הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ליצירת רקמות לב מהונדסות (ECTs) מדרגיות בצורת רשת המורכבות מתאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם, אשר מפותחים לקראת המטרה של שימוש קליני. קרדיומיוקיטים נגזר HiPSC, תאים אנדותל, ותאי ציור קיר כלי דם מעורבבים עם מטריצת ג'ל ולאחר מכן נשפכים לתוך עובש רקמה polydimethylsiloxane (PDMS) עם הודעות מלבניות פנימיות מטלטלות. ביום תרבות 14 ECTs להבשיל לתוך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ רשת מבנה עם חבילות myofiber קוטר 0.5 מ"מ. קרדיומיוציטים ליישר את הציר הארוך של כל צרור ולנצח באופן ספונטני באופן סינכרוני. ניתן לשנות את קנה המידה של גישה זו עד ECT רשת גדולה יותר (3.0 ס"מ x 3.0 ס"מ) תוך שמירה על התבגרות ופונקציה של מבנה. לכן, ECTs בצורת רשת המופקת מתאי לב הנגזרים על-ידי hiPSC עשויים להיות אפשריים עבור פרדיגמות התחדשות הלב.
מבוא
מחקרים פרה-קליניים רבים וניסויים קליניים אישרו את היעילות של טיפולים התחדשות לב מבוססי תאים עבורלבבות כושלים 1,,2,,3. בין סוגי תאים שונים, תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSCs) מבטיחים מקורות תאים מכוח יכולת ההתפשטות שלהם, פוטנציאל לייצר תוחינות לב וכלידם שונים 4,,5, ו allogenicity. בנוסף, טכנולוגיות הנדסת רקמות אפשרו להעביר מיליוני תאים ללבפגום 5,6,,,7,,8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תחזוקה של hiPSCs ובידול לב וכלי דם
- להרחיב ולתחזק hiPSCs על מטריצת קרום מרתף מעיל דק (גורם גדילה מופחת, 1:60 דילול) בינוני מותנה מופק פיברובלסטים עוברי העכבר (MEF-CM) עם גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי (hbFGF)4.
הערה: השתמשנו בקו hiPSCs (4 גורם (אוק3/4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc) שורה: 201B6). הוסף hbFGF בריכוז המתאים עבור כל קו תא. שבר Laminin-511 יכול לשמש גם לציפוי של צלחת תרבות במקום מטריצת קרום מרתף. אמצעי זמין מסחרית המיועד לתרבות ללא הזנה של hiPSCs יכול לשמש כתחליף ל- MEF-CM. - השתמש Versene (0.48 mM אתילנדיאמין טטראצטי חומצה (EDTA) פתרון) כדי לנתק ולנתק תאים כאשר קונפלוננס התא מגיע 90\u2012100%.
הערה: ניתן להשתמש גם....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1A,B מציג את השרטוטים של פרוטוקול CM+EC ו- MC. לאחר גורם CMs ו- ECs מפרוטוקול CM + EC ו- MCs פרוטוקול MC, התאים מעורבים התאמת ריכוזי MC הסופי לייצג 10 עד 20% של תאים הכולל. תבנית רקמה ברוחב 2 ס"מ מפוברקת על פי ציור העיצוב מגליון PDMS בעובי 0.5 מ"מ(איור 2א', ב). שישה מיליון תאי CM+EC+MC משולבים עם קולגן I, מטריצה ומוזגים על עובש הרקמה precoed עם poloxamer 407(איור 2C). במהלך ניסויים ראשוניים, מפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לאחר השלמת החקירה שלנו של פורמט ליניארי, hiPSC נגזר ECT5, התאמנו את הפרוטוקול כדי לערבב cMs נגזר hiPSC, ECs, ו- MCs כדי להקל על הרחבת מבחנה של תאי כלי דם בתוך ECTs ולאחר מכן צימוד כלי דם vivo בין ECTs ו שריר הלב הנמען.
כדי להקל על יצירת גיאומטריות ECT גדולות יותר, הניתנות להשתלה, השתמשנו בגיליונות PDMS דקים כדי לעצב את תבניות תלת-ממדיות עם עמדות טעינה מסודרות בעמדות מטלטלות. במהלך ניסויים ראשוניים, הערנו כי ECTs דבק הפוסטים PDMS במהלך דחיסת ג'ל ולכן שינינו את השיטה שלנו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין קונפליקטים כלכליים או מדעיים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית מחקר הלב לילדים של Kosair Charities באוניברסיטת לואיוויל ופרויקט אורגנואיד במרכז RIKEN לחקר דינמיקת מערכות ביולוגיות. HiPSCs בשימוש בפרוטוקולים שפורסמו שלנו סופקו על ידי המרכז למחקר ויישום תא iPS, אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים | |||
| כלי תרבית תאים בסגנון 100x20 מ"מ | פלקון / תומאס סיינטיפיק | 9380C51 | |
| צלחות מרובות לתרבית תאים 6well 50 / CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון | Dow Corning | 761036 | |
| <חזק>ריאגנטים | |||
| Accumax | טכנולוגיות תאים חדשניות | AM-105 | |
| BMP4, רקומביננטי (10 ומיקרו; ז) | מו"פ D | RSD-314-BP-010 | |
| קולגן, תמיסה מסוג I מזנב עכברוש | Sigma | C3867 | |
| גדילה מופחת גורם גדילה Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, Miltenyi בדרגת פרימיום | 130-109-385 | ||
| פלורוניק F-127, 0.2 ומיקרו; m מסוננים (10% תמיסה במים) | בדיקות מולקולריות | P-6866 | |
| רקומביננטי אנושי bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| רקומביננטי אדם/עכבר/חולדה ActivinA (50&מיקרו; ז) | מו"פ D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µ ז) | מו"פ D | 5036-WN | |
| תמיסת Versene | Gibco | 15040066 | |
| <חזק>מדיום תרבית ותוספי מזון | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 מרקפטרו אתנול | SIGMA | M6250 | |
| תוסף B27 מינוס אינסולין | Gibco | ||
| Gibco | 11965084 | עם גלוקוז גבוה | |
| (500 מ"ל) | כל | ||
| סרום בקר עוברי (500 מ"ל) | כל | ||
| L-גלוטמין | Gibco | ||
| כל | |||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (5000 יח'/מ"ל) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 | בינוני Gibco | 21870092 | |
| &; MEM | Invitrogen | 11900024 | |
| <חזק>Flowcytometry | |||
| אנטי-TRA-1-60, FITC, שיבוט: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| אנטי-טרופונין T, איזופורם לב Ab-1, שיבוט: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean תמיסה | BD | 340345 | |
| BD FACSנוזל נדן חלושה | BD | 342003 | |
| BD FACSתמיסת רינס | BD | 340346 | |
| EDTA | כל | ||
| שפופרת פלקון עם מכסה מסננת תאים (מארז של 500) | בקר עוברי קורנינג | 352235 | |
| (500 מ"ל) | כל | ||
| ערכת כתמי תאים מתים Aqua Fixable LIVE/DEAD, לבדיקות מולקולריות עירור של 405 ננומטר | L34957 | ||
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, שיבוט: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, שיבוט: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 ערכת תיוג | בדיקות מולקולריות | Z25002 |
מקורות
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
