מאמר שיטה

סינון ישיר של תרבית נוזלית להערכת ייצור חלבונים הטרולוגיים באמצעות מוטציה אוקסוטרופית של Aspergillus oryzae

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61219

⸱

12 במאי 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

במאמר זה

סיכום

פותחה שיטת סינון של תרבית נוזלית ישירה (DLC) המפחיתה משמעותית את הזמן הנדרש לטרנספורמציה של פרוטופלסט בתיווך פוליאתילן גליקול (PEG) של הפטרייה החוטית, Aspergillus oryzae, כאשר היא משמשת להערכת ייצור ההפרשה של חלבונים הטרולוגיים. שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את התפוקה של פרוטוקול ההערכה.

תקציר

Aspergillus oryzae, פטרייה חוטית, היא אחד המארחים הנפוצים ביותר ליישומים תעשייתיים, כולל ייצור חלבונים בקנה מידה גדול. שיטת טרנספורמציה של פרוטופלסט בתיווך פוליאתילן גליקול (PEG) משמשת בדרך כלל להחדרת גנים הטרולוגיים ל-A. oryzae. השיטה הקונבנציונלית דורשת בדרך כלל שלושה שבועות לסינון של טרנספורמטורים חיוביים. כאן מוצגת טכניקה חדשה, שיטת הסינון של תרבית נוזלית ישירה (DLC), המפחיתה את זמן ההקרנה לשישה ימים בפורמט בקבוק של 200 מ"ל או ל-10 ימים בפורמט מיקרו-פלטות של 24 בארות. שיטת סינון ה-DLC מבטיחה רכישת טרנספורמנטים חיוביים והערכת ייצור ההפרשה של חלבונים הטרולוגיים בשלב אחד, בניגוד לשיטת הסינון הקונבנציונלית שבה נדרשים שני שלבים נפרדים לאותו הדבר. מתואר הפרוטוקול לטרנספורמציה של פרוטופלסט בתיווך PEG של A. oryzae , המורכב מחמישה שלבים: הכנת תרחיף נבגים טריים, תרבית מוקדמת, הכנת פרוטופלסטים, הכנסת DNA וסינון DLC. לקבלת תוצאות מוצלחות בהקרנת DLC, קריטי להשתמש במדיום עשיר בחומרים מזינים עם לחץ אוסמוטי אופטימלי. הפרוטוקול אמור להפיץ עוד יותר את השימוש ב-A. oryzae כשורה של בחירה בייצור תעשייתי של חלבונים.

מבוא

אספרגילוס אוריזאה הוא מיקרואורגניזם חשוב בתעשיית המזון היפנית שנמצא בשימוש כבר למעלה מ-1,000 שנה בייצור מזונות מותססים, כמו סאקה (יין אורז), שויו (רוטב סויה) ומיסו (ממרח סויה)1,2. יש לו את היכולת להפריש כמות גדולה של חלבונים, כגון פרוטאזות ועמילאזות3. מידע על רצף הגנום של A. oryzae זמין גם כן4. יתר על כן, הוקמו טכניקות הנדסה גנטית חזקות ושימושיות מעשית עבור פטרייה זו 5,6,7,8,9,10. טרנספורמנטים חיוביים שימשו כמארחים לייצור הפרשה של חלבונים הטרולוגיים 11,12,13,14.

אלקטרופורציה, טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום וטרנספורמציה של פרוטופלסט בתיווך פוליאתילן גליקול (PEG) הן הטכניקות המשמשות להחדרת גנים הטרולוגיים ל-A. oryzae 15,16,17. שיטת הטרנספורמציה של פרוטופלסט בתיווך PEG הייתה בשימוש נרחב מאז שדווח לראשונה על Neurospora crassa בשנת 197918. בשיטה זו מכינים פרוטופלסטים ומערבבים אותם עם PEG והגן ההטרולוגי שיש להכניס לתאים. דפנות הפרוטופלסטים נפגעות אנזימטית, מה שהופך את התאים לפגיעים ללחץ פיזי ולשינויים בלחץ האוסמוטי19,20. שיטת הסינון הקונבנציונלית המשמשת בייצור הפרשה של חלבונים הטרולוגיים כוללת שלושה שלבים: רכישת טרנספורמנטים חיוביים (על צלחת אגר רכה), בחירת טרנספורמנטים אמיתיים ושקריים (על צלחת אגר), והערכת ייצור ההפרשה של חלבונים הטרולוגיים (בתרבית נוזלית); כל אחד מהשלבים האלה לוקח שבעה ימים (איור 1). לפיכך, השיטה הקונבנציונלית דורשת בדרך כלל כשלושה שבועות.

הזמן הנדרש להקרנה של תאי A. oryzae שעברו טרנספורמציה ארוך בהרבה מזה הנדרש למיקרואורגניזמים אחרים המשמשים בדרך כלל במחקר ביוטכנולוגי, מה שהופך את התהליך למסורבל יותר. לדוגמה, כאשר משתמשים ב-Escherichia coli כפונדקאי, לוקח כיומיים מהכנסת ה-DNA ועד לאישור השפעתו21.

כדי לעקוף את המגבלה הקשורה לשימוש ב-A. oryzae כפי שהוזכר לעיל, מוצגת כאן שיטת סינון חדשה של תרבית נוזלית ישירה (DLC), המאפשרת סינון מהיר ופשוט יותר להערכת ייצור ההפרשה של חלבונים הטרולוגיים (איור 1). בשיטת ה-DLC משתמשים במוטציה אוקסוטרופית של אורידין ובמדיום נוזלי עשיר בחומרים מזינים. בשיטה זו ניתן להשלים את שלב הסינון תוך שישה ימים לאחר החדרת ה-DNA לפרוטופלסטים בפורמט בקבוק של 200 מ"ל או תוך 10 ימים בפורמט מיקרו-צלחת של 24 בארות. יתר על כן, אין צורך בהכנה גוזלת זמן ועמל של מדיה של צלחת אגר בשיטה זו. יש יתרון עצום בשימוש בשיטה החדשה שתוארה, במיוחד בהתחשב בעובדה שהשיטה הקונבנציונלית דורשת שתי מדיות שונות: לוחית אגר רכה לרכישת טרנספורמנטים חיוביים, הדורשת טיפול זהיר ובקרת טמפרטורה, וצלחת אגר מוצקה לבחירת טרנספורמנטים אמיתיים.

figure-introduction-1
איור 1: סכמטי של התמרת פרוטופלסט בתיווך פוליאתילן גליקול (PEG) של הפטרייה החוטית, Aspergillus oryzae.
(פנל עליון) שיטת סינון קונבנציונלית. (פאנל תחתון) שיטת סינון ישירה של תרבית נוזלית (DLC). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תרחיף נבגים טריים

  1. יש לחסן 20 מיקרוליטר של תרחיף נבגים (1 x 107 נבגים/מ"ל) במרכז צלחת תרבית המכילה מדיום Czapek-Dox (CD) עם 20 מ"מ אורידין (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, טבלה 1).
  2. יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים כדי לעודד היווצרות נבגים.
  3. הוסף 1.5 מ"ל של 0.01% תמיסת Tween 20 (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) לצלחת התרבות המכילה נבגים והשהה את הנבגים על ידי גירוד עם מפזר תאים.
  4. אוספים את תרחיף הנבגים בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה.
  5. אחסן את המתלה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: השתמש בתרחיף הנבגים בהליך הבא תוך שבועיים. להכנת מלאי לאחסון לטווח הארוך, הוסיפו גליצרול לתרחיף הנבגים לריכוז סופי של 15% ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. קדם-תרבות

  1. הוסף 100 מ"ל של מדיום פוליפפטון-דקסטרין (PD) (טבלה 2) בבקבוק ארלנמאייר של 500 מ"ל, וחיטוי אותו ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. לאחר אישור כי טמפרטורת המדיום מופחתת, הוסף את תמיסת האורידין המעוקרת על ידי מעבר דרך פילטר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר, לריכוז סופי של 20 מ"מ.
  3. הוסף 200 מיקרוליטר מתרחיף הנבגים (1 x 107 נבגים/מ"ל) שהוכן בשלב 1.4, ודגירה ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-120 סל"ד למשך 36 שעות.

3. הכנת פרוטופלסטים

  1. קצרו את הביומסה הפטרייתית שהוכנה בשלב 2.3 על פילטר זכוכית בגודל נקבוביות של 30 מיקרומטר (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).
  2. יוצקים 100 מ"ל מים מזוקקים (DW) (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) על מסנן הזכוכית ומערבבים מספר פעמים בעזרת מרית (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).
  3. לאחר שטיפה עם DW, שפכו 100 מ"ל של מאגר נתרן כלורי (NaCl) (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, טבלה 3) על מסנן הזכוכית וערבבו מספר פעמים בעזרת מרית.
  4. מעבירים כ-1-2 מ"ל (נפח רטוב) מהתאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות מרית (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות).
  5. לאחר הוספת 15 מ"ל מתמיסת האנזים (מעוקרת על ידי מעבר דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר, טבלה 4) לצינור חרוטי של 50 מ"ל, הוסף מאגר NaCl עד שהנפח הכולל מגיע ל -30 מ"ל.
  6. סוגרים את המכסה ואוטמים בניילון פרפין. יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-60 סל"ד למשך שעתיים.
  7. הזרם את התמיסה המתקבלת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר המחוברת לצינור החרוטי של 50 מ"ל כדי להסיר את התפטיר שלא הגיב.
  8. צנטריפוגה את תמיסת הפרוטופלסט בצינור חרוטי של 50 מ"ל בטמפרטורה של 2,150 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  9. השליכו בעדינות את הסופרנטנט כדי למנוע מהכדור לעקור. הוסף 1 מ"ל של תמיסה מעוקרת קר כקרח B (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, טבלה 5) והשהה בעדינות את הפרוטופלסטים המשקעים על ידי פיפטינג.
  10. העבירו את הפרוטופלסטים התלויים לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל.
  11. צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,220 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של תמיסה קרה כקרח B והשהה בעדינות את הגלולה על ידי פיפטינג.
  12. חזור על שלב 3.9.
  13. בעזרת המוציטומטר, מדוד את מספר הפרוטופלסטים במיקרוסקופ.
  14. הכן תרחיף פרוטופלסט (1-3 x 107 פרוטופלסטים/מ"ל) בתמיסה B ואחסן אותו על קרח עד לשימוש.
    הערה: השתמש במתלה הפרוטופלסט מיד בהליך הבא.

4. הכנסת DNA לייצור הפרשה של חלבון

  1. שימוש בפלסמיד המכיל קלטת DNA לייצור הפרשה של חלבון כתבנית, הגביר את מקטע ה-DNA הנדרש לייצור הפרשה על ידי PCR.
  2. הכן את דגימת ה-DNA שתשמש לטרנספורמציה על ידי עיבוד מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR.
  3. הוסף 1 מ"ל מתמיסת הפרוטופלסט, 200 מיקרוליטר של תמיסה C (חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, טבלה 6), ו-50 מיקרוליטר של דגימת ה-DNA (0.5-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר) בצינור חרוטי סטרילי ומקורר מראש של 15 מ"ל, וערבב את התמיסה בעדינות על ידי פיפטינג.
    הערה: פתרון C הוא צמיג מאוד ויכול להיות קשה לטיפול; הקפידו על ערבוב יסודי על ידי פיפטינג.
  4. דגרו את הצינור על קרח למשך 30 דקות.
  5. מוסיפים 1.5 מ"ל של תמיסה C, מערבבים בעדינות על ידי פיפטה, ולאחר מכן משאירים את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.

5. הקרנה ישירה של תרבית נוזלית

הערה: בחר את מערכת התרבית באמצעות צלוחיות Erlenmeyer (סעיף 5.1) או מיקרו-פלטות (סעיף 5.2).

  1. מערכת תרבית באמצעות בקבוק ארלנמאייר 200 מ"ל
    1. הוסף 50 מ"ל של מדיום PD המכיל 0.8 מ' סורביטול לבקבוק ארלנמאייר של 200 מ"ל, ועקר על ידי חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    2. לאחר אישור כי טמפרטורת המדיום מופחתת, הוסף את תרחיף הפרוטופלסט שהוכן בשלב 4.5 לריכוז סופי של 1 x 105 פרוטופלסטים/מ"ל.
    3. דגרו את התרבית למשך 6 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב -120 סל"ד.
    4. אוספים 1 מ"ל מהמדיום ומאחסנים בצינור של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אחסן את דגימת התרבות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, אם לא נותח מיד.
    5. מערבבים 20 מיקרוליטר של דגימת תרבית ו -20 מיקרוליטר של מאגר דגימת נתרן דודציל סולפט (SDS) (טבלה 7) בצינור של 1.5 מ"ל ומרתיחים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. לאחר קירור על קרח, טען 20 מיקרוליטר מהדגימה המבושלת ו-5 מיקרוליטר של תקן חלבון צבוע מראש על ג'ל טרומי ונתח את ייצור ההפרשה של חלבון המטרה ההטרולוגי על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)10.
  2. מערכת תרבית באמצעות מיקרופלייט 24 בארות
    1. הוסף את תרחיף הפרוטופלסט שהוכן בשלב 4.5 למדיום PD מעוקר המכיל סורביטול 0.8 M לריכוז סופי של 1 x 105 פרוטופלסטים/מ"ל, וערבב בעדינות על ידי פיפטינג.
    2. הוסף 1 מ"ל מהתמיסה שהוכנה בשלב 5.2.1 לשלוש בארות במיקרופלטה של 24 בארות.
    3. יש להצמיד את המכסה ולדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-175 סל"ד למשך 10 ימים.
    4. אוספים 1 מ"ל בינוני ושומרים בצינור של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אחסן את דגימת התרבות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, אם לא נותח מיד.
    5. מערבבים 20 מיקרוליטר מדגימת התרבות ו -20 מיקרוליטר מאגר דגימת SDS בצינור של 1.5 מ"ל ומרתיחים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. לאחר קירור על קרח, טען 20 מיקרוליטר מהדגימה המבושלת ו-5 מיקרוליטר של תקן חלבון צבוע מראש על ג'ל טרומי ונתח את ייצור ההפרשה של חלבון הטרולוגי המטרה על ידי SDS-PAGE10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות להכנסת קלטת ביטוי ה-DNA המקודדת עבור Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase (CBH: GenBank Accession Number E39854) לתוך אוקסוטרוף אורידין של A. oryzae זן HO422 וסינון לייצור ההפרשה של החלבון ההטרולוגי מתוארות להלן.

הכנת תרחיף נבגים טריים

התפוקה הסופית של תרחיף נבגים מלוח אגר אחד הייתה 1 מ"ל (1 x 107 נבגים/מ"ל).

קדם תרבות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיתחנו מערכת המאפשרת סינון של טרנספורמציות A. oryzae במהירות רבה יותר מהשיטה הקונבנציונלית, על ידי ביצוע תרבית נוזלית של הפרוטופלסטים. ההיבט הקריטי ביותר בשיטה זו הוא הלחץ האוסמוטי של המדיום הנוזלי. הלחץ האוסמוטי המתאים לתרבית נוזלית עבר אופטימיזציה באמצעות סורביטול. הגידול של A. oryzae זן HO4 היה פעיל ביותר בנוכחות 0.8 M סורביטול (איור 3A). בשיטה הקונבנציונלית המשתמשת במדיום אגר רך, דווח על לחץ אוסמוטי של 0.5-1.2 M כמתאים ל-N. crassa

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לרינקי אוקאנו על עזרתה בניסויים. המחברים מודים לפרופסור קטסויה גומי מאוניברסיטת טוהוקו ולפרופסור מסאיוקי מצ'ידה מהמכון הטכנולוגי של קאנאזאווה על דיונים חשובים. עבודה זו מומנה על ידי מכון המחקר הונדה יפן בע"מ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ'NaOH NACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7.5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6.8)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation2106-100
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לAS ONE Corporation1-1600-03
צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"לבקטון, דיקינסון ושות'352196
2- מרקפטואתנולמעבדות ביו-ראד בע"מ
24 בארות MicroplateAGC טכנו זכוכית ושות', בע"מ3820-024
צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"לבקטון, דיקינסון ושות352070
70-& m מסננת תאיםBecton, Dickinson and Company352350
AgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
AutoclaveTOMY SEIKO CO., LTD.LSX-700
ברומופנול כחולFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
חומצת קסמינוFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation393-02145
Cellulase R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
דקסטרין הידראטFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-SorbitolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020Lמשמש לג'ל טרומי
במכשיר אלקטרופורזהSDS-PAGE ATTO CORPORATIONWSE-1150משמש עבור SDS-PAGE
FeSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
מסנן זכוכית 17G3Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.
גליצרולFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation070-04941
HemocytometerFunakoshi Co., Ltd.521-10
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוההKUBOTA CORPORATION7780משמשת לצנטריפוגה של דגימות בצינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מ"ל
חממתTAITEC CORPORATION.G· BR-200משמש לתרבית נוזלית בקבוק והכנת פרוטופלסטים
חממתTAITEC CORPORATION.BR-43FLמשמש לתרבית נוזלית מיקרופלייט ולתרבית צלחות
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
אנזים ליזינגSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
צנטריפוגה מיקרו בקירורKUBOTA CORPORATION3740משמשת לצנטריפוגה של דגימות בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל
מיקרוסקופLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2 שעות<תת>2Oנקלאי טסקה, בע"מ.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
ערכת טיהור PCRQIAGEN K.K28104
צלחת פטריSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900משמש כצלחת תרבית
פוליאתילן גליקולסיגמא-אולדריץ'P3640-500G
פוליפפטון פפטוןבקטון, דיקינסון ושות'211910
סולמות חלבוןBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377משמש כסמן משקל מולקולרי ב-SDS-PAGE
נתרן דודציל סולפטBio-Rad Laboratories, Inc.
מסנן סטריליMerck KGaASLGP033RB
סוכרוזNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20טוקיו תעשיה כימית ושות', בע"מT0543
אורידיןסיגמא-אולדריץ'U3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.טי017
1610710' 00000941471610301

מקורות

  1. Tsuboi, H., et al. Improvement of the Aspergillus oryzae enolase promoter (P-enoA) by the introduction of cis-element repeats. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 69, 206-208 (2005).
  2. Nemoto, T., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Contribution ratios of amyA, amyB, amyC genes to high-level α-amylase expression in Aspergillus oryzae. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 76, 1477-1483 (2012).
  3. Shinkawa, S., Mitsuzawa, S. Feasibility study of on-site solid-state enzyme production by Aspergillus oryzae. Biotechnology for Biofuels. 13, 31(2020).
  4. Machida, M., et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. Nature. 438 (7071), 1157-1161 (2005).
  5. Veenstra, A. E., van Solingen, P., Bovenberg, R. A. L., vander Voort, L. H. M. Strain improvement of Penicillium chrysogenum by recombinant DNA techniques. Journal of Biotechnology. 17 (1), 81-90 (1991).
  6. Takahashi, T., Masuda, T., Koyama, Y. Enhanced gene targeting frequency in ku70 and ku80 disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Molecular Genetics and Genomics. 275 (5), 460-470 (2006).
  7. Mizutani, O., et al. A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fungal Genetics and Biology. 45 (6), 878-889 (2008).
  8. Bergès, T., Barreau, C. Isolation of uridine auxotrophs from Trichoderma reesei and efficient transformation with the cloned ura3 and ura5 genes. Current Genetics. 19 (5), 359-365 (1991).
  9. Takeno, S., et al. Cloning and sequencing of the ura3 and ura5 genes, and isolation and characterization of uracil auxotrophs of the fungus Mortierella alpina 1S-4. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (2), 277-285 (2004).
  10. Ji, Y. W., et al. Application of membrane filtration method to isolate uninuclei conidium in Aspergillus oryzae transformation system based on the pyrG marker. Food Science and Biotechnology. 22 (1), 93-97 (2013).
  11. Mitsuzawa, S., Fukuura, M., Shinkawa, S., Kimura, K., Furuta, T. Alanine substitution in cellobiohydrolase provides new insights into substrate threading. Scientific Reports. 7 (1), 16320(2017).
  12. Fleissner, A., Dersch, P. Expression and export: recombinant protein production systems for Aspergillus. Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 1255-1270 (2010).
  13. Yoon, J., Maruyama, J. -I., Kitamoto, K. Disruption of ten protease genes in the filamentous fungus Aspergillus oryzae highly improves production of heterologous proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 89, 747-759 (2011).
  14. Lin, H., et al. Engineering Aspergillus oryzae A-4 through the chromosomal insertion of foreign cellulase expression cassette to improve conversion of cellulosic biomass into lipids. PLoS One. 9, 108442(2014).
  15. Chakraborty, B. N., Patterson, N. A., Kapoor, M. An electroporation-based system for high-efficiency transformation of germinated conidia of filamentous fungi. Canadian Journal of Microbiology. 37 (11), 858-863 (1991).
  16. Sun, Y., et al. A dual selection marker transformation system using Agrobacterium tumefaciens for the industrial Aspergillus oryzae 3.042. Journal of Microbiology and Biotechnology. 29 (2), 230-234 (2019).
  17. Gomi, K., Iimura, Y., Hara, S. Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB Gene. Agricultural and Biological Chemistry. 51 (9), 2549-2555 (1987).
  18. Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R., Giles, N. H. Efficient transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (10), 5259-5263 (1979).
  19. Lim, F. Y., Sanchez, J. F., Wang, C. C., Keller, N. P. Toward awakening cryptic secondary metabolite gene clusters in filamentous fungi. Methods in Enzymology. 517, 303-324 (2012).
  20. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (1), 168(2017).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (7), 2172-2175 (1989).
  22. Shinkawa, S., et al. Base sequence for protein expression and method for producing protein using same. U.S. Patent. , 15/745,030 Application No. 15/745,030. Minato-Ku, Tokyo, Japan (2018).
  23. Tamano, K., et al. The β-1, 3-exoglucanase gene exgA (exg1) of Aspergillus oryzae is required to catabolize extracellular glucan, and is induced in growth on a solid surface. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 71 (4), 926-934 (2007).
  24. Endo, Y., et al. Novel promoter sequence required for inductive expression of the Aspergillus nidulans endoglucanase gene eglA. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (2), 312-320 (2008).
  25. Kubodera, T., Yamashita, N., Nishimura, A. Pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae: cloning, characterization and application as a dominant selectable marker for transformation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (7), 1416-1421 (2000).
  26. Yamada, O., Lee, B. R., Gomi, K. Transformation system for Aspergillus oryzae with double auxotrophic mutations, niaD and sC. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 61 (8), 1367-1369 (1997).
  27. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS One. 10 (7), 0133085(2015).
  28. Shi, T. Q., et al. CRISPR/Cas9-based genome editing of the filamentous fungi: the state of the art. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (20), 7435-7443 (2017).
  29. Katayama, T., et al. Forced recycling of an AMA1-based genome-editing plasmid allows for efficient multiple gene deletion/integration in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae. Applied Environmental Microbiology. 85 (3), 01896-01918 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PEG
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים