תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תקציר

קינאזים פולינוקלאוטידים (PNKs) הם אנזימים כי לזליז את הפוספורילציה של 5 ' סוף הידרוקסיל של DNA ו RNA אוליגונוקליאוטידים. ניתן לכמת את הפעילות של PNKs באמצעות גישות ישירות או עקיפות. מוצג כאן היא גישה ישירה, במבחנה כדי למדוד פעילות PNK המסתמכת על פלורסנט תיוג אוליגונוקלאוטיד ואלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide. גישה זו מספקת רזולוציה של המוצרים זרחן תוך הימנעות משימוש ב מצעים עם תייבל רדיו. הפרוטוקול מפרט כיצד להגדיר את תגובת פוספורילציה, להכין ולהפעיל ג'לים פוליקרילאמיד גדולים, ולכימת את מוצרי התגובה. החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית של תס"א זה הוא לשפוך ולהריץ את ג'לים פוליקרילאמיד גדולים; לפיכך, מסופקים פרטים חשובים להתגבר על קשיים נפוצים. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור Grc3, PNK מירכב לתוך מתחם עיבוד RNA pre-ribosomal מחויב עם השותף המחייב שלה, גרעין Las1. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי למדוד את הפעילות של אנזימי PNK אחרים. יתר על כן, ניתן גם לשנות את ההתארגנות הזו כדי לקבוע את ההשפעות של רכיבים שונים של התגובה, כגון טריפוספט נוקלאוטיד, יונים מתכת, ואוליגונוקליאוטידים.

מבוא

קינאזים פולינוקלאוטידים (PNK) לשחק תפקידים קריטיים רבים DNA ו- RNA עיבוד מסלולים, כגון תיקון DNA והרכבת ריבוזום^{1,,2,,3,,4,,5}. אנזימים בסיסיים אלה מקטנים את העברת המונופוספט של המסוף (גמא) מפרופסוף נוקלאוטיד (NTP, לרוב ATP) לקצה ההידרוקסיל של 5 אינץ' של מלת נוקלאוטיד. אחד PNKs המאופיין היטב ביותר הוא bacteriophage T4 PNK, אשר יש ספציפיות שקוע רחב והוא מנוצל בכבדות על ידי מעבדות ביולוגיה מולקולרית לשילוב תוויות איזוטופ רדיואקטיבי על 5 מסוף של DNA או RNA בטוב^{6, 7,}

פרוטוקול

1. הכנה

1. הכן מאגר ים ותריגנטים.
   1. להפוך 1x מאגר תגובה על ידי שילוב 20 μL של 1 M Tris (pH = 8.0), 40 μL של 5 M נתרן כלוריד, 2.5 μL של 2 M מגנזיום כלוריד, 100 μL של 50% (v /v) גליצרול, ומים RNase ללא להגיע נפח כולל של 1 mL.
   2. להפוך את אוריאה טעינת צבע על ידי שילוב 4.8 גרם של אוריאה, 200 μL של 1 M Tris (pH = 8.0), 20 μL של 0.5 M EDTA (pH = 8.0), 0.5 מ"ל של 1% (w / v) ברומונול כחול, ומים RNase ללא להגיע לנפח כולל של 10 מ"ל.
   3. הפוך את מאגר TBE 10x על-ידי שילוב 108 גרם של בסיס Tris, 55 גרם של חומצה בור, 40 מ"ל של 0.5 M EDTA (pH = 8.0), ומים ללא RNase כדי להגיע לנפח כולל של 1 L.
   4. להפוך 10% (w / v) אמוניום שכנוע (APS). לשקול 0.5 גרם ....

תוצאות

ג'ל מייצג מוצלח של טיתור של ATP עם כמות קבועה של קומפלקס Las1-Grc3 מוצג באות 1. תוספת של אנזים הביאה למחשוף RNA בתיווך Las1 של ה-SC-ITS2 RNA, מה שהוביל לשבר RNA מוגדר (5-OH C2 RNA). עם התוספת של ATP, שבר RNA C2 היה זרחן על ידי Grc3 PNK (5-P C2 RNA). בג'לים denaturing RNA זרחן נודד מהר יותר מאשר מקבילו לא זרחן. כפי המוצג באות 2, פוספורילציה של שבר RNA C2 ניתן לדמיין על ידי התוויית הכמות היחסית של RNA C2 זרחן זרחן נגד ריכוז ATP. Gr.......

דיון

מתואר הוא אזהרה כדי למדוד את פעילות kinase של Grc3 PNK על מצעי נוקלאוטיד נוקלאוטיד תיוג פלורסנט. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי לאפיין אנזימי PNK אחרים על ידי התאמת מאגר התגובה ומולת oligonucleotide. לדוגמה, הפרוטוקול דורש כמות מעקב של EDTA. התוספת של EDTA היא מועילה משתי סיבות: ראשית, גישה זו מעדיפה מגנזיום כבול Grc3 על ידי מניעת האנזים מאיגוד כדי לעקוב אחר כמויות של מתכות מזהמות בתערובת. שנית, כמות קטנה של EDTA מעכבת את הפעילות של ריבוזונוקלאז תלוי מתכת מזהם מבלי לשבש את הפעילות של ribonuclease מתכת הקשורים לאס1. הריכוז של.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.4 מ"מ מסרק 34 בארות	BioRad	1653848
מרווח 0.4 מ"מ	BioRad	1653812
0.5 מ' EDTA pH 8.0	KD רפואי	RGF-3130
1M מגנזיום כלוריד	KD רפואי	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD רפואי	RGF-3360
40% אקרילאמיד/תמיסת ביס 29:1	BioRad
5M נתרן כלורי	KD רפואי	RGF-3720
אמוניום פרסולפט (APS)	BioRad	161-0700
ATP	Sigma	A2383-1G
חומצה בורית	Sigma	B0394
ברומופנול מלח נתרן כחול	Sigma	B5525-5G
צלחות זכוכית	תומאס סיינטיפיק	1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer	Hoefer	N/A
Image J Software	N/	A N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides	IDT	הזמנה מותאמת אישית
Pharmacia EPS 3500 ספק כוח	Pharmacia	N / A
Steriflip 0. 22 um Filter	Millipore	5FCP00525
TEMED	BioRad	161-0800
tris base	Sigma	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager	GE Healthcare	N/A
Ultra Pure DEPC Water	Invitrogen	750023
Ultra Pure Glycerol	Invitrogen	19E1056865
אוריאה	פישר כימיקל	U15-500

1610146