את מצב הבידול ותעד את השינויים המורפולוגיים כאמור בשלב 3.
7. ביום 18, להעריך את הדור של נוירונים (β-Tubulin השלישי חיובי) ולקבוע את יעילות הבידול של 3 פרוטוקולים באמצעות בשלב 4.

תוצאות

היווצרות גוף עוברי של יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים פועלת בצורה הטובה ביותר על בימוי הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I). כדי לקבוע את הפרוטוקול האופטימלי המקדם בצורה הטובה ביותר את הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I), 7 פרוטוקולים נבדקו הן על A2lox ו 129 mESCs (טבלה 1) ואת מצב הבידול של כל קבוצה היה במעקב באמצעות מיקרוסקופ אור. כפי שמוצג באיור 3A, רוב נגזרות A2lox ו-129 תחת טיפול "היווצרות גוף עוברי בן יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים" (שלב I-protocol 3) הראו מורפולוגיות מוערמ...

דיון

במחקר הנוכחי, הקמנו שיטה פשוטה ויעילה עבור בידול עצבי מ mESCs, עם עלות נמוכה וחומרים שהושגו בקלות. בשיטה זו, 2 ימים של היווצרות הגוף העוברי ואחריו 6 ימים של אינדוקציה RA יכול לקדם ביעילות את הבידול של mESCs לתוך NPCs (שלב I-פרוטוקול 3). עבור הבידול שלב II, N2B27 בינוני II (שלב II-פרוטוקול 3) ביעילות רבה לגרום את ההבחנה מ NPCs לתוך נוירונים. כדי להבטיח הצלחה, יש להקדיש תשומת לב רבה יותר למספר שלבים קריטיים.

ראשית, המצב הבריא של גופים עובריים הוא המפתח לכל תהליך הבידול. היווצרות גוף עוברי תלת מי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן נגד נסטין [Rat-401]	Abcam	Ab11306	מאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של
נוגדן אנטי-&בטא;-טובולין III המיוצר בארנב	סיגמא אולדריץ'	T2200	המאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית Alexa
Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	מאוחסן ב-20 מעלות; C והגנה מפני
תוסף B-27 קל (50X),	Gibco		17504044 מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, ולהגן מפני אור
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהגן מפני אור
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
סרום בקר עוברי	HyClone	SH30084.03	מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית	אולימפוס	CKX53
ג'לטין	ג'יבקו	CM0635B	מאוחסן בטמפרטורת החדר
תוסף GlutaMAX	ג'יבקו	35050061	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
מאגר דילול נוגדנים ראשוני צביעת אימונול	Beyotime	P0103	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	מאוחסן ב-4 מעלות;
החלפת סרום C KnockOut	Gibco	10828028	מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית
גורם מעכב לוקמיה	סיגמא	L5283	אנושי המאוחסן ב-20 מעלות;
מדיום הרכבה C עם DAPI - מימי, Fluoroshield	Abcam	ab104139	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C ולהגן מפני
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM	Gibco	11140076	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות;
תוסף C N-2 (100X)	Gibco	17502048	מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהגן מפני
אור סרום עיזים רגיל	Jackson	005-000-121	מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
Neurobasal בינוני	Gibco	21103049	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
צלחת חיידקים לא דביקה	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין	HyClone	SV30010	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	מאוחסן ב-20 מעלות; C
חומצה רטינואית	Sigma	R2625	מאוחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות; C ולהגן מפני
תאי גזע עובריים של עכבר מזן 129	Cyagen	MUAES-01001	מתוחזק במערכת תרבית ללא מזין
Stem-Cellbanker (ללא DMSO)	ZENOAQ	גזע Cellbanker ללא DMSO	מאוחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של
תמיסת טריפסין 0.25% (1X)	HyClone	SH30042.01	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C ולהגן מפני אור
4% פרפורמלדהיד	Beyotime	P0098	מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
6 - צלחת באר	קורנינג	3516
צלחת תרבית תאים 60 מ"מ	קורנינג	430166
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	NUNC	339650