הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

4.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61246

⸱

9 ביוני 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Translational Research Program, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery, Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children's Heart Institute

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.

תקציר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ליצירת רקמות לב מהונדסות (ECTs) מדרגיות בצורת רשת המורכבות מתאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם, אשר מפותחים לקראת המטרה של שימוש קליני. קרדיומיוקיטים נגזר HiPSC, תאים אנדותל, ותאי ציור קיר כלי דם מעורבבים עם מטריצת ג'ל ולאחר מכן נשפכים לתוך עובש רקמה polydimethylsiloxane (PDMS) עם הודעות מלבניות פנימיות מטלטלות. ביום תרבות 14 ECTs להבשיל לתוך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ רשת מבנה עם חבילות myofiber קוטר 0.5 מ"מ. קרדיומיוציטים ליישר את הציר הארוך של כל צרור ולנצח באופן ספונטני באופן סינכרוני. ניתן לשנות את קנה המידה של גישה זו עד ECT רשת גדולה יותר (3.0 ס"מ x 3.0 ס"מ) תוך שמירה על התבגרות ופונקציה של מבנה. לכן, ECTs בצורת רשת המופקת מתאי לב הנגזרים על-ידי hiPSC עשויים להיות אפשריים עבור פרדיגמות התחדשות הלב.

מבוא

מחקרים פרה-קליניים רבים וניסויים קליניים אישרו את היעילות של טיפולים התחדשות לב מבוססי תאים עבורלבבות כושלים 1,,2,,3. בין סוגי תאים שונים, תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSCs) מבטיחים מקורות תאים מכוח יכולת ההתפשטות שלהם, פוטנציאל לייצר תוחינות לב וכלידם שונים 4,,5, ו allogenicity. בנוסף, טכנולוגיות הנדסת רקמות אפשרו להעביר מיליוני תאים ללבפגום 5,6,,,7,,8.

בעבר, דיווחנו על הדור של רקמות לב ליניאריות (3D) ליניאריים מהונדסים (ECTs) מ-hiPSC נגזר תחבולות לב וכלי דם באמצעות מערכת תרבות מסחרית זמינה עבור רקמות ביו-ארטיפיאליות 3D5,7. מצאנו כי הדו-קיום של תאי אנדותל כלי דם ותאי ציור קיר עם קרדיומיוציטים בתוך ECT הקלה על התבגרות רקמות מבניות ואלקטרופיזיולוגיות. יתר על כן, אימתנו את הפוטנציאל הטיפולי של hiPSC-ECTs מושתל במודל אוטם שריר הלב חולדה סובלני חיסונית כדי לשפר את תפקוד הלב, לחדש את שריר הלב, ולשפר אנגיוגנזה5. עם זאת, ECTs ליניארי שנבנה על ידי שיטה זו היו 1 מ"מ על 10 מ"מ צילינדרים ולכן לא מתאים להשתלה במחקרים פרה-קליניים עם בעלי חיים גדולים יותר או שימוש קליני.

בהתבסס על השימוש המוצלח של תבניות רקמות כדי ליצור היווצרות רקמות מהונדסות נקבוביות באמצעות myoblasts שלד חולדה ו cardiomyocytes9, אדם ESC נגזר cardiomyocytes10 ועכבר iPSCs11,פיתחנו פרוטוקול כדי ליצור מדרגי hiPSC נגזר רקמות מושתלות גדולות יותר באמצעות תבניות polydimethylsiloxane (PDMS). הערכנו מגוון של גיאומטריות עובש כדי לקבוע את מאפייני עובש היעילים ביותר. ECTs בצורת רשת עם חבילות וצמתים מרובים הציגו מאפיינים מצוינים בכדאיות התא, פונקציית רקמות ומדרגיות בהשוואה לפורמטים פשוטים או ליניאריים שחסרים נקבוביות או צמתים. השתלנו את ECT בצורת רשת במודל אוטם שריר הלב חולדה ואימת את השפעותיו הטיפוליות דומה ECTs גלילימושתל 12. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול כדי ליצור ECT בצורת רשת שינוי נגזר hiPSC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תחזוקה של hiPSCs ובידול לב וכלי דם

  1. להרחיב ולתחזק hiPSCs על מטריצת קרום מרתף מעיל דק (גורם גדילה מופחת, 1:60 דילול) בינוני מותנה מופק פיברובלסטים עוברי העכבר (MEF-CM) עם גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי (hbFGF)4.
    הערה: השתמשנו בקו hiPSCs (4 גורם (אוק3/4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc) שורה: 201B6). הוסף hbFGF בריכוז המתאים עבור כל קו תא. שבר Laminin-511 יכול לשמש גם לציפוי של צלחת תרבות במקום מטריצת קרום מרתף. אמצעי זמין מסחרית המיועד לתרבות ללא הזנה של hiPSCs יכול לשמש כתחליף ל- MEF-CM.
  2. השתמש Versene (0.48 mM אתילנדיאמין טטראצטי חומצה (EDTA) פתרון) כדי לנתק ולנתק תאים כאשר קונפלוננס התא מגיע 90\u2012100%.
    הערה: ניתן להשתמש גם במוצרים אחרים הזמינים מסחרית עבור דיסוציאציה של תאים.
  3. תאי לוח בצפיפות של 10,000 תאים /מ"מ 2 על לוחות תרבות תא מצופה מטריצה ב MEF-CM עם hbFGF ותרבות במשך יומיים עדשלושה ימים.
  4. כאשר התרבות הופכת לתלת-תפלה מלאה, כסה את התאים במטריצה (דילול של 1:60 עם MEF-CM) ליום אחד.
  5. החלף את MEF-CM ב- RPMI 1640 + B27 בינוני. להוסיף 100 ng/mL של Activin A ו 100 ng/mL של Wnt3A למדיום ליום אחד.
    הערה: זהו היום 0 של בידול. כדי לתזמן איתות WNT canonical, מעכבי GSK3β יכול לשמש גם במקום Wnt3A.
  6. ביום הראשון של בידול, לשנות את המדיום RPMI חדש 1640 + B27 עם 10 ng/mL של BMP4 ו 10 ng/mL של hbFGF. תאי תרבות עבור שני ימים (פרוטוקול MC) או ארבעה (פרוטוקול CM+EC) ללא שינוי בינוני5.
    הערה: פרוטוקול CM+EC ממוטב כדי לגרום בו-זמנית לתאי קרדיומיוציטים (CMs) ותאי אנדותל כלי דם (ECs). פרוטוקול MC ממוטב לתאי ציור קיר של כלי דם (MCs).
  7. פרוטוקול CM+EC עבור אינדוקציה של CMs ו- ECs (איור 1A).
    1. החלף את המדיום ביום 5 של בידול עם RPMI 1640 + B27 בתוספת 50 ng/mL של VEGF165.
    2. שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.
  8. פרוטוקול MC עבור אינדוקציה של תאי קיר כלי דם (איור 1B)
    1. החלף את המדיום בסרום RPMI1640 + 10% סרום נקבי עוברי (FBS) ביום 3 של בידול.
    2. שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.

2. ניתוח קציר תאים ו קוצר יוחות ביום בידול 13\u201215

  1. לשטוף את התאים עם Ca2+ ו Mg2+ תמיסת מלח פוספט חינם אגירה (PBS).
  2. הוסף פתרון דיסוציאציה של תאים (המכיל פרוטאזים, קולאזנס ו-DNAses) בצלחת תרבות התא כדי לכסות את הצלחת. דגירה את הצלחת במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאסוף ולנתק את התאים עם מדיום תרבות באמצעות pipette לאחר הדגירה.
  4. הקצה 1 x 106 תאים לניתוח שושלת עם ציתום זרימה. כדי לחסל תאים מתים, להכתים את התאים עם צבע קיימא לתקן.
  5. להכתים את התאים עם סמני משטח קרום PBS עם 5% FBS. השתמש דילולים הבאים של נוגדנים פלואורסצנטית מופעל תא מיון (FACS) כתמים מאגר: אנטי PDGFRβ (1:100), קאדרין נגד VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
  6. עבור חלבונים תאיים, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS.
  7. להכתים את התאים עם isoform אנטי לב של טרופונין T (cTnT) ב PBS עם 5% FBS ו 0.75% סאפונין, ואז לתייג את הנוגדן cTnT עם 488 עכבר IgG1 (דילול 1:50).
  8. לתוסף מחדש את התאים המוכתמים ב PBS עם 5% FBS ולשים אותם בצינורות FACS עם מסננת תא.
  9. נתח את הרכב התא של התאים המוכתמים מכל פרוטוקול בידול עם ציתום זרימה כדי להקל על יצירת מתלי תאים עם הפצות שושלת מוגדרות.
    הערה: בעת ביצוע הליך זה, מתלי התא הנותרים עבור ECTs נשמרים במקרר של 4°C.

3. ייצור של תבנית רקמת PDMS

  1. הטלת שכבה בעובי 0.5 מ"מ ושכבה של מעל 30 מ"מ x 30 מ"מ של פולידימטילסילוקסן (PDMS) על-ידי ערבוב פתרון טרום-פולימר וחיבור צולב ביחס של 10:1 ולאחר מכן ריפוי ב-80°C למשך 3 שעות.
  2. חותכים את גיליון ה-PDMS ומקשרים אותו עם דבק סיליקון כדי לפברק מגש מלבני של 21 מ"מ x 20.5 מ"מ באורך 7 מ"מ, ברוחב 0.5 מ"מ ובצבים מלבניים בגובה 2.5 מ"מ בתנוחה מלבנית. מרווח אופקי בין שתי שורות של פוסטים הוא 2.5 מ"מ(איור 2B).
  3. אוטוקבל המגש ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. ציפוי המגש עם 1% poloxamer 407 ב PBS עבור 1 שעה. יש לשטוף את הפולוקסאמר 407 ולשטוף את התבנית ב-PBS מספיק לפני השימוש.

4. בניית ECT

  1. לאחר ניתוח תוחם התא, שלב את התאים מפרוטוקולי CM+EC ו- MC כך שהריכוז הסופי של MCs הוא 10 עד 20% במספר תא כולל של שישה מיליון תאים לכלמבנה 5.
  2. להשעות מעורב שישה מיליון תאים במדיום תרבות ECT (אלפא מינימום חיוני בינוני בתוספת עם 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol ו 100 U /mL פניצילין-סטרפטומיצין).
  3. הכנת פתרון מטריקס
    1. לערבב 133 μL של חומצה מסיסה זנב חולדה זנב קולגן סוג אני פתרון (2 מ"ג / מ"ל, pH 3) עם 17 μL של 10x מינימום חיוני בינוני (MEM). לאחר מכן לערבב את הפתרון עם 17 μL של מאגר אלקלי (0.2 M NaHCO3, 0.2 M HEPES, ו 0.1 M NaOH).
      הערה: יש לשמור על קולגן על קרח (4°C). בדוק את צבע המאגר ואם המדיום אינו הופך ורדש כאשר כל הפתרונות מעורבבים, הוסף מאגר אלקלי נוסף למדיום. שלבי ערבוב חייבים להיות שילוב קולגן I + MEM 10x ולאחר מכן להוסיף מאגר אלקלי. אל תשנה הזמנה זו. אל תיצור בועות בתמהיל.
    2. הוסף 67 μL של מטריצת קרום מרתף לפתרון קולגן מנוטרל.
      הערה: יש לשמור את הפתרון המעורב על קרח (4 °C).
  4. צנטריפוגה מתלי התא המוכן המכיל שישה מיליון תאים ב 1,100 סל"ד (240 x g)במשך 5 דקות ולתחל מחדש את התאים עם 167 μL של DMEM גלוקוז גבוה + 20% FBS + 1% פניצילין סטרפטומיצין (100x).
  5. ערבב את מתלי התא ואת פתרון המטריצה. הנפח הכולל של תערובת תא / מטריצה עבור מבנה אחד הוא 400 μL.
    הערה: תערובת התא/מטריקס צריכה להיות לא צמיגית וצבע ורדיד בשלב זה. שמור אותו על קרח כמו הג'ל יתגבש בטמפרטורת החדר. הריכוז הסופי של קולגן סוג אני הוא 0.67 מ"ג/מ"ל.
  6. יוצקים את תערובת התא / מטריקס באופן שווה על פולוקסאמר 407 מצופה PDMS רקמת עובש, אשר ממוקם בצלחת תרבות שש באר12.
    הערה: יוצקים את התערובת בזהירות כדי למנוע יצירת בועות כדי למנוע מילוי פגמים בג'ל שנשפך.
  7. דגירה את תערובת התא / מטריקס באינקובטור CO2 סטנדרטי (37C, 5 % CO2) במשך60 דקות.
  8. לאחר הרקמה נוצרת, להשרות את עובש הרקמה עם 4 מ"ל של ECT תרבות בינונית.
    הערה: למרות התא / מטריצה הוא crosslinked בתוך 60 דקות, המבנה הוא עדיין שביר מאוד. מוסיפים בעדינות מדיום כדי למנוע פגיעה בו.
  9. תרבות הרקמה במשך 14 ימים עם שינוי בינוני בכל יום.
  10. לפני השתלת ECT, הסר את ECT מעמדות הטעינה בעדינות באמצעות מפלצות עדינות מעוטרות.
    הערה: ממדי ECT הסופיים לאחר ההסרה מהתבנית הם פחות מהתבנית המקורית. תבנית 2.1 ס"מ על 2.05 ס"מ יוצרת ECT משוחרר של כ 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ. תבנית גדולה יותר באורך 3.9 ס"מ על 4.05 ס"מ יוצרת ECT של כ-3 ס"מ על 3 ס"מ. ECT לא פרוק מראה מכות ספונטניות פנימיות במדיום תרבות חמה. למרות שבתחילה הוא שומר על מבנה רשת שינוי, ECT לא פורק מתכווץ ומתעב לאורך זמן. ניתן להחזיק את הרקמה ברכות עם מלקות עדינות ולאחר מכן להשתמש בתפר משי 7-0 כדי לחבר את ECT לאפיקארדיום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1A,B מציג את השרטוטים של פרוטוקול CM+EC ו- MC. לאחר גורם CMs ו- ECs מפרוטוקול CM + EC ו- MCs פרוטוקול MC, התאים מעורבים התאמת ריכוזי MC הסופי לייצג 10 עד 20% של תאים הכולל. תבנית רקמה ברוחב 2 ס"מ מפוברקת על פי ציור העיצוב מגליון PDMS בעובי 0.5 מ"מ(איור 2א', ב). שישה מיליון תאי CM+EC+MC משולבים עם קולגן I, מטריצה ומוזגים על עובש הרקמה precoed עם poloxamer 407(איור 2C). במהלך ניסויים ראשוניים, מפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לאחר השלמת החקירה שלנו של פורמט ליניארי, hiPSC נגזר ECT5, התאמנו את הפרוטוקול כדי לערבב cMs נגזר hiPSC, ECs, ו- MCs כדי להקל על הרחבת מבחנה של תאי כלי דם בתוך ECTs ולאחר מכן צימוד כלי דם vivo בין ECTs ו שריר הלב הנמען.

כדי להקל על יצירת גיאומטריות ECT גדולות יותר, הניתנות להשתלה, השתמשנו בגיליונות PDMS דקים כדי לעצב את תבניות תלת-ממדיות עם עמדות טעינה מסודרות בעמדות מטלטלות. במהלך ניסויים ראשוניים, הערנו כי ECTs דבק הפוסטים PDMS במהלך דחיסת ג'ל ולכן שינינו את השיטה שלנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים כלכליים או מדעיים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית מחקר הלב לילדים של Kosair Charities באוניברסיטת לואיוויל ופרויקט אורגנואיד במרכז RIKEN לחקר דינמיקת מערכות ביולוגיות. HiPSCs בשימוש בפרוטוקולים שפורסמו שלנו סופקו על ידי המרכז למחקר ויישום תא iPS, אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
כלי תרבית תאים בסגנון 100x20 מ"מפלקון / תומאס סיינטיפיק9380C51
צלחות מרובות לתרבית תאים 6well 50 / CSFalcon / Thomas scientific6902A01
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning761036
<חזק>ריאגנטים
Accumaxטכנולוגיות תאים חדשניותAM-105
BMP4, רקומביננטי (10 ומיקרו; ז)מו"פ DRSD-314-BP-010
קולגן, תמיסה מסוג I מזנב עכברושSigmaC3867
גדילה מופחת גורם גדילה MatrigelCorning356231
Human VEGF (165) IS, Miltenyi בדרגת פרימיום130-109-385
פלורוניק F-127, 0.2 ומיקרו; m מסוננים (10% תמיסה במים)בדיקות מולקולריותP-6866
רקומביננטי אנושי bFGFWAKO060-04543
רקומביננטי אדם/עכבר/חולדה ActivinA (50&מיקרו; ז)מו"פ D338-AC-050
rh Wnt-3a (10µ ז)מו"פ D5036-WN
תמיסת VerseneGibco15040066
<חזק>מדיום תרבית ותוספי מזון
10x MEMInvitrogen11430
2 מרקפטרו אתנולSIGMAM6250
תוסף B27 מינוס אינסוליןGibco
Gibco11965084עם גלוקוז גבוה
(500 מ"ל)כל
סרום בקר עוברי (500 מ"ל)כל
L-גלוטמיןGibco
כל
PBS 1xGibco10010-031
פניצילין-סטרפטומיצין (5000 יח'/מ"ל)Gibco15070-063
RPMI1640בינוני Gibco21870092
&; MEMInvitrogen11900024
<חזק>Flowcytometry
אנטי-TRA-1-60, FITC, שיבוט: TRA-1-60, BD BiosciencesBD / Fisher560380
אנטי-טרופונין T, איזופורם לב Ab-1, שיבוט: 13-11, Thermo Scientific Lab VisionFisherMS-295-P0
BD FACS Clean תמיסהBD340345
BD FACSנוזל נדן חלושהBD342003
BD FACSתמיסת רינסBD340346
EDTAכל
שפופרת פלקון עם מכסה מסננת תאים (מארז של 500)בקר עוברי קורנינג352235
(500 מ"ל)כל
ערכת כתמי תאים מתים Aqua Fixable LIVE/DEAD, לבדיקות מולקולריות עירור של 405 ננומטרL34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, שיבוט: 28D4, BD BiosciencesBD / Fisher558821
SaponinSigma-Aldrich47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, שיבוט: 55-7H1, BD BiosciencesBD / Fisher560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 ערכת תיוגבדיקות מולקולריותZ25002
גורם A1895601 DMEM, סרום בקר עוברי 25030081-NaHCO3 סרום

מקורות

  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716(2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933(2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963(2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641(2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מבנים דמויי רשתתבנית רקמה מ-PDMSיישור קרדיומיוציטיםפרקציית וסקולרית סטרומליתמטריצת קולגןציפוי Poloxamer 407צרורות סיבי שריררגנרציה של הלב
הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.