הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

4.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61258

⸱

8 במאי 2020

 , 
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תקציר

קינאזים פולינוקלאוטידים (PNKs) הם אנזימים כי לזליז את הפוספורילציה של 5 ' סוף הידרוקסיל של DNA ו RNA אוליגונוקליאוטידים. ניתן לכמת את הפעילות של PNKs באמצעות גישות ישירות או עקיפות. מוצג כאן היא גישה ישירה, במבחנה כדי למדוד פעילות PNK המסתמכת על פלורסנט תיוג אוליגונוקלאוטיד ואלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide. גישה זו מספקת רזולוציה של המוצרים זרחן תוך הימנעות משימוש ב מצעים עם תייבל רדיו. הפרוטוקול מפרט כיצד להגדיר את תגובת פוספורילציה, להכין ולהפעיל ג'לים פוליקרילאמיד גדולים, ולכימת את מוצרי התגובה. החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית של תס"א זה הוא לשפוך ולהריץ את ג'לים פוליקרילאמיד גדולים; לפיכך, מסופקים פרטים חשובים להתגבר על קשיים נפוצים. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור Grc3, PNK מירכב לתוך מתחם עיבוד RNA pre-ribosomal מחויב עם השותף המחייב שלה, גרעין Las1. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי למדוד את הפעילות של אנזימי PNK אחרים. יתר על כן, ניתן גם לשנות את ההתארגנות הזו כדי לקבוע את ההשפעות של רכיבים שונים של התגובה, כגון טריפוספט נוקלאוטיד, יונים מתכת, ואוליגונוקליאוטידים.

מבוא

קינאזים פולינוקלאוטידים (PNK) לשחק תפקידים קריטיים רבים DNA ו- RNA עיבוד מסלולים, כגון תיקון DNA והרכבת ריבוזום1,,2,,3,,4,,5. אנזימים בסיסיים אלה מקטנים את העברת המונופוספט של המסוף (גמא) מפרופסוף נוקלאוטיד (NTP, לרוב ATP) לקצה ההידרוקסיל של 5 אינץ' של מלת נוקלאוטיד. אחד PNKs המאופיין היטב ביותר הוא bacteriophage T4 PNK, אשר יש ספציפיות שקוע רחב והוא מנוצל בכבדות על ידי מעבדות ביולוגיה מולקולרית לשילוב תוויות איזוטופ רדיואקטיבי על 5 מסוף של DNA או RNA בטוב6, 7,8,,,9,,10,,11,,12.8 דוגמה נוספת של אנזים PNK היא CLP1, אשר נמצא Eukarya, Eubacteria, ו Archaea, והוא מעורב במספר מסלולי עיבוד RNA4,13,14,15.

מבחינה היסטורית, רוב ההתמרמרות המודדות את פעילות הקינאז הפולינוקלאוטיד תלויות בתיוג איזוטופ רדיואקטיביובאוטוביוגרפיה הבאה 5,16. בשנים האחרונות פותחו מספר בדיקות נוספות כדי למדוד את פעילות PNK, כולל גישות מולקולה אחת, אלקטרופורזה שבב, משואות מולקולריות,כמו גם צבעיםומבוססי זוהר 17,18,19,20,21,22., בעוד שרבות מהגישות החדשות הללו מספקות מגבלות זיהוי משופרות ומומנעות משימוש ברדיואקטיביות, לכל אחת מהן יש חסרונות, כגון עלות, הסתמכות על שרף משותק ומגבלות בבחירה במצוע.

Grc3 הוא קינאז polynucleotide המי משחק תפקיד מרכזי בעיבוד של RNA טרום ריבוזומאל2,,3,,23. Grc3 מהווה קומפלקס מחייב עם ה-endoribonuclease Las1, אשר מפצל את ה-Spacer הפנימי 2 (ITS2) של ה-RNA הטרום-ריבוזומל3. מחשוף של ITS2 על ידי Las1 מייצר מוצר מחסה 5 ' הידרוקסיל כי הוא לאחר מכן זרחן על ידי הקינאז Grc33. כדי לחקור את הנוקלאוטיד ואת ספציפיות מצע של Grc3, תסרוקת זולה שאיפשרה בדיקה של מצעים oligonucleotide שונים נדרש. לכן, פותחה תסרוק פוספורילציה PNK באמצעות מצעים עם תווית פלורסנטית. תסיסה זו שימשה בהצלחה כדי לקבוע כי Grc3 יכול לנצל כל NTP עבור פעילות העברת פוספוריל, אבל מעדיף ATP24. פרוטוקול זה מתאים את ההסכם המקורי כדי למדוד את פעילות PNK של Grc3 על חיקוי RNA של העיבוד הטרום-ריבוזומאלי שלו RNA (SC-ITS2, טבלה 1). אחד ההיבטים המאתגרים של גישה זו מבוססת פלואורסץ הוא ההסתמכות על ג'לים פוליאקרילאמיד גדולים כדי לפתור ביעילות מצעים זרחן ולא זרחן. הפרוטוקול מספק פרטים ספציפיים על איך לשפוך ג'לים גדולים אלה ולהימנע מלכודות נפוצות בעת ביצוע פעולה זו.

עבודה עם RNA דורשת טיפול מסוים כי הוא רגיש מאוד להשפלה. ישנם צעדי מניעה פשוטים שניתן לנקוט כדי להגביל את זיהום ריבונוקלאז. תחנת עבודה נפרדת RNA שניתן לטפל בה בקלות עם חומר ניקוי המכיל מעכב RNase היא לעתים קרובות מועילה. יש צורך ללבוש כפפות תמיד בעת טיפול בדגימות ושימוש בחומרים מתכלים מאושרים ללא RNase. מכיוון שהמים הם מקור נפוץ נוסף לזיהום, עדיף להשתמש במים מטוהרים טריים ולחטא את כל הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 μm.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה

  1. הכן מאגר ים ותריגנטים.
    1. להפוך 1x מאגר תגובה על ידי שילוב 20 μL של 1 M Tris (pH = 8.0), 40 μL של 5 M נתרן כלוריד, 2.5 μL של 2 M מגנזיום כלוריד, 100 μL של 50% (v /v) גליצרול, ומים RNase ללא להגיע נפח כולל של 1 mL.
    2. להפוך את אוריאה טעינת צבע על ידי שילוב 4.8 גרם של אוריאה, 200 μL של 1 M Tris (pH = 8.0), 20 μL של 0.5 M EDTA (pH = 8.0), 0.5 מ"ל של 1% (w / v) ברומונול כחול, ומים RNase ללא להגיע לנפח כולל של 10 מ"ל.
    3. הפוך את מאגר TBE 10x על-ידי שילוב 108 גרם של בסיס Tris, 55 גרם של חומצה בור, 40 מ"ל של 0.5 M EDTA (pH = 8.0), ומים ללא RNase כדי להגיע לנפח כולל של 1 L.
    4. להפוך 10% (w / v) אמוניום שכנוע (APS). לשקול 0.5 גרם של APS ולהוסיף 3 מ"ל של מים ללא RNase כדי להמיס את המוצק. הוסף מים ללא RNase כדי להגיע לנפח כולל של 5 מ"ל. עוטפים את הצינור בנייר כסף ומאחסנים את הפתרון ב-4°C.
      הערה: APS מומס נרקב לאורך זמן. החלף את מניית APS ב-10% כל שבועיים.
  2. להשיג אנזים קינאז פולינוקלאוטיד.
    1. לרכוש טהור Las1-Grc3 PNKאנזים 2 מאוחסן מאגר תגובה (ראה שלב 1.1.1) בריכוז מלאי של 20 μM. מאגר האחסון ישתנה בהתאם ל- PNK הספציפי.
  3. הכן את החומצה הגרעינית.
    הערה: פרוטוקול זה מפקח על 5'-phosphorylation של 27 nt RNA מסעדה המקיש את אתר העיבוד Las1-Grc3 (אתר C2) הכלול בתוך Saccharomyces cerevisiae pre-ribosomal פנימי תמלול רווח 2 (SC-ITS2; ראה טבלה 1)2,25,26.
    1. לסנתז כימית את הצוללת RNA אוליגונוקלאוטיד המכילה קצה הידרוקסיל 5'-הידרוקסיל יחד עם תווית 3'-פלורסנט. הפלואורופור ישמש להדמיה של ה-RNA. ודא כי פלואורופור ממוקם בקצה RNA כי אינו ממוקד עבור פוספורילציה. כחלופה למקורות מסחריים, ניתן לבצע תיוג פלורסנט פנימי ומסוף של מצעי RNA בתוך הבית באמצעות פרוטוקוליםחסכוניים 27.
    2. הסר פלואורופור עודף מתגובת תיוג RNA על-ידי HPLC-טיהור28.
    3. תוסתה מחדש את ה-RNA הליופי באמצעות מים ללא RNase ל-500 000 000 000 00:00:00,000 -------------------------------
    4. אחסן 10 אלציטוט RNA ב- -80°C לאחסון לטווח ארוך או -20°C לאחסון לטווח קצר.
  4. הכן את סדרת ריכוז ATP.
    1. הפוך את מלאי עבודה של 20 mM של ATP באמצעות מאגר תגובה (ראה שלב 1.1.1). השתמש במלאי עובד זה כדי ליצור ארבעה דילולים טוריים הנעים בין 20 mM-0.02 mM.
    2. כדי לבצע את דילול הראשון של סדרת הריכוז, לערבב 1 μL של 20 mM ATP עובד מניות עם 9 μL של מאגר תגובה. כתוצאה מכך דילול פי 10 של ATP עם ריכוז סופי של 2 מ"מ.
    3. השתמש במלאי ATP של 2 מ"מ שנוצר בשלב 1.4.2 כדי לבצע דילול הבא בסדרת הריכוז. לערבב 1 μL של 2 mM ATP מניות עם 9 μL של מאגר תגובה. זה יעשה ריכוז מניות ATP חדש של 0.2 mM.
    4. המשך דילול 1 μL של מניית ATP הקודמת עם 9 μL של מאגר תגובה כדי להפוך את מניית ATP עוקבות בסדרת הריכוז.

2. במבחנה RNA קינאז תגובה

הערה: ניתן להשתמש בהנאה זו כדי למדוד מספר משתנים כגון זמן, רמות נוקלאוטיד או ריכוז אנזימים. מטרת הניסוי היא להעריך את כמות RNA זרחן בנוכחות קבוע Las1-Grc3 מורכב ורמות ATP שונות.

  1. עבור כל תגובה קינאז RNA-אנזים, לשלב 1 μL של 500 nM RNA substrate, 8.3 μL של 130 nM Las1-Grc3, ו 0.2 μL של 5 mM EDTA.
    הערה: אם ביצוע מספר תגובות, להכין מלאי ראשי של תערובת RNA-אנזים aliquot 9.5 μL של תערובת מאסטר זה לכל צינור תגובה.
  2. תתחיל עם ההתנייעות.
    1. הגדר את בלוק החום ל- 37 °C.
    2. במרווחי זמן של 10 שניות, לערבב 0.5 μL של תת-סטוק ATP אחד מסדרת ריכוז ATP מוכן בשלב 1.4 עם תערובת אחת RNA-אנזים ולמקם את התגובה בבלוק חום 37 מעלות C.
      הערה: הוסף 0.5 μL של מאגר תגובה במקום ATP לתערובת אחת RNA-אנזים עבור שליטה שלילית PNK. השתמש בפקד הכרחי אחר גם (כלומר, פגם RNA בהיעדר אנזים PNK).
    3. דגירה את התגובות במשך 60 דקות ב 37 °C.
      הערה: RNA עם תווית פלורסנטית הוא רגיש לאור; לכן, לכסות את התגובות עם רדיד.
    4. באמצעות אותו סדר כמו בשלב 2.2.2, להרוות כל תגובה כל 10 s על ידי spiking התגובה עם 10 μL של צבע טעינת אוריאה (ראה שלב 1.1.2).
      הערה: בנוסף 4 M urea, חלבון K עשוי להתווסף בשלב זה כדי להשפיל את האנזים. בצע את ההוראות שסופקו על-ידי הספק כדי לקבוע את כמות הפרוטאז הנדרשת ואת תנאי התגובה.
    5. השתמש במבחנה מרווה במבחנה קינאז תגובות מיד לניתוח במורד הזרם (ראה סעיף 3) או לאחסן ב -20 °C כדי להיות מנותח במועד מאוחר יותר.

3. אלקטרופורזה ג'ל

  1. הכן 15% acrylamide / 8 M תמיסת ג'ל אוריאה.
    התראה: Acrylamide חייב להיות מטופל בזהירות, כי זה רעלן עצבי. תמיד ללבוש כפפות, חלוק מעבדה, ומגן בעת טיפול בו.
    1. ב זכוכית 150 מל, לשלב 22.5 מל של premixed 40% acrylamide / bis-acrylamide 29:1 פתרון, 6 מל של 10x TBE (ראה שלב 1.1.3), 28.8 גרם אוריאה, ומים RNase חינם לנפח כולל של 59 מל. מערבבים בעדינות את התמיסה.
      הערה: בהתאם לאורך ה-RNA, שינוי אחוז הפוליאקרילאמיד עשוי לשפר את הרזולוציה בין RNA לא זרחן לבין RNA זרחן.
    2. כדי להמיס את אוריאה, מחממים את התמיסה במיקרוגל ל-20 ש', מערבבים את הנוזל ומזרים מיד את התמיסה בחזרה למיקרוגל ל-20 שניות נוספות. מערבבים בעדינות את התמיסה עד שהתריאה נמסה לחלוטין.
    3. לאט לאט לקרר את הפתרון על ידי הצבת הזכוכית לתוך אמבט מים רדודים המכיל מים קרים. ודא כי רמת המים הקרים המקיפים את הזכוכית היא מעל רמת הפתרון בתוך הזכוכית. זה יקדם העברת חום יעילה. חכה 5 דקות.
      הערה: אל תמשיך בפרוטוקול זה אם הזכוכית מרגישה חמה; המים צריכים להיות מתחת 25 מעלות צלזיוס. אם זה עדיין מרגיש חם אחרי 5 דקות, אז להחליף את המים באמבט המים עם מים קרים טריים ולחכות עוד 5 דקות.
    4. לסנן degas הפתרון באמצעות יחידת סינון חד פעמית 0.22 μm כדי להסיר חלקיקים ובועות אוויר מיקרוסקופיות.
  2. יוצקים את הג'ל הנוקב.
    1. השתמשו בסבון ומים חמים כדי לנקות צלחת זכוכית קצרה וארוך המיועדת לג'לים עם ממדים כוללים של 31.0 ס"מ על 38.5 ס"מ. מרססים כל צלחת זכוכית עם 95% אתנול ומנגבים את הזכוכית כדי להסיר לחות.
      הערה: אחת משתי הצלחות יכולה להיות סיליקון כדי למנוע נזק לג'ל בעת הפרדת כריך צלחת הזכוכית. עם זאת, שלב זה אינו נחוץ מכיוון פרוטוקול זה נועד לדמיין את RNA מבלי להפריד את לוחות הזכוכית.
    2. מניחים את צלחת הזכוכית הארוכה אופקית על גבי קופסה כך שהיא מורמת מעל הספסל.
      התראה: Acrylamide הוא רעיל, ולכן תחנת שפיכת הג'ל חייב להיות מכוסה בנייר ספסל שיכול לספוג כל נוזל שנשפך ולהיות ממוקם באופן מיידי בשקית פסולת לאחר השלמת ההליך.
    3. מניחים מקשר נקי 0.4 מ"מ לאורך הקצוות הארוכים של לוח הזכוכית הארוך.
    4. מניחים את צלחת הזכוכית הקצרה על הצלחת הארוכה ומוודאים שקצוות הצלחת הקצרה, הלוח הארוך והשטחים מיושרים. מהדקים כל צד באמצעות שלושה מהדקי מתכת במותך שווה.
    5. הוסף 24 μL של TEMED לפתרון 15% acrylamide/8 M אוריאה מוכן בשלב 3.1 ולערבב את הפתרון.
    6. הוסף 600 μL של 10% (w/v) APS (ראה שלב 1.1.4) לפתרון בשלב 3.2.5 ולערבב בעדינות את הפתרון.
    7. מיד יוצקים את הפתרון בין צלחות הזכוכית.
      הערה: כדי למנוע בועות, הקש על הזכוכית בזמן מוזג הפתרון.
    8. בזהירות להוסיף נקי, 0.4 מ"מ, 32 גם מסרק לראש כריך צלחת זכוכית.
    9. אפשר מינימום של 30 דקות עבור אקרילאמיד פולימר.
  3. תריץ את הג'ל הנוקב.
    1. הגדר את בלוק החום ל- 75 °C.
    2. הסר את מהדקי המתכת המחזיקים יחד את כריך צלחת הזכוכית ושוטפים ביסודיות ויבשים את כריך צלחת הזכוכית.
    3. מניחים את כריך צלחת הזכוכית לתוך אפליקציית הג'ל עם צלחת קצרה פונה פנימה.
    4. הכן מאגר פועל של 0.5x TBE על-ידי שילוב של 100 מ"ל של TBE של 10x עם מים ללא RNase של 1.9 L RNase. הוסף 600 מ"ל של מאגר הריצה לתאים העליונים והתוארים של אפליקציית הג'ל.
    5. מסירים בעדינות את המסרק וצורף היטב את הבארות באמצעות מזרק.
      הערה: שלב זה הוא קריטי להסרת אוריאה מהבארות.
    6. הפעל מראש את הג'ל במשך 30 דקות ב- 50 W. מתח הוא כ 2,000 V.
      התראה: אפליקציית ג'ל זו פועלת בהספק גבוה ועל המשתמשים להפגין אמצעי זהירות.
    7. יש לשטוף את הבארות ביסודיות באמצעות מזרק.
      הערה: שלב זה הוא קריטי אפילו לטעינת דגימה לתוך הבארים.
    8. הדופק מסובב את התגובות המיוות ממדרגה 2.2.5. לאחר מכן דגירה את הצינורות ב 75 ° C במשך 3 דקות. חזור על סיבוב הדופק.
    9. מיד לטעון 10 μL של מדגם לכל טוב ולהפעיל את הג'ל במשך 3 שעות ב 50 W.
      הערה: RNA עם תווית פלורסנטית הוא רגיש לאור; לכן, לכסות את אפליקציית הג'ל בנייר כסף.
  4. דמיין את הג'ל הנוקב.
    1. כבה את ספק הכוח ורוקן את התא העליון של מערכת הג'ל.
    2. לשטוף וייבש את הצד החלקי של כריך צלחת הזכוכית באמצעות סבון ומים. מכסים את כריך צלחת הזכוכית בנייר כסף תוך כדי הובלת הג'ל.
    3. הר את כריך צלחת הזכוכית על הבמה של סורק לייזר המסוגל לזיהוי פלואורסצנס כמותי ורגיש.
      הערה: ג'ל זה הוא דק מאוד עבור רזולוציה מקסימלית. מסיבה זו, פרוטוקול זה נועד למנוע את הקשיים של הסרת הג'ל מסנדוויץ צלחת הזכוכית על ידי הדמיה ישירה RNA תיוג פלורסנט דרך צלחות הזכוכית. השימוש של לוחות זכוכית פלואורסצנס נמוך זמין מסחרי תגביר את האות שנתפסו על ידי שיפור יחס אות לרעש.
    4. הגדר את אורכי הגל של העירור והפליטה של סורק הלייזר עבור הפלואורופור הרצוי.
      הערה: אורכי הגל של העירור והפליטה האופטימליים עשויים להיות שונים עבור פלואורופורים ספציפיים. עבור פלואורופור FAM, אורכי גל העירור והפליטה הם 495 נה"מ ו- 535 נה"מ, בהתאמה.
    5. הגדר את האזור כך שיזוין על במת סורק הלייזר ותמונה הג'ל בהתאם להוראות היצרן (איור 1).

4. ניתוח תמונה וכמות אותות

  1. טען את תמונת הג'ל הדיגיטלית שנרכשה בשלב 3.4.5 לתוכנת תחינת תמונה (ראה טבלת חומרים).
  2. באמצעות הלחצן השמאלי של העכבר, לחץ וגרור מלבן כדי להגדיר תיבת תבנית כדי לסמן את הגבולות בתדמית הג'ל הדיגיטלית שישמש לכמת כל רצועה RNA. להקת RNA לראות את תערובת התגובה להגדיר בהיעדר אנזים PNK היא בדרך כלל להקה טובה כדי ליצור תבנית זו.
    הערה: כדי למנוע הטיה הנגרמת על-ידי אות רקע, חשוב שהאזור המקיף כל רצועה RNA הנמדדת זהה. מסיבה זו, עדיף להשתמש באותה תיבת תבנית כדי לפענח כל רצועה RNA.
  3. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה תחת "כלים" וסמן את מיקום תיבת התבנית על-ידי לחיצה על "הוסף".
    הערה: תוכניות כמות יכולות גם לצייר תיבות באופן אוטומטי בהתאם למדריך למשתמש של התוכנה.
  4. באמצעות הלחצן השמאלי של העכבר, לחץ וגרור את תיבת התבנית אל פס ה- RNA הבא וחזור על שלב 4.3. המשיכו בתהליך זה עד שהמיקום של כל להקות ה-RNA הלא פוספוריות והזרחן בכל תגובה סומנו.
  5. מדוד את הצפיפות המשולבת בתוך כל תיבה על-ידי לחיצה על "מידה" ב-ROI Manager.
  6. כדי לחשב את הכמות היחסית של RNA זרחן בתגובה, לחלק את הצפיפות המשולבת של פס RNA זרחן על ידי סכום הצפיפות המשולבת של להקות RNA לא זרחן זרחן מאותה תגובה. ניתן להחיל גישה זו גם כדי לחשב את הכמות היחסית של RNA לא זרחן.
  7. כדי לדמיין את ההצטברות של מוצר RNA זרחן ואת הדלדול המתאים של RNA לא זרחן על פני סדרת ריכוז ATP, להתוות את הכמות היחסית של RNA מחושב בשלב 4.6 נגד הריכוז של ATP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ג'ל מייצג מוצלח של טיתור של ATP עם כמות קבועה של קומפלקס Las1-Grc3 מוצג באות 1. תוספת של אנזים הביאה למחשוף RNA בתיווך Las1 של ה-SC-ITS2 RNA, מה שהוביל לשבר RNA מוגדר (5-OH C2 RNA). עם התוספת של ATP, שבר RNA C2 היה זרחן על ידי Grc3 PNK (5-P C2 RNA). בג'לים denaturing RNA זרחן נודד מהר יותר מאשר מקבילו לא זרחן. כפי המוצג באות 2, פוספורילציה של שבר RNA C2 ניתן לדמיין על ידי התוויית הכמות היחסית של RNA C2 זרחן זרחן נגד ריכוז ATP. Gr...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מתואר הוא אזהרה כדי למדוד את פעילות kinase של Grc3 PNK על מצעי נוקלאוטיד נוקלאוטיד תיוג פלורסנט. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי לאפיין אנזימי PNK אחרים על ידי התאמת מאגר התגובה ומולת oligonucleotide. לדוגמה, הפרוטוקול דורש כמות מעקב של EDTA. התוספת של EDTA היא מועילה משתי סיבות: ראשית, גישה זו מעדיפה מגנזיום כבול Grc3 על ידי מניעת האנזים מאיגוד כדי לעקוב אחר כמויות של מתכות מזהמות בתערובת. שנית, כמות קטנה של EDTA מעכבת את הפעילות של ריבוזונוקלאז תלוי מתכת מזהם מבלי לשבש את הפעילות של ribonuclease מתכת הקשורים לאס1. הריכוז של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר אנדרו סיקמה ואנדראה קמינסקי על הקריאה הביקורתית שלהם בכתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארה"ב למחקר פנים-עצבי; המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה בארה"ב (NIEHS; ZIA ES103247 ל-R.E.S) והכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR; 146626 ל-M.C.P).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.4 מ"מ מסרק 34 בארותBioRad1653848
מרווח 0.4 מ"מBioRad1653812
0.5 מ' EDTA pH 8.0KD רפואיRGF-3130
1M מגנזיום כלורידKD רפואיCAC-5290
1M Tris pH 8.0KD רפואיRGF-3360
40% אקרילאמיד/תמיסת ביס 29:1BioRad
5M נתרן כלוריKD רפואיRGF-3720
אמוניום פרסולפט (APS)BioRad161-0700
ATPSigmaA2383-1G
חומצה בוריתSigmaB0394
ברומופנול מלח נתרן כחולSigmaB5525-5G
צלחות זכוכיתתומאס סיינטיפיק1188K51
Hoefer SQ3 SequencerHoeferN/A
Image J SoftwareN/A N/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotidesIDTהזמנה מותאמת אישית
Pharmacia EPS 3500 ספק כוחPharmaciaN / A
Steriflip 0. 22 um FilterMillipore5FCP00525
TEMEDBioRad161-0800
tris baseSigmaTRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imagerGE HealthcareN/A
Ultra Pure DEPC WaterInvitrogen750023
Ultra Pure GlycerolInvitrogen19E1056865
אוריאהפישר כימיקלU15-500
1610146

מקורות

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת פעילות פולינוקלאוטיד קינאזסובסטרט אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמידהכנת ג'ל דנטורטיביניסוי טיטרציה של ATPפוספורילציה של סובסטרט RNAקומפלקס Grc3 Las1צבע טעינה עם Ureaפולימריזציה באמצעות TEMED APSדימיון באמצעות סורק לייזר
תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.