הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61190

⸱

2 ביוני 2020

 , 
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

תקציר

הבידול העצבי של תאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) הוא כלי פוטנציאלי להבהיר את מנגנוני המפתח המעורבים נוירוגנזה ופוטנציאל לסייע ברפואה רגנרטיבית. כאן, הקמנו שיטה יעילה בעלות נמוכה עבור בידול עצבי מ mESCs במבחנה, באמצעות האסטרטגיה של הקרנה קומבינטורית. בתנאים המוגדרים כאן, היווצרות הגוף העוברי בן היומיים + פרוטוקול אינדוקציה של חומצה רטינואית למשך 6 ימים מאפשרת בידול מהיר ויעיל של MESCs לתאי מבשר עצביים (NPCs), כפי שניתן לראות על ידי היווצרות של A2lox מוערמים היטב דמויי נויריט ו -129 נגזרות שהן חיוביות של נסטין. המצב הבריא של גופים עובריים ואת נקודת הזמן שבה חומצה רטינואית (RA) מוחל, כמו גם ריכוזי RA, הם קריטיים בתהליך. בהבחנה הבאה מ NPCs לתוך נוירונים, N2B27 בינוני II (בתוספת מדיום Neurobasal) יכול לתמוך טוב יותר תחזוקה לטווח ארוך והתבגרות של תאים עצביים. השיטה המוצגת היא יעילה מאוד, בעלות נמוכה וקלה לתפעול, ויכולה להיות כלי רב עוצמה למחקר נוירוביולוגי וביולוגיה התפתחותית.

מבוא

תאי גזע עובריים (ESCs) הם פלוריפוטנטיים ויכולים להבדיל לתאי מבשר עצביים (NPCs) ולאחר מכן לנוירונים בתנאים מסוימים1. נוירוגנזה מבוססת ESC מספקת את הפלטפורמה הטובה ביותר לחקות נוירוגנזה, ובכך לשמש כלי שימושי למחקרים ביולוגיים התפתחותיים וסיוע פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית2,3. בעשורים האחרונים, אסטרטגיות רבות דווחו על גרימת נוירוגנזה עוברית, כגון השיטה הטרנסגנית4, באמצעות מולקולות קטנות5, באמצעות microenvironment מטריצה 3D6, ואת טכניקת תרבות משותפת7. עם זאת, רוב הפרוטוקולים האלה הם גם תנאי מוגבל או קשה לתפעול, ולכן הם אינם מתאימים לשימוש ברוב המעבדות.

כדי למצוא שיטה קלה לתפעול ועלות נמוכה להשגת בידול עצבי יעיל מ- mESCs, נעשה כאן שימוש באסטרטגיית סינון קומבינטורית. כפי שמתואר באיור 1, כל התהליך של נוירוגנזה עוברית חולק לשני שלבים. שלב I מתייחס לתהליך הבידול מ- mESCs ל- NPCs, והשלב השני מתייחס להבחנה הבאה מ- NPCs לנוירונים. בהתבסס על עקרונות הפעולה הקלה, עלות נמוכה, חומרים זמינים בקלות ויעילות בידול גבוהה, שבעה פרוטוקולים בשלב I ושלושה פרוטוקולים בשלב II נבחרו על סמך מערכת התרבות המונולאייה המסורתית או מערכת היווצרות הגוף העוברי8,9. יעילות הבידול של פרוטוקולים בשני השלבים הוערכה באמצעות תצפית מורפולוגיה של התא ומבחן כשל חיסוני. באמצעות שילוב הפרוטוקול היעיל ביותר של כל שלב, הקמנו את השיטה האופטימלית לבידול עצבי מ- mESCs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות תאי גזע עובריים של עכבר

  1. הכינו 0.1% מנות או צלחות של תרביות תאים מצופות ג'לטין.
    1. הוסיפו 2 מ"ל של ג'לטין מעוקר 0.1% (0.1% w/v במים) למנות תרבית תאים 60 מ"מ. רוק בעדינות כדי להבטיח אפילו ציפוי של מנות תרבות התא.
    2. שים את הכלים לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר ציפוי במשך 1 שעה.
    3. הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% לפני זריעת התאים.
      הערה: לאחר הסרת הג'לטין, אין צורך לייבש או לשטוף את הכלים המצופה.
  2. תאי גזע עובריים של עכבר (A2lox ו-129) תרבות
    1. דגירה mESCs (A2lox ו 129) תאים ב 0.1% ג'לטין מצופה 60 מ"מ כלי תרבות התא במדיום צמיחה mESC ב 37 °C (79 °F) ב 5% CO2 חממה, בהתאמה. מדיום הצמיחה mESC מורכב 85% נוקאאוט DMEM/F12, 15% החלפת סרום נוקאאוט (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 1000 U/mL גורם מעכב לוקמיה (LIF), 10 nM CHIR-99021 (מעכב GSK-3) ו 0.33 ננומטר PD0325901 (מעכב MEK).
      התראה: β-מרקפטותנול הוא דליק ויש לו רעילות שאיפה. יש להרחיק ממקורות אש ולחבוש מסכה כדי למנוע שאיפה בעת השימוש.
    2. שנה את מדיום הצמיחה mESC מדי יום לצמיחה טובה יותר של A2lox ו 129.
    3. כאשר התאים מגיעים 80% מפגש, להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1% טריפסין למנה. בעדינות רוק במשך 30 s כדי להבטיח אפילו כיסוי של טריפסין על כל התאים.
    4. השאר את התאים במשך כ 1 דקות כדי לנסותize ולאחר מכן להסיר את טריפסין באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
    5. הוסף 2 מ"ל של מדיום צמיחה mESC למנה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להפוך את השעיית תא יחיד.
    6. לספור את הצפיפות של התאים בהשעיה במדויק ככל האפשר באמצעות hemocytometer.
    7. חלק את התאים ל- 7 קבוצות ו לגרום לבידול באמצעות פרוטוקולים שונים המוצגים בטבלה 1.

2. בידול מ- MESCs ל- NPCs (שלב I)

  1. מכינים 0.1% צלחות תרבית תאים מצופות ג'לטין או כיסויים.
    1. לפני השימוש, להכין 0.1% ג'לטין מצופה 6-well צלחות או coverslips כמו בשלב 1.1.
  2. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 1 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל באר 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ.
    2. דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 אינקובטור עבור 6 שעות כדי לאפשר התקשרות.
    3. לאחר ההחזקה, להוציא את התאים מן האינקובטור, ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.
    4. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I(טבלה 1)לכל באר ומחזירים את התאים לאינקובטור.
    5. השאירו את התאים לבידול במשך 8 ימים. החלף את מדיום הבידול הבסיסי אני כל יומיים.
  3. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 2 (טבלה 1)
    1. הוסף 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית nonadhesive ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי ב 37 °C (79 °F) באינקובטור 5% CO2.
    2. לאחר יומיים, להעביר אגרגטים תא לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.
    3. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend הגופים העובריים. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים.
    4. בדקו את היווצרות הגופים העובריים מתחת למיקרוסקופ (איור 2A).
    5. לאסוף גופים עובריים כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3. זרעים על 50 גופים עובריים ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.
    6. הכינו מלאי RA כל-טרנס של 1 מ"מ (ב-DMSO) וחסנו הרחק מהאור במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחר אריזת משנה.
      הערה: RA אינו יציב, ויש להקדיש תשומת לב כדי להרחיק אותו מאור ולצמצם מגע אוויר במהלך הכנת מלאי RA.
    7. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.
    8. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 4 ימים.
    9. לשנות את כל 2 מ"ל של בינוני בידול בסיסי I (עם 1 μM RA) כל 2 ימים.
  4. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (טבלה 1)
    1. צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I. להשאיר במשך 2 ימים להיווצרות גוף עוברי ב 37 °C (69 °F) באינקובטור 5% CO2.
    2. בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ (איור 2B).
    3. להעביר צבירות תאים לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.
    4. הסר את supernatant בזהירות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend אותם.
    5. זרעים על 50 גופים עובריים לתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.
    6. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.
    7. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 6 ימים. שנה את כל מדיום הבידול הבסיסי I (עם 1 מיקרומטר RA) כל 2 ימים.
  5. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 4 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
    2. לאחר הקובץ המצורף, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 4 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).
    3. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר (ריכוז העבודה הוא 1 מיקרומטר) כדי לגרום לבידול עוד 4 ימים.
    4. בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.
  6. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 5 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
    2. לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).
    3. עבור אינדוקציה RA הבאים, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של μM 1. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לגרום לבידול עוד 6 ימים.
    4. בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.
  7. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 6 (טבלה 1)
    1. צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של N2B27 בינוני II (טבלה 1) כדי לאפשר היווצרות גופים עובריים.
    2. ביוםהשני, לאסוף את צבירות התא כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3 ולהזרים מחדש את הגופים העובריים באמצעות 10 מ"ל של N2B27 בינוני II טרי.
    3. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F). בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ.
    4. ביום הרביעי, לאסוף גופות עובריות. זרעים על 50 גופים עובריים לכל באר על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות עם 2 מ"ל של N2B27 בינוני II.
    5. הוסף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר ולגרום בידול עוד 4 ימים. החלף את המדיום כולו (N2B27 בינוני II עם 1 μM RA) כל יומיים.
  8. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 7 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
    2. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של N2B27 בינוני II לכל באר ולאפשר בידול במשך 8 ימים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 חממה.
    3. שנה את כל המדיום II של N2B27 כל יומיים.

3. התבוננות במורפולוגיה של התא

  1. בדוק את מצב הבידול של 7 הקבוצות שהוזכרו לעיל מדי יום תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוך.
  2. בחר באופן אקראי לפחות 12 שדות וצלם תמונות כדי לתעד את השינויים המורפולוגיים של כל קבוצה ב- D8.

4. כתמי כשל חיסוני

  1. הכנה לדוגמה: זרעי mESCs על 0.1% כריכות מצופות ג'לטין ולאפשר בידול במשך 8 ימים באמצעות הפרוטוקולים שהוזכרו בשלב 2.
  2. לשטוף: ביום8, לקחת את הדגימות מן האינקובטור ולהסיר את מדיום הבידול על ידי שאיפה. יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת ב-1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
  3. קיבוע: להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde לכל מדגם ולתקן את התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  4. לשטוף: לאחר קיבעון, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.
  5. חדירה: להוסיף 1 מ"ל של 0.2% TritonX-100 ב PBS לכל מדגם ולהשאיר במשך 8 דקות ב RT.
  6. לשטוף: לאחר חדירה, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.
  7. חסימה: הוסף 1 מ"ל של סרום עזים 10% ב- PBS לכל מדגם ודגירה ב- RT למשך שעה אחת כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות.
  8. דגירה עם נוגדן ראשוני
    1. לדלל את הנוגדן אנטי נסטין ביחס של 1:100 באמצעות 5% סרום עזים ב PBS.
    2. החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. לשטוף: להסיר את הנוגדן ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.
  10. דגירה עם נוגדן משני
    1. לדלל את אלקסה פלואור 488-שכותרתו עז נגד עכבר IgG ביחס של 1:500 באמצעות 5% סרום עזים ב- PBS.
    2. החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה בחושך במשך 2 שעות ב RT.
      הערה: לאחר החלת נוגדן משני פלואורסצנטי, בצע את כל השלבים הבאים בחושך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.
  11. לשטוף: להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.
  12. כתמים גרעיניים והרכבה
    1. הנח טיפה אחת של מדיום הרכבה DAPI על המיקרו-מפולת הנקייה.
    2. בזהירות להוציא את הדגימות מן הצלחות ומניחים את המדגם על גבי המדיום הרכבה DAPI עם התא עם הפנים כלפי מטה. השאירו בחושך במשך 5 דקות ב- RT.
    3. הסר מדיום הרכבה עודף של DAPI עם נייר סופג.
  13. תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית
    1. מניחים את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות את האות עבור DAPI ואלכסה פלואור 488 באמצעות מסננים נאותים.
    2. בחר באופן שווה ואקראי 10-15 שדות חזותיים שונים עבור כל דגימה והקלט את התמונות במצלמת CCD.

5. בידול מ- NPCs לנוירונים (שלב II)

  1. הכן נגזרות mESC תחת בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (8 ימים, טבלה 1) כמפורט בשלב 2.4, בעל יעילות הבידול הגבוהה ביותר (ראה איור 3).
    הערה: לאחר שלב I בידול, בקרת איכות צריכה להתבצע באמצעות תצפית מורפולוגיה התא ו immunofluorescence הבדיקה שהוזכרו לעיל, כדי להבטיח NPCs בריא ותשואה גבוהה.
  2. זרעים על 5 x 105 נגזרות mESC בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. חלק באופן אקראי את נגזרות mESC ל- 3 קבוצות, כפרוטוקול שלב II 1, פרוטוקול 2 ופרוטוקול 3, בהתאמה.
  3. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות. לשטוף אותם פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.
  4. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני I, N2B27 בינוני I ו N2B27 בינוני II(טבלה 2),בהתאמה, לכל באר של הקבוצות לעיל.
  5. מניחים את הצלחות לתוך האינקובטור ולאפשר להבדיל עוד 10 ימים. שנה את המדיום המתאים כל יומיים.
  6. בדוק את מצב הבידול ותעד את השינויים המורפולוגיים כאמור בשלב 3.
  7. ביום 18, להעריך את הדור של נוירונים (β-Tubulin השלישי חיובי) ולקבוע את יעילות הבידול של 3 פרוטוקולים באמצעות בשלב 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היווצרות גוף עוברי של יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים פועלת בצורה הטובה ביותר על בימוי הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I). כדי לקבוע את הפרוטוקול האופטימלי המקדם בצורה הטובה ביותר את הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I), 7 פרוטוקולים נבדקו הן על A2lox ו 129 mESCs (טבלה 1) ואת מצב הבידול של כל קבוצה היה במעקב באמצעות מיקרוסקופ אור. כפי שמוצג באיור 3A, רוב נגזרות A2lox ו-129 תחת טיפול "היווצרות גוף עוברי בן יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים" (שלב I-protocol 3) הראו מורפולוגיות מוערמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר הנוכחי, הקמנו שיטה פשוטה ויעילה עבור בידול עצבי מ mESCs, עם עלות נמוכה וחומרים שהושגו בקלות. בשיטה זו, 2 ימים של היווצרות הגוף העוברי ואחריו 6 ימים של אינדוקציה RA יכול לקדם ביעילות את הבידול של mESCs לתוך NPCs (שלב I-פרוטוקול 3). עבור הבידול שלב II, N2B27 בינוני II (שלב II-פרוטוקול 3) ביעילות רבה לגרום את ההבחנה מ NPCs לתוך נוירונים. כדי להבטיח הצלחה, יש להקדיש תשומת לב רבה יותר למספר שלבים קריטיים.

ראשית, המצב הבריא של גופים עובריים הוא המפתח לכל תהליך הבידול. היווצרות גוף עוברי תלת מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31501099) ואת בגיל העמידה וצעיר של מחלקת החינוך של מחוז חוביי, סין (לא. רבעון 20191104). כמו כן, אנו מודים לפרופסור וונשנג דנג מאוניברסיטת ווהאן למדע וטכנולוגיה על שסיפק את קווי תאי הגזע העובריים של העכבר A2lox.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד נסטין [Rat-401]AbcamAb11306מאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של
נוגדן אנטי-&בטא;-טובולין III המיוצר בארנבסיגמא אולדריץ'T2200המאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית Alexa
Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgGBeyotimeA0428מאוחסן ב-20 מעלות; C והגנה מפני
תוסף B-27 קל (50X),Gibco17504044 מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, ולהגן מפני אור
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
CoverslipsNEST801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0516מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהגן מפני אור
DME/F-12 1:1 (1x)HyCloneSH30023.01Bמאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
סרום בקר עובריHyCloneSH30084.03מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות
מיקרוסקופיה פלואורסצנטיתאולימפוסCKX53
ג'לטיןג'יבקוCM0635Bמאוחסן בטמפרטורת החדר
תוסף GlutaMAXג'יבקו35050061מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
מאגר דילול נוגדנים ראשוני צביעת אימונולBeyotimeP0103מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
KnockOut DMEM/F-12Gibco12660012מאוחסן ב-4 מעלות;
החלפת סרום C KnockOutGibco10828028מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית
גורם מעכב לוקמיהסיגמאL5283אנושי המאוחסן ב-20 מעלות;
מדיום הרכבה C עם DAPI - מימי, FluoroshieldAbcamab104139מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C ולהגן מפני
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEMGibco11140076מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות;
תוסף C N-2 (100X)Gibco17502048מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהגן מפני
אור סרום עיזים רגילJackson005-000-121מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
Neurobasal בינוניGibco21103049מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
צלחת חיידקים לא דביקהCorning3262
Phosphate Buffered Saline (1X)HyCloneSH30256.01Bמאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
תמיסת פניצילין/סטרפטומיציןHyCloneSV30010מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
PD0325901(Mirdametinib)SelleckS1036מאוחסן ב-20 מעלות; C
חומצה רטינואיתSigmaR2625מאוחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות; C ולהגן מפני
תאי גזע עובריים של עכבר מזן 129CyagenMUAES-01001מתוחזק במערכת תרבית ללא מזין
Stem-Cellbanker (ללא DMSO)ZENOAQגזע Cellbanker ללא DMSOמאוחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של
תמיסת טריפסין 0.25% (1X)HyCloneSH30042.01מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
Triton X-100SigmaT8787
2-MercaptoethanolGibco21985023מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C ולהגן מפני אור
4% פרפורמלדהידBeyotimeP0098מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
6 - צלחת בארקורנינג3516
צלחת תרבית תאים 60 מ"מקורנינג430166
צינור צנטריפוגה 15 מ"לNUNC339650
ללא סרום של קלה קל

מקורות

  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
  3. Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
  4. Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
  5. Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
  6. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
  7. Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
  8. Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
  9. Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823(2015).
  10. Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486(2020).
  11. Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
  12. Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57(2009).
  13. Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
  14. Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
  15. Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
  16. Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953(2017).
  17. Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
  18. Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
  19. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  20. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174(2011).
  21. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

יצירת גופים עוברייםהשראה באמצעות חומצה רטינואיתתאי קדמון עצבייםמצע N2B27בדיקת אימונופלואורסצנציהתאים חיוביים ל-NestinBeta Tubulin Threeפלטות מצופות ג'לטין
התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.