מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Abstract

אינטראקציות חלבון בממשקים סלולריים מכתיבות שפע של תוצאות ביולוגיות החל מהתפתחות רקמות והתקדמות סרטן ועד היווצרות ותחזוקה של סינפסה. רבות מהאינטראקציות הבסיסיות הללו מתרחשות בטרנס ובדרך כלל נגרמות על ידי אינטראקציות הטרופיליות או הומופיליות בין תאים המבטאים זוגות כריכה מעוגנים בקרום. המבהיר כיצד מוטציות רלוונטיות למחלות משבשות את אינטראקציות החלבון הבסיסיות האלה יכול לספק תובנה על מספר עצום של תחומי ביולוגיה של התא. מבחני אינטראקציה רבים של חלבון-חלבון אינם מנטרלים בדרך כלל בין אינטראקציות cis ו- trans, מה שעלול להוביל להערכת יתר של היקף הכריכה המתרחשת ב- vivo וכרוכה בטיהור אינטנסיבי של חלבון ו/או ציוד ניטור מיוחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט אופטימיזציה המאפשר תצפית וכימות של אינטראקציות טרנס בלבד ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. מבחני צבירת תאי HEK כרוכים בערבוב של שתי אוכלוסיות עצמאיות של תאי HEK, שכל אחת מהן מבטאת ליגנדים קוגניאטים הקשורים לקרום. לאחר תקופת דגירה קצרה, הדגימות מסומנות והצטברויות המתקבלות מכמתות.

Introduction

אינטראקציות סינפטיות בהנחיית מולקולות הידבקות סינפטית הן הבסיס לפיתוח, ארגון, מפרט, תחזוקה ותפקוד של סינפסות ויצירת רשתות עצביות. הזיהוי של מולקולות הידבקות תאים טרנס-סינפטיות אלה גדל במהירות; לכן, חשוב ביסודו לזהות שותפים מחייבים ולהבין כיצד מולקולות הדבקה חדשות אלה אינטראקציה אחד עם השני. בנוסף, רצף הגנום זיהה מוטציות ברבים ממולקולות הידבקות אלה הקשורות בדרך כלל לשלל הפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירופסיכיאטריות והתמכרות¹. מוטציות בגנים המקודדות למולקולות סינפטיות של הידבקות בתאים עלולות לשנות לרעה אינטראקציות טרנסג'נדריות ועשויות לתרום לשינויים פתופיזיולוגיים בהיווצרות סינפסה או תחזוקה.

מבחנים מרובים קיימים כדי להעריך כמותית אינטראקציות חלבון חלבון כגון קלורימטריה איזותרמית, dichroism מעגלי, תהודה פלסמון פני השטח² ולמרות כמותי בטבע, יש להם מספר מגבלות. ראשית, הם דורשים חלבון רקומביננטי, לפעמים דורשים צעדי טיהור ארוכים ומייגעים. שנית, הם דורשים ציוד מיוחד מתוחכם ומומחיות טכנית. שלישית, הם יכולים להפרז בהיקף הכריכה כפי שהם מאפשרים הן אינטראקציות cis ו טרנס בין חלבונים הקשורים באופן טבעי קרום vivo. כאן אנו מציעים בדיקה פשוטה ומהירה יחסית הבדוקה באופן בלעדי אינטראקציות טרנסג'נדריות.

כדי לעקוף רבים מהסיבוכים הקשורים למטעני חלבון מטוהרים, יש לנו אופטימיזציה של בדיקת אינטראקציה חלבון מבוסס תאים כי recapitulates אינטראקציות טרנס במערכת תאים הטרולוגית מופחתת. מבחנים אלה שימשו בעבר בצורות שונות לחקר אינטראקציות טרנס-תאיות. בגישה זו, מולקולות הידבקות תאים מועמדים הם transfected לתוך תאי HEK293T. בתנאים פיזיולוגיים, תאי HEK293T אינם מפגינים צבירה עצמית, מה שהופך אותם למודלים למופת לבדיקה זו. עם זאת, כאשר אוכלוסיות בודדות של תאי HEK המביעים קולטן ו ligand משולבים, הכריכה של הקולטן ואת ligand כוחות צבירה של תאי HEK להתרחש. צבירה זו מתווכת אך ורק על ידי אינטראקציות טרנסג'נדריות ובדרך כלל ניתן לצפות בה בעשרות דקות. בשיטה זו אין צורך בצעדי טיהור חלבונים, ויעילות השיטה מסתמכת על הפרדיגמה לפיה משולבות אוכלוסיות של תאי HEK המבטאות מולקולות הידבקות קוגניציה ולאחר מכן מצולמות רק עשרות דקות לאחר מכן. בנוסף, שיטה זו זולה יחסית, שכן לא נדרשים נוגדנים ולא ציוד יקר. הציוד היחיד הנדרש לרכישת נתונים הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. יתרון נוסף למבחן מבוסס תא זה הוא היכולת לסנן במהירות את ההשפעה של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלות על אינטראקציות טרנסג'נדריות. זה יכול להתבצע על ידי transfecting תאי HEK עם cDNAs של גרסאות מוטציה של החלבון של עניין.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים דוגמה שבה אנו חוקרים אם מוטציה שגויה Neurexin3α (Neurexin3α^A687T), זוהה בחולה שאובחן עם מוגבלות אינטלקטואלית עמוקה ואפילפסיה, משנה אינטראקציות טרנס עם חלבון טרנסממברן חוזר עשיר לאוצין 2 (LRRTM2). Neurexin3α הוא חבר במשפחה השמורה מבחינה אבולוציונית של מולקולות הידבקות תאים presynaptic ובעוד העבודה האחרונה זיהתה תפקידים מרובים בסינפסה^3,4,5,6,7, ההבנה הסינפטית שלנו של מולקולה זו וכל בני משפחת neurexin נשאר שלם. LRRTM2 הוא חלבון הידבקות תאים פוסט-סינפטי מעורר המשתתף בהיווצרות סינפסה ותחזוקה^8,9,10. חשוב לציין, LRRTM2 באופן בלעדי אינטראקציה עם isoforms neurexin שחסרים באתר splice 4 אקסון חלופי (SS4-) אבל לא עם isoforms neurexin המכיל את אתר splice 4 exon חלופי (SS4+). מוטציית ההחמצה האנושית (A687T) שזוהתה ב Neurexin3α ממוקמת באזור חוץ-תאי לא מתורבת השמור מבחינה אבולוציונית ושמור בין כל אלפא neurexins⁷. כמו האינטראקציה^ביןשתי מולקולות אלה הוקמה 8^,9,11, אנו מציגים את השאלה: האם היכולת מחייבת של Neurexin3α SS4- כדי LRRTM2 השתנה על ידי מוטציה נקודת A687T? בדיקה זו גילתה כי מוטציית נקודת A687T שיפרה באופן בלתי צפוי את הצבירה של Neurexin3α ל- LRRTM2 מה שמרמז על כך שהאזור החוץ-תאי שבו נמצאת המוטציה הנקודתית, ממלא תפקיד בתיווך אינטראקציות טרנסינפטיות.

Protocol

1. תרבות תאים ו transfection

1. הפוך את המדיה הסלולרית HEK עם DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של הנשר בינוני) בתוספת 4.5 גרם / L גלוקוז, L-גלוטמין & נתרן פירובט ו 10% FBS. מסנן סטרילי.
2. קבוע מראש ליגנדים מתאימים קולטנים לבדיקת צבירה.
   הערה: Neurexin3α SS4+/- ואחד הליגנדים הידועים שלה, LRRTM2, שימשו במחקר זה. ליגנדים קולטנים של עניין באו לידי ביטוי cDNAs ב pcDNA3.1. הרכבת גיבסון שימשה להכנסת Neurexin3α לתוך pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: טטאקטטאגקטגטגGGCGCGCGTCCGCCAקטגCTCTCTC /
   גאגג'גקטגאגאטקטאקאטקטקטקטגTTCCTT.
3. הכן תאי HEK293T.
   1. לגדל תאי HEK293T לעיסוק בבקבוק T-75 אחד.
   2. לאחר המפגש, להשתמש 2 מ"ל של טריפסין ומניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. הוסף 6 מ"ל של מדיה HEK לבקבוק כדי resuspend תאים ולהעביר את כל 8 מ"ל לצינור חרוט 15 מ"ל.
   3. גלולה ב 500 x g במשך 5 דקות ו resuspend במדיה סלולרית HEK עבור סך של 8 מ"ל.
   4. לספור תאים ולהוסיף 735,000 תאים לתוך כל באר של צלחת 6-well. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 2 מ"ל עבור כל באר באמצעות מדיית תא HEK.
   5. מניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול בן לילה או עד שהם מגיעים 50-60% מפגש.
4. Transfect HEK293T תאים באמצעות שיטת סידן פוספט¹³.
   1. להחליק היטב 1 עם 3 מיקרוגרם של החלבון של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- ו 1 מיקרוגרם של mCherry).
   2. תעביר היטב 2 כמו בשלב 1.4.1. אבל עם חלבון מוטציה של עניין (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. חוצה היטב-3 עם 3 מיקרוגרם של ligand של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי אחר (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1 LRRTM2 ו 1 מיקרוגרם של GFP).
   4. להחדיר גם-4 ו- well-5 לשמש פקדים שליליים: גם 4 עם 1 מיקרוגרם של GFP ו well-5 עם 1 מיקרוגרם של mCherry.
   5. הכן צלחת נוספת (כמו בשלב 1.4.1-1.4.4) אם נדרשים תנאים או פקדים נוספים (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      הערה: יעילות Transfection מנותחת 24 שעות לאחר transfection תחת מיקרוסקופ epifluorescence ו כימות כמו מספר התאים המבטאים את החלבון פלואורסצנטי הם היו transfected עם. גישה יעילה יותר תכלול את ההשתנות של תאי HEK עם קידוד וקטורי דו-יסטרי לחלבון פלואורסצנטי ואת הליגנד של עניין ומומלץ מאוד מעל שינוי-תיקון. במקרה של מחקר זה, אלפא Neurexins הם ~ 4.3 kb ועוצמת פלואורסצנטיות נמוכה נצפתה באמצעות מערכת bicistronic המחייבת שיתוף transfection.
5. 48 שעות לאחר טרנס-פליטה, תאי קציר לצבירה.
   1. לשטוף כל באר פעמיים עם PBS.
   2. הוסף 1 מ"ל של EDTA 10 מ"מ ב PBS לתוך כל באר בעדינות לנתק אינטראקציות תא לתא צלחת דגירה ב 37 °C (70 °F) במשך 5 דקות.
      הערה: טריפסין אינו מומלץ לשלב 1.5.2 עקב מחשוף פרוטאוליטי פוטנציאלי של מולקולות הידבקות במחקר. בנוסף, לאחר הוספת EDTA ייתכן שהפרוטוקול לא יופסק עד להשלמתו מכיוון שהתאים ייחשפו כעת לתנאי הסביבה.
   3. הקישו בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים, וקצרו כל באר לצינורות חרוטים נפרדים של 15 מ"ל.
   4. צינורות חרוט צנטריפוגה ב 500 x גרם וטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
6. בעוד תאים הם pelleting, להכין 6 צינורות דגירה על ידי תיוג החלק העליון של כל צינור microcentrifuge עם כל מצב.
   הערה: יש להשתמש בכל תמורות של תנאי GFP ו- mCherry כדי להקיף את כל התנאים הניסיוניים והבקרות המתאימות. לדוגמה: 1. GFP/mצ'רי, 2.mצ'רי/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-–mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- – mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-- mCherry/LRRTM2 – GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- – mשרי / LRRTM2 - GFP. הפוך צינורות נוספים כדי להתאים תנאים נוספים ובקרות.
7. הסר את התאים supernatant ו resuspend ב 500 μL של מדיה HEK עם 10 mM CaCl₂ ו 10 mM MgCl₂ מחומם ל 37 °C (69 °F).
   הערה: התוספת של CaCl₂ ו- MgCl₂ מאפשרת למולקולות הידבקות להקים מחדש את הכריכה ונדרשת רק אם שותפי האינטראקציה הטרנס-תאית המדוברים דורשים ציות דו-תאי להדבקה.
8. לספור את התאים בכל צינור חרוט 15 מ"ל באמצעות hemocytometer ו aliquot 200,000 תאים של כל תנאי לתוך הצינור המתאים משלב 1.6.1 עבור 1:1 לערבב בנפח כולל של 500 μL.
   הערה: זה צריך לקחת רק 5 דקות לכל תנאי לספור כמויות aliquot.
9. דגירה צינורות בטמפרטורת החדר במסובב צינור איטי.

2. רכישת תמונה

1. מטב פרמטרי רכישת מיקרוסקופ עבור דגימות ספציפיות. בדוגמה זו, תמונות צולמו במיקרוסקופ רחב שדה. השתמש במטרת אוויר 5x (NA: 0.15; WD: 20000 מיקרומטר) כדי לקבל שדה גדול מספיק לניתוח.
2. להעריך צבירה בסיסית מיד לאחר ערבוב שני התנאים של תאי HEK בשלב 1.8. אלה עכשיו תמונות 'זמן אפס'.
   1. פיפטה 40 μL של כל תערובת מדגם על שקופית מיקרוסקופ טעונה ותמונה תחת פלואורסצנטיות בשני ערוצי 488 ו 561.
   2. רכוש שלושה שדות תצוגה שונים במישור מיקוד אחד לכל טיפה לדוגמה.
3. רכוש תמונות סופיות ב- 60 דקות כתמונה 'זמן 60'.
   1. כדי לקבל את התמונה 'זמן 60' של התערובת לאחר דגירה של 60 דקות, לקחת עוד 40 μL מדגם של כל תנאי מצינורות מסתובבים פיפטה כל מדגם על שקופית טעונה. תמונה כמו בשלב 2.2.2.
      הערה: יש לבדוק צבירת תאים כל 15 דקות עד שתתרחש רוויה. תזמון הצבירה יהיה תלוי בחלבונים הנבדקים.

3. ניתוח ImageJ/פיג'י

1. כדי לכמת את היקף הצבירה באמצעות פיג'י/ImageJ, שמור קבצי ניתוח.
   1. שמור את קבצי הקידוד המשלימים שסופקו בתיקיה פקודות מאקרו של imageJ במחשב.
   2. התקן את מאקרו הצבירה שסופק (תוספים, פקודות מאקרו, התקן ובחר בקובץ "צבירהאי.txt").
2. קבע ערכי סף.
   1. טען קובץ .tif 'זמן אפס' לתוך imageJ ופצל את הערוצים (תמונה | | צבע פיצול ערוצים).
      הערה: התמונה 'זמן אפס' משמשת לקביעת גודל הסף והפונקטה הקטן ביותר עבור הניסוי כולו.
   2. מסיכה כל ערוץ (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_MakeMask). החלון 'הפוך מסיכה מתמונה' יופיע. בתיבות הסימון לצד קבע סף לתמונה וקבע פארמים של אשכול מהיסטוגרמה ולחץ על אישור.
   3. קבע את סף התמונה באמצעות סרגל השקופיות, הקלט את המספר משמאל לסרגל השקופיות ולחץ על אישור.
   4. תופיע היסטוגרמה של גודל אשכול. בחר גודל אשכול מההיסטוגרמה המתאימה לניסוי, הקלד מספר זה בתיבה גודל אשכול מינימלי: ולחץ על אישור. אשכולות מתחת לגודל זה לא ינותח.
3. תריץ את הניתוח.
   1. פתח את התמונה 'זמן 60' של תנאי 1 ב imageJ ולפצל את הערוצים כמו בשלב 3.2.1.
   2. מסיכה כל ערוץ (תוספים, פקודות מאקרו AggregationAssay_MakeMask). השתמש באותו סף ובאותו גודל שנקבעו בשלב 3.2.3 ובשלב 3.2.4. בטלו את הבחירה בתיבות שליד 'קביעת סף לתמונה' ו'קביעת תערוכי אשכול מהיסטוגרמה' והקלדו ידנית את הגודל והסף בשדות המתאימים ולחצו על הלחצן 'אשר'.
   3. חישוב אינדקס הצבירה (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_CalculateOverlap). בחר את הערוצים עם המסיכה שיש להשוות ואת הספריה שבה ישמרו הקבצים המתקבלים.
   4. חזור על שלבים 3.3.1-3.3.3 עבור כל תמונה 'זמן 60' בכל תנאי.
      הערה: אינדקס הצבירה מוגדר כאזור החפיפה הכולל חלקי הסכום של שני אזורי הערוצים פחות אזור החפיפה כפול 100 (אינדקס צבירה = אזור חפיפה/[אזור של ערוץ 1 + אזור של ערוץ 2 – אזור חפיפה] x 100). נורמליזציה זו היא פעולת 'OR' בין שני הערוצים עם המסיכה המייצגת את סך כל הפיקסלים בכל אחת מהמסכות.

Results

מוטציית A687T מגבירה את Neurexin3α SS4- מחייב LRRTM2⁷
כדי לחקור כיצד אינטראקציות בין-תאיות של שני חלבונים סינפטיים ידועים מושפעות מהכנסת מוטציה נקודתית שנמצאה בחולה עם מוגבלות אינטלקטואלית ואפילפסיה, השתמשנו במדיין צבירת התאים הנ"ל HEK (איור 1). התאים הודבקו לפי סעיף 1 והוכנו להדמיה לפי סעיפים 1 ו-2 של הפרוטוקול. תאים צולמו בבסיס שבו לא נצפתה צבירה כצפוי (לא מוצג). תמונות שנרכשו ב 60 דקות נותחו כמו בסעיף 3 של הפרוטוקול. כדי למזער את הטיית הבחירה, התנאים היו אקר...

Discussion

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון המתרחשות טרנס במהלך הידבקות בתא יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים תאיים בסיסיים כולל היווצרות, פונקציה ותחזוקה של סינפסות במהלך התבגרות ושיפוץ. ההשלכות של אינטראקציות בין תא לתא מתרחבות מעבר לנוירוביולוגיה ויש להן תפקידים רחבים יותר בתמרת אותות, נדידת תאים ופיתוח^{רקמות 14}. סטיות בהדבקת תאים יכולות לשבש תהליכים תאיים הכרחיים לתפקוד תקין של התא ויכולות בבסיס מגוון אטיולוגיות כגון סרטן, דלקת פרקים, התמכרות, אוטיזם וסכיזופרניה

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרו-צינורות חד פעמיים בנפח 1.5 מ"ל עם כובעי הצמד	VWR	89000-028	דגירה של אוכלוסייה מעורבת של תאי HEK
1000 מ"ל Rapid— יחידת מסנן זרימה, 0.2 אום aPES ממברנה	Thermo Fisher	567-0020	עיקור של מדיה
HEK 15 מ"ל SpectraTube צינורות צנטריפוגה	Ward' s Science	470224-998	קצירת תאי HEK
6 צלחות תרבית רקמות סטריליות היטב	VWR	100062-892	תרבית תאי HEK
סידן כלוריד	סיגמא	223506-500G	העברת סידן פוספט, צנטריפוגה להשעיית תאי HEK
- Sorvall Legend RT	Kendro מוצרי מעבדה	75004377	קצירת תאי
HEK חממת	תאי CO2Thermo Scientific	HERACELL 150i	דגירה של תאי HEK במהלך הגידול
DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של מדיום הנשר) עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט	Corning	10-013-CV	תחזוקת תאי HEK
Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח PBS (1X)	Gibco	14190-144	מעבר/קציר תאי HEK
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית	Sigma	ED-500G	קצירת תאי HEK
צלוחיות תרבית מאווררות בז, 75 ס"מ2 אזור גידול	קורנינג	9381M26	תרבית תאי HEK
סרום בקר עוברי	סיגמא	17L184	תחזוקת
HEK293T תאים	מערכת מודל	ATCC
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	ניתוח תמונה
מגנזיום כלוריד הקסהידראט	סיגמא	M9272-500G	השעיית תאי HEK
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים	פישר ביו-ריאגנטים	BP332-500	טרנספקציה של סידן פוספט
טריפסין 0.25% (1X) תמיסה	GE Healthcare Life מדעים	SH30042.01	מעבר תאי HEK
מסובב			דגירה של אוכלוסייה מעורבת של תאי HEK
שקופיות מיקרוסקופ אולטרה-קליר. לבן חלבי, חיובי טעון	דנוויל סיינטיפיק בע"מ	רכישת תמונה	M1021
מיקרוסקופ שדה רחב	Zeiss	Axio Vert 200M	רכישת תמונה