מאמר שיטה

פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח לייצור דגמי תרבות תלת-ממדית מבוססי הידרוג'ל באופן אוטומטי ומתוקנן

DOI:

10.3791/61261

⸱

31 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre in Regenerative Medicine, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 2School of Mechanical, Medical and Process Engineering, Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Australian Prostate Cancer Research Centre, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 6ARC ITTC in Additive Biomanufacturing, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משמש כמדריך מקיף לערבוב סטנדרטי וניתן לשחזור של חומרים צמיגים עם טכנולוגיית אוטומציה חדשנית בקוד פתוח. הוראות מפורטות ניתנות על פעולתה של תחנת עבודה בקוד פתוח שפותחה לאחרונה, על השימוש במעצב פרוטוקול קוד פתוח ועל האימות והאימות לזיהוי תערובות הניתנות לשחזור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבי הערבוב הנוכחיים של חומרים צמיגים מסתמכים על משימות שחוזרות על עצמן וגוזלות זמן רב, המבוצעות בעיקר באופן ידני במצב תפוקה נמוכה. בעיות אלה מייצגות חסרונות בזרימות עבודה שעלולות בסופו של דבר לגרום ליחס הדדי של ממצאי מחקר. זרימות עבודה ידניות מגבילות עוד יותר את ההתקדמות והאימוץ הנרחב של חומרים צמיגיים, כגון הידרוג'לים המשמשים ליישומים ביו-רפואיים. ניתן להתגבר על אתגרים אלה באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות עם תהליכי ערבוב סטנדרטיים כדי להגביר את יכולת הרבייה. במחקר זה, אנו מציגים הוראות שלב אחר שלב לשימוש במעצב פרוטוקול קוד פתוח, להפעלת תחנת עבודה בקוד פתוח ולזיהוי תערובות הניתנות לשחזור. באופן ספציפי, מעצב פרוטוקול הקוד הפתוח מנחה את המשתמש באמצעות בחירת הפרמטרים הניסיונית ויוצר קוד פרוטוקול מוכן לשימוש כדי להפעיל את תחנת העבודה. תחנת עבודה זו ממוטבת להזרמת חומרים צמיגיים כדי לאפשר טיפול אוטומטי ואמין ביותר על ידי שילוב של רציפי טמפרטורה עבור חומרים תרמו-רזפונזיים, פיפטות תזוזה חיוביות לחומרים צמיגיים, ומעגן מגע קצה אופציונלי להסרת חומר עודף מקצה הפיפטה. האימות והאימות של תערובות מבוצעים על ידי מדידת ספיגה מהירה וזולה של אורנג 'G. פרוטוקול זה מציג תוצאות כדי להשיג 80% (v/v) תערובות גליצרול, סדרת דילול עבור ג'לטין methacryloyl (GelMA), הידרוג'לים רשת כפולה של 5% (w / v) GelMA ו 2% (w / v) אלגינט. מדריך לפתרון בעיות כלול כדי לתמוך במשתמשים עם אימוץ פרוטוקול. זרימת העבודה המתוארת יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על מספר חומרים צמיגים כדי ליצור ריכוזים המוגדרים על ידי המשתמש באופן אוטומטי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רבייה ושכפול הם בעלי חשיבות עליונה בעבודה המדעית 1,2,3,4. עם זאת, עדויות אחרונות הדגישו אתגרים משמעותיים חוזרים על מחקרים ביו-רפואיים בעלי השפעה גבוהה במדעי היסוד, כמו גם במחקר תרגומי4,5,6,7. גורמים התורמים לתוצאות בלתי ניתנות להפרכה הם מורכבים וסעיפים, כגון תכנון מחקר גרוע או מוטה6,8, הספק סטטיסטי לא מספיק3,9, חוסר תאימות לתקני דיווח7,10,11, לחץ לפרסם6, או שיטות לא זמינות או קוד תוכנה6,9 . ביניהם, שינויים עדינים בפרוטוקול וטעויות אנוש בביצוע ניסויים זוהו כאלמנטים נוספים המהווים את חוסר ההתאמה4. לדוגמה, משימות צינור ידניות מציגות חוסר דיוק פנים-אישי ובין-אישי12,13 ומגדילות את ההסתברות לטעויות אנוש14. בעוד רובוטים לטיפול בנוזלים מסחריים מסוגלים להתגבר על חסרונות אלה והפגינו אמינות מוגברת עבור נוזלים15,16,17, טיפול אוטומטי בחומרים עם תכונות צמיגות משמעותיות עדיין מאתגר.

רובוטים מסחריים לטיפול בנוזלים משתמשים בדרך כלל בפיפטות כרית אוויר, הידועות גם בשם בוכנות אוויר או פיפטות תזוזת אוויר. הריאגנט והבוכנה מופרדים על ידי כרית אוויר המתכווצת במהלך חלוקת צעדים ומתרחבת במהלך צעדי השאיפה. באמצעות פיפטות כרית אוויר, חומרים צמיגים "לזרום" רק לאט לתוך ומחוץ לקצה, ונסיגה מוקדמת של פיפטה מהמאגר עלולה לגרום לשאיפה של בועות אוויר. במהלך חלוקת משימות, החומר הצמיג משאיר סרט על קיר הקצה הפנימי אשר "זורם" רק לאט או בכלל לא כאשר נאלץ על ידי אוויר. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיפטות עקירה חיוביות הוצגו מסחרית כדי להפריש באופן פעיל את החומר צמיג מתוך הקצה באמצעות בוכנה מוצקה. למרות שפיפטות עקירה חיוביות אלה מאפשרות טיפול מדויק ואמין בחומרים צמיגיים, פתרונות אוטומטיים עם פיפטות עקירה חיוביות עדיין יקרים מדי עבור הגדרות מעבדה אקדמיות, ולכן, רוב זרימות העבודה עם חומרים צמיגים מסתמכות אך ורק על משימות צינור ידניות18.

באופן כללי, צמיגות מוגדרת כהתנגדות של נוזל לזרום, וחומרים צמיגים מוגדרים עוד יותר כחומרים עם צמיגות גדולה יותר של מים (0.89 mPa·s ב 25 °C (65 °F). בתחום היישומים הביו-רפואיים, תצורות ניסיוניות מכילות לעתים קרובות חומרים מרובים עם צמיגות גדולה יותר מאשר מים, כגון דימתיל סולפוקסיד (DMSO; 1.99 mPa·s ב-25 °C ), גליצרול (208.1 mPa·s ב-25 °C ב-25 °C עבור 90% גליצרול [v/v]), טריטון X-100 (240 mPa·s ב-25 °C), ופולימרים נפוחים במים, המכונים הידרוג'לים19, 20. הידרוג'לים הם רשתות פולימר הידרופיליות המסודרות במצב פיזי או/כימי המשמש ליישומים שונים, כולל אנקפסולציה של תאים, אספקת תרופות ומפעילים רכים19,20,21,22. הצמיגות של הידרוג'לים תלויה בריכוז הפולימר ובמשקל המולקולרי19. הידרוג'לים המשמשים באופן שגרתי עבור יישומים ביו-רפואיים מציגים ערכי צמיגות בין 1 ל-1000 mPa·s, בעוד שמערכות הידרוג'ל ספציפיות דווחו עם ערכים של עד 6 x 107 mPa·s19,23,24. עם זאת, מדידות צמיגות של הידרוג'לים אינן מתוקננות במונחים של פרוטוקול מדידה והכנה מדגם, ולכן, ערכי צמיגות בין מחקרים שונים קשה להשוות.

מאחר שפתרונות אוטומטיים זמינים מסחרית שתוכננו במיוחד עבור הידרוג'לים חסרים או יקרים מדי, זרימות העבודה הנוכחיות עבור הידרוג'ל תלויות בטיפול ידני18. כדי להבין את המגבלות של זרימת העבודה הידנית הנוכחית עבור צנרת של הידרוג'לים, חשוב להבין משימות טיפול חיוניות18. לדוגמה, לאחר חומר הידרוג'ל רומן כבר מסונתט, ריכוז הרצוי או סדרת דילול עם ריכוזים שונים נוצר כדי לזהות פרוטוקולי סינתזה אמינים ומאפייני crosslinking עם ניתוח עוקב של המאפיינים המכניים25,26,27,28 . באופן כללי, פתרון מלאי מוכן או נרכש, ולאחר מכן מעורבב עם דילול ו /או ריאגנטים אחרים כדי לקבל תערובת. משימות הערבוב לרוב אינן מבוצעות ישירות בצלחת באר (או בכל תבנית פלט), והן מבוצעות דווקא בצינור תגובה נפרד, המכונה בדרך כלל תערובת ראשית. במהלך משימות הכנה אלה, נדרשים צעדי שאיפה וחלוקה שונים כדי להעביר את החומרים הצמיגים, לערבב את הריאגנטים ולהעביר את התערובת לפורמט פלט (למשל, צלחת באר 96). משימות אלה דורשות כמות גבוהה של עבודה אנושית18, שעות ניסוי ארוכות, ולהגדיל את ההסתברות לטעויות אנוש שעלולות להתבטא כתוצאות לא מדויקות. יתר על כן, טיפול ידני מונע הכנה יעילה של מספרי מדגם גבוהים כדי לסנן שילובי פרמטרים שונים לאפיון מפורט. העיבוד הידני גם מעכב את השימוש הידרוג'לים עבור יישומי סינון תפוקה גבוהה, כגון זיהוי של תרכובות מבטיחות במהלך פיתוח תרופות. שלבי ההכנה הידניים הנוכחיים אינם אפשריים לסינון ספריות סמים המורכבות מאלפי תרופות. מסיבות אלה, נדרשים פתרונות אוטומטיים כדי לספק תהליך פיתוח יעיל ולאפשר תרגום מוצלח של הידרוג'לים ליישומי סינון תרופות.

כדי לעבור מזרימות עבודה ידניות לתהליכים אוטומטיים, מיטבנו רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי לטיפול בחומרים צמיגיים על ידי שילוב רציפי טמפרטורה לחומרים תרמו-רספונזיים, שימוש בפיפטות עקירה חיוביות מחוץ למדף באמצעות טיפים של בוכנה נימית, ומעגן מגע קצה אופציונלי לניקוי קצה פיפטה. רובוט צנרת זה שולב עוד יותר כמודול צנרת לתחנת עבודה בקוד פתוח שפותחה לאחרונה, המורכבת ממודולים מוכנים להתקנה הניתנים להתאמה אישית18,29. הוראות הרכבה מפורטות עבור תחנת העבודה שפותחה כולל קבצי חומרה ותוכנה נגישות באופן חופשי מ- GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) ומאגר Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). בנוסף לפיתוח החומרה, יישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח תוכנת ושוחרר כדי להנחות את המשתמש בתהליך בחירת הפרמטר וליצור קוד פרוטוקול מוכן לשימוש (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). קוד זה פועל על רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי, כמו גם על תחנת העבודה קוד פתוח שפותחה.

להלן, הדרכה מקיפה מסופקת על פעולת תחנת העבודה בקוד פתוח כדי להפוך משימות ערבוב לאוטומטיות עבור חומרים צמיגיים (איור 1). ניתן לבצע את שלבי הפרוטוקול הספציפיים להדרכה עם תחנת העבודה שפותחה בקוד פתוח, כמו גם עם רובוט צנרת הקוד הפתוח המסחרי. נתמך על ידי יישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח שפותח בתוך הבית, ערבוב אוטומטי והכנה של ריכוזים נדרשים עבור גליצרול, מתקרילויל ג'לטין (GelMA) ו alginate הוא הודגם. גליצרול נבחר במדריך זה, שכן הוא מאופיין היטב 30,31, הוא זול וזמין, ולכן, הוא משמש בדרך כלל כחומר התייחסות צמיג עבור משימות צינור אוטומטיות. כדוגמאות להידרוג'לים המשמשים ביישומים ביו-רפואיים, פתרונות מבשרים של GelMA ו- alginate hydrogel יושמו לניסויי ערבוב אוטומטיים. GelMA מציגה את אחד ההידרו-ג'לים הנפוצים ביותר למחקרי אנקפסולציה של תאים32,33, ואלגינט נבחר במחקר זה כדי להדגים את היכולת לייצר הידרוג'לים ברשת כפולה34,35. באמצעות אורנג 'G כצבע, הליך מהיר וזול יושם כדי לאמת ולאמת את תוצאות הערבוב עם spectrophotometer16.

רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי שולב כמודול צנרת בתחנת העבודה שפותחה בקוד פתוח (איור 2a), ולכן השם 'מודול צנרת' משמש עוד יותר לתיאור רובוט הצינורות. תיאור מפורט של החומרה המותקנת חורג מהיקף הפרוטוקול וזמין באמצעות המאגרים שסופקו הכוללים גם הוראות שלב אחר שלב לאסיפה הכללית של פלטפורמת הקוד הפתוח. מודול הצינורות יכול להיות מצויד בשתי פיפטות (פיפטה חד-ערוצית או 8 ערוצים) המותקנות על ציר A (מימין) וציר B (משמאל) (איור 2b). מודול הצינורות מציע קיבולת של 10 סיפון על פי תקני מכון התקנים הלאומי האמריקאי /האגודה לאוטומציית מעבדה וסינון (ANSI/SLAS), ועמדות המיקום הבאות מוגדרות על הסיפון: A1, A2, B1, B2, B2, C1, C2, D1, D1, D2, E1, E2 (איור 2c). כדי ליזום פילמור המושרה בצילום של פתרונות הידרוג'ל, נדרש מודול crosslinker נפרד ונוסף לתחנת העבודה. מודול crosslinker מצויד נורות LED עם אורך גל של 400 ננומטר, ולכן, חומרים המרגשים באורך גל אור גלוי ניתן להשתמש עם המערכות הנוכחיות, כגון ליתיום פניל-2,4,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. ניתן לטפל בעוצמת (ב- mW/cm2) של נוריות ה- LED על-ידי המשתמש ביישום עיצוב הפרוטוקול כדי ללמוד את אופן הפעולה של קישור צולב38. תחנת העבודה כוללת גם מודול אחסון המאפשר מחקרי תפוקה מוגברת; עם זאת, מודול זה אינו משמש בתוך מחקר זה, ולכן, לא מתואר עוד יותר. באופן כללי, מומלץ להפעיל את מודול הצינורות בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע זיהום מדגם. מעגל החשמל הראשי להפעלת מודול הצינורות הוא מעגל V 12, הנחשב ליישום מתח נמוך ברוב המדינות. כל הרכיבים החשמליים ממוקמים בתיבת בקרה ייעודית המונעת ממשתמשים לבוא במגע עם מקור הסכנה החשמלית.

על ידי ביצוע פרוטוקולי ערבוב מתוקננים אלה, חוקרים מסוגלים להשיג תערובות אמינות עבור חומרים צמיגים, כמו גם לא צמיגים בצורה אוטומטית. גישת הקוד הפתוח מאפשרת למשתמשים למטב רצפי ערבוב ולשתף פרוטוקולים שפותחו לאחרונה עם הקהילה. בסופו של דבר, גישה זו תאפשר סינון של שילובי פרמטרים מרובים כדי לחקור את התלות ההדדית בין גורמים שונים, ובכך, להאיץ את היישום והפיתוח האמין של חומרים צמיגים עבור יישומים ביו-רפואיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול מתחיל בהקדמה ל- (1) התוכנה ו- (2) הגדרת החומרה כדי להכיר למשתמש את ההתקנות הנדרשות ואת תחנת העבודה. לאחר סעיף על (3) הכנת חומר ו -(4) השימוש ביישום מעצב הפרוטוקול, (5) הכיול של מודול הצינורות ו -(6) הביצוע של הפרוטוקול האוטומטי מודגש בפירוט. לבסוף, (7) מתוארים הליכי אימות ואימות, כולל קריאת ספיגה וניתוח נתונים. זרימת עבודה כללית של פרוטוקול עם משימות בודדות מוצגת באיור 1.

1. הגדרת תוכנה

הערה: סעיף זה כולל הוראה מפורטת להתקנת ממשק תיכנות היישומים (API) וכן את יישום מעצב הפרוטוקולים הנדרש ואת מסוף הכיול. ההוראות הבאות נכתבות עבור מחשב לוח יחיד פאי פטל (RPi); עם זאת, גם Windows 8, 10 ו- macOS 10.13+ שימשו בהצלחה עם ה- API והיישומים.

  1. הגדר את סביבת המחשב.
    הערה: להכיר את היסודות של Python39, כיצד להגדיר ולהשתמש Pi40,41 פטל, וכיצד להתחבר לאינטרנט42. שלבי ההדרכה הבאים מתמקדים בשלבים ספציפיים לפרוטוקול ומידע נוסף על השימוש של פאי פטל זמין באינטרנט40.
    1. פתח חלון מסוף משורת המשימות או מתפריט היישום.
    2. עדכן את רשימת החבילות של המערכת:
      sudo apt-get update
    3. שדרג את כל החבילות המותקנות:
      sudo apt-get dist-upgrade
    4. הפעל מחדש את פאי פטל:
      אתחול מחדש של סודו
    5. בדוק את גירסת Python המותקנת:
      פיתון3 --גרסה
      ודא כי לפחות Python 3.5 מותקן; אם לא, התקן את הגירסה העדכנית ביותר43.
    6. התקן פיתון פיפ, אשר מפרסם חבילות פייתון עם אינדקס חבילת פייתון44:
      sudo apt-get install python3-pip
    7. התקן יחסי תלות:
      numpy התקנת פיפס
      pip install python-resize-image
      הערה: אם אתה משתמש ב- Windows, עליך להתקין את חבילת קללות החלונות באמצעות: פיתון -m pip להתקין חלונות-קללות
  2. התקן את ממשק תיכנות היישומים (API).
    הערה: ה- API מספק מסגרת פייתון פשוטה המיועדת לכתוב סקריפט פרוטוקולים ניסיוניים ולהפעיל את תחנת העבודה. שני ממשקי ה- API הבאים נדרשים כדי לבצע בהצלחה את קוד הפרוטוקול שנוצר.
    1. התקן API של תחנת עבודה:
      תחנת עבודה פתוחה להתקנת pip
    2. התקן את Opentrons API כדי להפעיל את מודול הצינורות:
      pip install opentrons==2.5.2
    3. ודא, אם ה- API מותקן בהצלחה:
      פיתון3
      >>> ייבוא תחנת עבודה פתוחה
      >>> פתיחה לייבוא
      הערה: גודל ה-API ויישום עיצוב הפרוטוקול הוא 2.2 MB ו- 1.2 MB, בהתאמה. לא היו בעיות במהלך ההתקנה בעת שימוש בשטח דיסק מוגבל (200 MB). עם זאת, דרישות שטח הדיסק תלויות במערכת ההפעלה.
  3. בחר ספריה להורדת קבצים (מסוף כיול, יישום עיצוב פרוטוקול וכו ').
    הערה: ניתן להעתיק ולהדביק קבצים במקום אחר לאחר מכן.
  4. שכפל קבצים ממאגר GitHub:
    שיבוט git https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
    הערה: הפקודה 'git clone' משכפלת ולאחר מכן שומרת את כל הקבצים בספריה, הפתוחה כעת במסוף. מכיוון שהמאגר כולל גם את קבצי החומרה עבור ההרכבה, לא כל המאגר נדרש כדי לבצע את הפרוטוקולים המוצגים. כל הקבצים הנדרשים כדי לשכפל את הניסויים זמינים כקובץ משלים ובמאגר GitHub תחת "/דוגמאות/פרסום-JoVE".
  5. פתח את התיקיה שהורדת. אם כל המאגר הורד, נווט לתיקיה 'פרסום-JoVE' באמצעות
    תחנת עבודה פתוחה של תקליטור/דוגמאות/פרסום-JoVE
    הערה: תיקיה זו כוללת קבצים הדרושים להפעלת תחנת העבודה והשימוש ביישום מעצב הפרוטוקול ובמסוף הכיול.

2. הגדרת חומרה

  1. הנח את תחנת העבודה בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע זיהום מדגם.
  2. התקן פיפטות בתחנת העבודה.
    1. בחר את גודל הפיפטה בהתבסס על ההתקנה הניסיונית. באופן כללי, לקחת גודל פיפטה איזה נפח להיות שאפתן הוא בקצה הגבוה יותר של הטווח. אם ערבוב משימות עם אמצעי אחסון הגדולים מ- 1 מ"ל נדרשות להתקנה ספציפית (לדוגמה, שאיפה/חלוקה של 2 מ"ל), בחר ב- M1000E עם נפח שאיפה/חלוקה מרבי של 1,000 μL כדי למזער את שלבי ההזנה ולחסוך זמן.
      הערה: הוראה מפורטת עבור פיפטות תזוזת אוויר זמינה באינטרנט45. מודול הצינורות שפותח מסוגל לשלב את פיפטות ההעתקה החיוביות הבאות מחוץ למדף: M10E (1-10 μL), M25E (3-25 μL), M50E (20-50 μL), M100E (10-100 μL), M250E (50-250 μL), M1000E (100-1,000 μL).
    2. השתמש במפתח M4 Allen כדי לשחרר ולהדק ברגים.
    3. חבר את שני לוחות קיבוע פיפטה (לוחות אקריליים לבנים) למעקה האלומיניום ומהדק את ברגי M5 באופן רופף.
    4. הכנס את הפיפטה לשני לוחות קיבוע פיפטה וודא שהזנב הארגונומי של הפיפטה נח בצד הנגדי של צלחת ההרכבה האקרילית.
    5. הדקו בחוזקה את ארבעת הברגים של שתי לוחות קיבוע הפיפטה.
    6. מחליקים את שני אגוזי ההידוק הריבועיים, המחוברים לצלחת ההרכבה האקרילית, לחריץ ההבלטה של ציר z ומהדקים ברגים.
      הערה: הדקו את הפיפטה בחוזקה כדי להימנע מתנועה כלשהי במהלך הפעולה.

3. הכנה חומרית

הערה: החומרים צמיג (גליצרול, GelMA, alginate) משמשים לניסויים המוצגים במחקר זה, ולכן, כרכים מוכנים ומשימות טיפול (למשל, להוסיף 5 מ"ל של פתרון מלאי בצינורות תגובה 5 מ"ל) הם במיוחד עבור התקנה ניסיונית זו.

  1. ג'לטין מתקרילויל (גלמה)
    הערה: פונקציונליזציה של GelMA, דיאליזה וליופיליזציה אינם היקף נייר זה, ופרוטוקול שלב אחר שלב זמין ב- Loessner et al.33. הפרוטוקול מתחיל באמצעות GelMA lyophilized, אשר ניתן להכין בתוך הבית או לרכוש מסחרית.
    1. חשב את המסה הנדרשת של GelMA (mGelMA) בהתבסס על ריכוז המלאי הסופי הרצוי (cGelMA) ונפח (VGelMA) באמצעות המשוואה:
      mGelMA = cGelMA x VGelMA
      הערה: VGelMA תלוי במערך הניסיוני ומומלץ להכין 20−30% עודף חומר. הפרוטוקולים המוצגים מתחילים עם 5 מ"ל של 20% (w / v) GelMA כפתרון מניה.
    2. שקול את הכמות הנדרשת של GelMA lyophilized, להוסיף אותו לתוך צינור תגובה 50 מ"ל ולהוסיף את הכמות הנדרשת של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS).
    3. מערבבים GelMA או על ידי השריה לתוך הממס ב 4 °C (6 °F) לילה או על ידי חימום ל 60 °C (6 °F) עבור 6 שעות באמבט מים.
      הערה: ניתן לאחסן פתרונות GelMA סטריליים מוגנים מפני אור בטמפרטורה של 4 °C (6 °F) למשך שישה חודשים לפחות.
    4. מלאו 5 מ"ל של GelMA בצינורות תגובה של 5 מ"ל.
  2. פוטוניאטטור: ליתיום פניל-2,4,6-טרימתילבנזואילפוספינאט (LAP)
    הערה: הימנעו מחשיפה נוספת לאור החדר, מכיוון ש-LAP רגישה לאור.
    1. חשב את המסה הנדרשת של LAP (mLAP) בהתבסס על ריכוז המלאי הסופי הרצוי (cLAP) ונפח האחסון הנדרש (VLAP) באמצעות המשוואה:
      mLAP = cLAP x VLAP
      הערה: מומלץ להכין פתרון מניה של 3% (w/v).
    2. לשקול את הכמות הנדרשת של LAP, להוסיף אותו לתוך צינור תגובה 15 מ"ל ולהוסיף PBS.
    3. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי למנוע פירוק המושרה בתמונה.
    4. להמיס LAP על ידי הצבת צינור התגובה באמבט מים ב 37 °C (50 °F) עבור 2 שעות או עד מומס לחלוטין.
    5. מלא 1 מ"ל של פתרון מלאי LAP בצינורות 5 מ"ל.
  3. אלג'ינט
    1. חשב את הכמות הנדרשת של אלגינט (malginate) בהתבסס על ריכוז המלאי הסופי הרצוי (calginate) ונפח (Valginate) באמצעות המשוואה:
      malginate = calginate x Valginate
      הערה: Valginate תלוי ההתקנה הניסיונית מומלץ להכין 20−30% עודף חומר. הפרוטוקולים המוצגים מתחילים עם 5 מ"ל של 4% (w / v) alginate כפתרון מניה.
    2. לשקול את המסה הנדרשת של אלגינט, להוסיף אותו לתוך צינורות תגובה 50 מ"ל, ולהוסיף PBS.
    3. מניחים את תערובת אלגינט לתוך אמבט מים ב 37 °C (50 °F) במשך 4 שעות.
      הערה: השימוש במערבל מערבולת יאיץ את תהליך הפירוק, אך גם ייצור בועות אוויר. אלגינט מומס יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (6 °F) במשך שישה חודשים לפחות.
    4. מלאו 5 מ"ל של אלגינט לצינורות תגובה של 5 מ"ל.
  4. מלא 5 מ"ל של גליצרול בצינורות תגובה 5 מ"ל.
  5. פתרון אורנג' G
    1. הכן פתרון מלאי 10 מ"ג / מ"ל של אורנג 'G בצינור תגובה 50 מ"ל.
      הערה: אמצעי האחסון תלוי במספר הניסויים. בהתאם לסוג הדילול, הכן פתרון מלאי במים אולטרה-פור, PBS או ריאגנט מדולל מתאים. בניסויים שהוצגו, מים אולטרה-פור שימשו לדילול גליצרול ו- PBS לדילול GelMA ואלגינט. PBS שימש כדילול עבור GelMA ו alginate, והוא יכול להיות מוכן באמצעות טבליות או שנרכשו מהמדף.
    2. מערבבים במשך 10 שניות על ידי מערבולת.
    3. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי למנוע פירוק המושרה בתמונה.
      הערה: פתרון מלאי ניתן להשתמש לאחר 24 שעות כדי להבטיח פירוק נאות של אורנג 'G.
    4. לדלל את פתרון המלאי לפתרון עבודה של 1 מ"ג/מ"ל בצינור תגובה של 50 מ"ל.
    5. העבר פתרון עבודה לבקבוקים / צינורות מתאימים להתקנה הניסיונית.
      הערה: עבור הניסויים שהוצגו, פתרון העבודה היה מלא לתוך צינורות 5 מ"ל. מלאי אורנג 'G ופתרון עבודה ניתן לאחסן ב 4 °C (65 °F) ולהשתמש בתוך שלושה חודשים עם ההכנה.
    6. מלאו 5 מ"ל של פתרון העבודה של 1 מ"ג/מ"ל אורנג' ג'י בצינורות תגובה של 5 מ"ל.

4. צור קוד פרוטוקול עם יישום מעצב הפרוטוקול

הערה: הפרמטרים שצוינו בשלבים 4.2−4.7 זהים עבור כל הניסויים שנערכו, למעט ריכוז המלאי של החומר וריכוז הפלט הסופי. פרמטרים אלה מסוכמים בטבלה 1 , ובאופן הבא, הפרמטרים משמשים להכנת הידרוג'לים של רשת כפולה עם 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginate, 0.15% (w/v) LAP ו- PBS כדילול.

  1. פתח את יישום מעצב הפרוטוקולים על-ידי הפעלת 'ProtocolDesignApp.html'.
    הערה: האפליקציה "ProtocolDesignApp.html" מנחה את המשתמש בתהליך בחירת הפרמטרים ויוצרת באופן אוטומטי את הפרוטוקול המוכן לשימוש להפעלת תחנת העבודה. ממשק המשתמש פועל בכל דפדפן אינטרנט נפוץ (כלומר Chrome, Firefox, Safari, Edge, Internet Explorer).
  2. הזן שם פרוטוקול (לדוגמה, הידרוג'לים כפולים ברשת) בדף ההתקנה.
  3. לחץ על 'המשך' כדי לאשר את שם הפרוטוקול ולהמשיך לשלב הבא.
  4. הגדר מגש קלט על-ידי בחירה באפשרות 'בלוק חימום 3x4' מהתפריט הנפתח ופרמטרי הקלט הבאים:
    1. בחר 'ג'ל 1' מהתפריט הנפתח, הזן שם 'GelMA', הזן את ריכוז המלאי '20%', הגדר את 'מספר דוגמאות' ל- '3' כדי למלא עמודה אחת. לחץ על '+הוסף' כדי לשמור ערכים.
    2. בחר 'ג'ל 2' מהתפריט הנפתח, הזן שם: 'Alginate', הזן ריכוז מניות '4%', הגדר את 'מספר דוגמאות' ל' ל- '3' כדי למלא עמודה אחת. לחץ על '+הוסף' כדי לשמור ערכים.
    3. בחר 'Photoinitiator' מהתפריט הנפתח, הזן שם: 'LAP', הזן את ריכוז המניות '3%', הגדר את 'מספר דוגמאות' ל' ל- '3' כדי למלא עמודה אחת. לחץ על '+הוסף' כדי לשמור ערכים.
    4. בחר 'מדולל 1' מהתפריט הנפתח, הזן שם: 'PBS', הגדר את 'מספר דוגמאות' ל- '3' כדי למלא עמודה אחת. לחץ על '+הוסף' כדי לשמור ערכים.
      הערה: הפריט החזותי של מגש הקלט מתעדכן באופן אוטומטי, לאחר לחיצה על '+הוספה'. אם מוסיפים יותר קלט מקיבולת המגש, האזהרה 'דוגמאות רבות מדי עבור מגש זה' תוצג למשתמש.
  5. הגדר פרמטרים של קישור צולב על-ידי בדיקת 'קישור צולב של תמונות' והקלדת השעה בשניות, '30' והעוצמה W/m2 עם '2'.
  6. סיים את הגדרת הקלט על-ידי לחיצה על 'המשך'.
  7. הגדר הגדרת מגש פלט על-ידי בחירת 'צלחת באר 96' בתפריט הנפתח עבור סוג צלחת היטב.
  8. לחץ על 'Group1' כדי להגדיר פלטים על-ידי יצירת קבוצת דוגמאות.
    1. ציין הרכב פלט על-ידי הזנת הריכוזים הרצויים ונפח הדגימה לשדות עבור כל קלט: GelMA = '5', Alginate = '2', LAP = '0.15', נפח כולל = '60'.
    2. כדי להחיל פרוטוקול ערבוב מתקדם.
  9. ציין את מספר הדגימות על-ידי הזנת מספר הדגימות בשדה 'מספר דוגמאות': '96'.
    הערה: הפריט החזותי של המגש לדוגמה מתעדכן באופן אוטומטי, לאחר לחיצה על '+הוסף קבוצה'. אם מתווספות יותר דוגמאות מקיבולת המגש, האזהרה 'דוגמאות רבות מדי עבור מגש זה' תוצג למשתמש.
  10. סיים את הגדרת הפלט על-ידי לחיצה על 'המשך'.
    1. בחר מיקום מגש בפריסת הסיפון והכן את הפלטפורמה בהתאם:
    2. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'חריץ A1' ובחר 'Empty_Cell' מהתפריט הנפתח.
    3. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'SLOT A2' ובחר 'Trash_Cell' מהתפריט הנפתח.
    4. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'חריץ B1' ובחר 'Tips_Cell_100 μL' מהתפריט הנפתח.
    5. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'SLOT B2' ובחר 'Tips_Cell_1000 μL' מהתפריט הנפתח.
    6. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'חריץ C1' ובחר 'Input_Cell' מהתפריט הנפתח.
    7. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'חריץ C2' ובחר 'Empty_Cell' מהתפריט הנפתח.
    8. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'SLOT D1' ובחר 'Mixing_Cell' מהתפריט הנפתח.
    9. בדוק את סימן הביקורת בשדה 'SLOT D2' ובחר 'Output_Cell' מהתפריט הנפתח.
    10. הגדר סוג ומאפיינים של פיפטה ראשונה (M100E) על-ידי בדיקת 'Pipette Left', בחירה באפשרות 'תזוזה חיובית של 10-100μL' מתפריט נפתח והגדרת מהירות שאיפה = '600', מהירות חלוקה = '800'.
    11. הגדר סוג ומאפיינים של פיפטה שנייה (M1000E) על ידי בדיקת 'Pipette Right', בחירה באפשרות 'תזוזה חיובית של 100-1000μL' מתפריט נפתח והגדרת מהירות שאיפה = '800', חלוקת מהירות = '1200'.
  11. לחץ על 'צור פרוטוקול' כדי לאשר את ההתקנה וליצור את סקריפט הפרוטוקול.
    הערה: אפליקציית מעצב הפרוטוקולים המפותחת יוצרת באופן אוטומטי תיקיה חדשה בכל פעם שנוצר פרוטוקול חדש. כל הקבצים הדרושים לניסוי זה ולהפעלת תחנת העבודה נשמרים בתיקיה זו הקרויה על שם הפרוטוקול. ניתן להעתיק את התיקיה לספריות שונות מבלי לגרום לבעיות.
  12. אל תסגור את הממשק, מכיוון שהוא ישמש לביצוע הפרוטוקול (ראה שלב 6.6).

5. כיול מודול הצנרת

הערה: בתחילה יש לכייל מיכלים (לדוגמה, צלחות באר, מתלה טיפים, אשפה) ופיפטות (לדוגמה, M1000E). אם גורם מכיל ו/או מיקום פיפטה משתנים/משתנים, יש לכייל את המיקום החדש.

  1. נווט אל תיקיית הפרוטוקול ופתח את מסוף הכיול על-ידי ביצוע הקובץ 'calibrate.py' ב- windox מסוף (ראה שלב 1.1.1):
    phython.calibrate.py
    הערה: הממשק 'calibrate.py' מנחה את המשתמש דרך הכיול של הגדרת הסיפון ופיפטות. ודא שהקובץ נמצא באותה תיקיה שבה נמצא קובץ הפרוטוקול וקבצי המודול. הוא נוצר באופן אוטומטי בשלב 4.10.
  2. בחר מרווחי תנועה עבור תנועת plungerx,y,z עם המקלדת הנומרית (1−8): '1' עבור 0.1 מ"מ, '2' עבור 0.5 מ"מ, '3' עבור 1 מ"מ, '4' עבור 5 מ"מ, '5' עבור 10, '6' עבור 20 מ"מ, '7' עבור 40 מ"מ, ו '8' עבור 80 מ"מ.
  3. כייל את הפיפטה.
    1. הקש על קיצור מקשים P כדי לבחור גודל פיפטה.
    2. הקש על קיצור מקשים V כדי להיכנס למצב כיול הבוכנה.
      הערה: מומלץ להתחיל במרווחים קטנים (2, 5 ו-10 מ"מ) כדי להכיר את גודל ההפרש הקבוע ואת פעולת התנועה של ראש הפיפטה.
    3. כייל את תנוחות הבוכנה הבאות עבור פיפטה עקירה חיובית: T-Top = תנוחת מנוחה; B-Bottom = הבוכנה נדחפת עד שההתנגדות מתקיימת; P-Pick-up = הבוכנה נדחפת למצב שבו ניתן לחבר קצה בוכנה; E–הוצאה = בוכנה נדחפת עד שנפלט קצה מצורף. שנה את מיקומי הבוכנה באמצעות החצים כלפי מעלה ולמטה במקלדת, ושמור את המיקום הסופי באמצעות S במקלדת.
    4. השאר את מצב כיול הבוכנה של פיפטה על-ידי הקשה על קיצור מקשים V.
  4. כייל את מיקום מיכל יחסית לקצה הפיפטה.
    1. הקש על קיצור מקשים P כדי לבחור סוג פיפטה. ודא שעצה מחוברת ל- pipetted שנבחר.
    2. הקש על קיצור מקשים C כדי לבחור סוג גורם מכיל.
    3. בחר תוספת תנועה מתאימה והעבר טיפ פיפטה למיקומים הבאים. לקבלת צלחות טובות, כייל את המיקום 'A1' היטב בתחתית; עבור מתלה קצה, כייל למצב 'A1'; לאשפה, בחרו מיקום (המוגדר כנקודה) שבו ניתן להוציא את הקצה לפח האשפה.
    4. הקש על קיצור מקשים S כדי לשמור מיקום.
    5. חזור על שלבים 5.3.1−5.3.3 עבור כל המכולות המפורטות תחת 'C' עבור סוג הפיפטה שנבחר.
    6. חזור על הפעולה 5.3.1−5.3.5 עבור סוג הפיפטה השני.
    7. סגור את קובץ ה- Script של הכיול.

6. ביצוע פרוטוקול עם תחנת העבודה

הערה: קבצי פרוטוקול נגישים דרך המאגר וזמינים גם כקובץ משלים.

  1. מקם מיכל אשפה, מתלים קצה, מגש קלט, מגש ערבוב ופלט על הסיפון (מוגדר בשלב 4.3).
  2. כייל פיפטות ומכשירים כהגדרתם בסעיף 5.
  3. במידת הצורך, הפעילו את עגן הטמפרטורה ובחרו את הטמפרטורה למגש הקלט והערבוב.
    הערה: הניסויים במדריך זה נערכו ללא בקרת טמפרטורה וב 40 °C (40 °F) עבור גליצרול, ו 37 °C (37 °F) עבור GelMA וצינורות אלגינט.
  4. מקם צינורות עם ריאגנטים קלט בבלוקי האלומיניום על רציפי הטמפרטורה על פי ההתקנה שנבחרה.
  5. המתן עד שריאגנטים קלט יגיעו לטמפרטורה הרצויה.
    הערה: כדי להבטיח חלוקת טמפרטורה נאותה, מומלץ זמן דגירה של 30 דקות עבור GelMA ו alginate.
  6. בצע את קובץ הפרוטוקול על-ידי לחיצה על 'הפעל סקריפט PYTHON'
    הערה: הפרוטוקול שנבחר מבוצע כעת על-ידי תחנת העבודה. הווידאו המצורף מדגיש ערבוב אוטומטי של GelMA ואת ההפצה של 60 μL לתוך צלחת 96 היטב.
  7. ההפעלה הושלמה, כאשר מוצג 'סיום'.

7. תהליך אימות ואימות

  1. הסר את צלחת הבאר מתחנת העבודה ולהעביר את צלחת הבאר עם הדגימות לספקטרופוטומטר.
  2. יש לקרוא את הספיגה עם ספקטרופוטומטר ב-450 ננומטר. קרא כל צלחת 2x כדי להשוות תוצאות ולהבטיח תוצאות עקביות.
  3. יצא ושמור קריאות ספיגה.
  4. ניתוח נתונים.
    הערה: ניתן לעבד נתונים ניסיוניים בנפרד או להעתיק אותם ולהדביק אותם בתבנית שסופקה כדי להעריך את הממוצע, סטיית התקן ומקדם השונות (CV) באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני.
    1. פתח את הקובץ המשלים 'ניתוח supplementary_template.xlsx", אשר ניתן לערעור גם בתוך מאגר GitHub תחת 'תחנת עבודה פתוחה/דוגמאות/פרסום-JoVE.
    2. העתק קריאות ספיגה לגיליון 'נתונים גולמיים', ודא שכל ההפניות לתאים מוגדרות כראוי בכל הטבלאות ולחץ על גיליון 'ניתוח' לקבלת מידע על ערכי הממוצע, סטיית התקן ומקדם השונות (קורות חיים).
      הערה: בהתאם לחלוקת הדגימה בלוח באר, סוגי ההערכה המוגדרים מראש הבאים זמינים עם התבנית: הסוג 'אחיד' משמש כאשר לכל הדגימות יש קומפוזיציה זהה, הסוג 'לפי שורות' משמש כאשר דוגמאות בשורות שונות כוללות קומפוזיציות שונות, הסוג 'לפי עמודות' משמש כאשר דוגמאות בעמודות שונות כוללות קומפוזיציות שונות, והסוג 'מותאם אישית' משמש כאשר המיקומים לדוגמה הם ספציפיים למשתמש.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדריך זה מציג תוצאות לניסויים בגליצרול (איור 3) ובגלמה עם LAP ואלגינט (איור 4).

יצירת פתרון גליצרול של 80% (v/v) נחקרה ללא בקרת טמפרטורה (טמפרטורת החדר, 22 °C) וללא מגע קצה (מוגדר כהגדרה 1), עם בקרת טמפרטורה (40 °C)וללא מגע קצה (הגדרה 2), או עם בקרת טמפרטורה (40 °C)) ועם מגע קצה (הגדרה 3) (איור 3a-i). שתי הגדרות טמפרטורה אלה נבחרו כדי להעריך את הפרש הטיפול, שכן צמיגותו של גליצרול יורדת כמעט על ידי גורם של 3 כאשר מחומם מ 22 °C (139.5 mPa·s) ל 40 °C (46.6 mPa·s)30. פתרון מלאי של 85% (v/v) של גליצרול היה מדולל לריכוז סופי של 80% וחולק באופן אחיד לצלחת 96 היטב (n = 96 לכל התקנה). זמן הניסוי, הכולל את חלוקת כל חומר לתוך צינור התערובת, משימות הערבוב המתאימות, וחלוקת מדגם לצלחת 96 היטב, היה 30 דקות 42 שניות. כדי לזהות הבדלים בין תערובות דילול, מים אולטרה-פור - כמו דילול עבור גליצרול - הוכן עם 1 מ"ג / מ"ל כתום G. קריאות הספיגה מדגישות כי השילוב של בקרת הטמפרטורה ומגע הקצה משפיע באופן משמעותי על התערובות (p < 0.0001). בנוסף לניתוח הדו-כיווני המבוצע של שונות (ANOVA), ערכי קורות החיים חושבו כדי להעריך את סטיית התקן היחסית. מקדם הווריאציה מתאר מחוון מתוקנן לזיהוי מידת הסטייה ביחס לממוצע ומתבטא באחוזים. אם אמצעי המדגם אינם נקודת עניין במיוחד, אך השונות בתוך המדידות, מקדם השונות מספק תובנות נוספות לזיהוי תערובות הניתנות לשחזור46. במסגרת ניסוי זה עם שלוש הגדרות שונות, ערכי הספיגה הראו ירידה בערכי קורות החיים מ-5.6%, 4.2%, ל-2.0% עבור התקנה 1, התקנה 2 והגדרה 3, בהתאמה, הממחישים את ההשפעה המשמעותית של רציף הטמפרטורה ופונקציית המגע בקצה על הפקת תוצאות אמינות (איור 3a-ii). התוויית ערכי ספיגת מדגם עבור התקנה 3 (מספר מדגם מס' 1 עד #96 בלוח באר 96) אינה מניבה ערכים עולים או יורדים לאורך הניסוי, ולכן אינה מצביעה על השפעה של מיקום המדגם על ערכי הספיגה (איור 3a-iii). הדמיית הנתונים עבור כל לוח נמדד היטב עם מפות חום מספקת תובנות נוספות לזיהוי הטרוגניות עבור שורה או עמודה ספציפיות, או ערכי ספיגה משתנים לאורך משימות החלוקה. מפות החום החזותיות של שלוש ההגדרות מציגות הטרוגניות מופחתות בכל לוחות הבאר מהגדרה 1 ועד להתקנה 3 (איור 3b). לבסוף, השכפול של הערבוב המנוהל הוערך בתוך שמונה ריצות עצמאיות (איור 3c-i,ii), שם כל ריצה ארכה 6 דקות 57 שניות. ריצות ערבוב בודדות הראו ערכי CV נמוכים בין 1.1% ל -2.6%, המצביעים על פעילויות ערבוב וחלוקה אמינות מאוד עבור ריצות בודדות. ערכי הספיגה של כל שמונה הריצות הניבו ערך CV של 3.3% והדגימו את יכולת השכפול של פרוטוקול הערבוב שנקבע.

סדרת הדילול של GelMA הוכנה על ידי דילול פתרון מניות של 20% (w/v) עם PBS ל-14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 ו-0% (w/v) והוספת LAP לריכוז קבוע של 0.15% (w/v) (איור 4a-i), שנמשך בסך הכל 55 דקות ו-12 שניות. כפי שצוין בתסריט הפרוטוקול הניסיוני, ההידרוגל היה crosslinking במשך 30 שניות בעוצמה של 2.0 mW / cm2 ב 400 ננומטר. כדי להעריך את ההבדלים בין התערובות, PBS―כמו דילול עבור GelMA ו alginate―הוכן עם 1 מ"ג / מ"ל כתום G. לכן, הבדל ספיגה בין דגימות בתוך תערובת אחת, כמו גם בין דילול סדרתי מזוהים עם ספקטרופוטומטר. ערכי הספיגה הנמדדים של כל שלב ריכוז שונים באופן משמעותי (p < 0.0001) ויש להם ערכי קורות חיים נמוכים מאוד בין 1.2% ל -3.4% לאורך שלבי הריכוז (n = 12 לכל שלב ריכוז). רגרסיה ליניארית הדגימה התאמה גבוהה עם ערך R² של 0.9869 (איור 4a-ii) ומפת חום אישרה את החלוקה ההומוגנית של כל ריכוז ואת ההבדל בין הריכוזים (איור 4a-iii). ערבוב אוטומטי של ארבעה ריאגנטים נערך עבור הדור של 5% (w / v) GelMA, 2% (w / v) alginate, 0.15% (w / v) LAP, ו- PBS כמו דילול ללא (התקנה 2) ועם (התקנה 3) קצה מגע (n = 96 עבור כל התקנה) עם אותם פרמטרים crosslinking (30 s, 2.0 mW / cm2, 400 nm). חלוקת ארבעת החומרים, ערבוב והפצה לצלחת באר 96 לקח 32 דקות 22 שניות. כל הניסויים עם GelMA ו alginate נערכו ב 37 °C (50 °F) כדי למנוע gelling תרמית אשר מונע צינורות של GelMA. עם אפשרות המגע הקצה, ערך קורות החיים הופחת מ-5.2% ל-3.4%, ובמיוחד, חריגים באזור התחתון נמנעו על ידי הסרת חומר עודף מהקצה (איור 4b-i). למרות שהערך הממוצע של 1.927 ו- 1.944 עבור התקנה 2 והגדרה 3 קרוב מאוד, מקדם הווריאציות מדגיש את הסטייה הפוחתת ביחס לממוצע. ניתן להשוות שורות בודדות בלוח הבאר 96 זה לזה באמצעות הדמיה של מפת חום כדי לזהות הבדלי שורה ו/או עמודות (איור 4b-ii).

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה של פרוטוקול עם משימות בודדות. זרימת העבודה המתוארת מחולקת לשבע משימות, המופרדות להתקנה, הכנה, ביצוע וניתוח. בהתחלה, יש להגדיר את התוכנה (משימה 1) כמו גם את החומרה (משימה 2). לאחר הכנת החומרים (משימה 3) ויצירת סקריפט הפרוטוקול (משימה 4), מודול הצינור מכויל על ידי הגדרת עמדות הפיפטה והמכל (משימה 5). לאחר מכן, סקריפט הפרוטוקול מבוצע בתחנת העבודה (משימה 6) ואימות ואימות (משימה 7) של תערובות מתבצעות כדי להעריך תערובות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תחנת עבודה בקוד פתוח והגדרת סיפון של מודול הצינורות. (א) תחנת העבודה המפותחת שואבת השראה מגישת פס ייצור, שבה דגימות מועברות דרך מודולים שונים, ומורכבת מהמודולים הבאים: צנרת, crosslinker, אחסון, תחבורה ומודול חישובי. (ב) הסיפון של מודול הצינורות מוגדר בהתאם לפריסה הניסיונית (למשל, סוג צלחת היטב, נפח צינור וכו '). הגדרת הסיפון המוצגת שימשה לניסויים שהוצגו ומורכבת מפיפטות תזוזה חיוביות עם טווח של 10−100 μL (M100E) ו- 100−1,000 μL (M1000E), מתלים קצה עם בוכנות נימיות (CP) עבור 100 μL (CP1000) ו 1,000 μL (CP1000), מיכל אשפה, מגש ערבוב, ומגש קלט עבור ריאגנטים קלט. (ג) מיקומי הסיפון הזמינים מוגדרים עם המספרים המוצגים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תוצאות עבור צנרת אוטומטית של תערובות גליצרול. (א) תכנון תחנת העבודה הגמיש מאפשר הערכה של שלוש הגדרות שונות (i) כדי לזהות פרמטרים אופטימליים לתוצאות הניתנות לשחזור. (ii) התוספת של מגע קצה וחימום של החומר הביאה לירידה במקדם ערכי השונות (CV) ותערובות הניתנות לשחזור עבור ההתקנה 3. כל ניסוי נערך עם 96 דגימות. (iii) התוויית ערכי מדגם יחיד לא הראתה השפעה על רצף הצנרת. (ב) התוצאות הניסיוניות של כל התקנה הוצגו עם מפות חום כדי לזהות את ההשפעה על הבדלים גולמיים/טורים, קצוות או תערובת ראשית. (ג) יכולת השחזור של התקנה 3 נותחה בתוך שמונה ריצות עצמאיות באמצעות (i) חציון, סטיית תקן, ערך קורות חיים ו- (ii) מפות חום. נתונים בחלוניות a-ii (n = 96) ו - b-i (n = 12) מוצגים עם האמצעים ונקודות הנתונים הבודדות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ- ****p < 0.0001 באמצעות ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תוצאות לערבוב משימות עם הידרוג'לים. (א) מתוך ג'לטין metacryloyl (GelMA) 20% (w / v) פתרון מניות, דילול סדרתי של 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, ו 0% (w / v) נוצר בתוך ריצה ניסיונית אחת באמצעות צלחת 96 היטב (n = 12 לכל ריכוז). (1) מקדם ערכי השונות (CV) השתנה בין 1.2% ל-3.4% לאורך הריכוזים המוכנים, ו-(ii) רגרסיה ליניארית הראתה התאמה גבוהה עם ערך R² של 0.9869. (iii) דילולים הומוגניים אושרו חזותית עם מפת החום שנוצרה. (ב) הידרוג'לים של רשת כפולה נוצרו עם 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) אלגינט, ו-0.15% (w/v) LAP (i) עם ובלי מגע קצה (n = 96 לכל התקנה) ומחוברים ל-30 שניות בעוצמה של 2.0 מ"ק/ס" מ ב-400 ננומטר. השילוב של מגע קצה הביא לירידה בערכי קורות החיים מ-5.2% ל-3.4%. (ii,iii) מפות חום מאשרות פחות סטיות בעת שימוש במגע קצה כדי להסיר חומר עודף מהקצה. נתונים בחלוניות a-i ו - b-i מוצגים עם האמצעים ונקודות הנתונים הבודדות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ- *p < 0.05, ***p < 0.001 ו- ****p < 0.0001 באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: סיכום ההבדל בסוג הפיפטה ובעיות עם ביו-חומרים צמיגים. (א) הריאגנט והבוכנה מופרדים על ידי כרית אוויר המתכווצת במהלך שלבי חלוקה ומתרחבת במהלך שלבי השאיפה. כאשר שואפים ומחלקים חומרים צמיגים, 'הזרימה' האיטית מציגה בעיות כגון בועות אוויר והתנהגות צינורות לא סדירה. (ב) פיפטות עקירה חיוביות מאפשרות שאיפה אמינה וחלוקה של חומר צמיג על ידי שימוש בוכנה בתוך הקצה. (ג) צנרת של חומרים צמיגים מאוד (למשל, 4% (w /v) alginate) יכול לגרום להצטברות של חומר עודף על הקצה, מה שמוביל לאי דיוק לאורך כל הניסויים. (ד) יישום מגש מגע קצה פשוט מאפשר הסרה של החומר העודף על הקצה וכתוצאה מכך שאיפה מדויקת וחלוקת כרכים. זה מתממש באמצעות הצד הפנימי של מכסה צלחת באר להציב על מיכל מתלה קצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חומר מס' 1 (ריכוז מלאי)ריכוז סופי של חומר #1חומר מס' 2 (ריכוז מלאי)ריכוז סופי של חומר #2חומרים #3 (ריכוז מלאי)ריכוז סופי של חומר #3מדולל (פתרון עבודה כתום G)ריכוז G כתום סופי בתערובתמוצג באיור
גליצרול (85% (w/v))80% (w/v)מים (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.059 מ"ג/מ"לאיור 3a−c
GelMA (20% (w/v))0% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)1 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))2% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.85 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))4% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.75 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))6% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.65 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))8% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.55 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))10% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.45 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))12% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.35 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))14% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.25 מ"ג/מ"לאיור 4a
GelMA (20% (w/v))5% (w/v)אלגינט (4% (w/v))2% (w/v)LAP (3% (w/v))0.15% (w/v)PBS (1 מ"ג / מ"ל כתום G)0.2 מ"ג/מ"לאיור 4b

טבלה 1: מבט כולל על הפרמטרים עבור הניסויים שנערכו.

שלב פרוטוקולבעיהסיבה אפשריתתמיסה
1.1אין אפשרות להתקין או לעדכן תוכנהאוזל שטח הדיסק בכרטיס SDבדוק את שטח הדיסק בכרטיס SD. במידת הצורך, הסר פריטים מיותרים, סל ריק או השתמש בכרטיס SD בגודל המתאים
1.2אין אפשרות להתקין APIיכולת ההתקנה של משתמשים מוגבלת (אין הרשאת משתמש בסיס)השתמש בפקודה 'sudo' מול הפקודות שצוינו כדי לקבל זכויות ניהול. בלינוקס, סוג זה של גישה ידוע בשם superuser.
3.1בעיות עם GelMAפונקציונליזציה, דיאליזה או ליופיליזציהפרוטוקול מפורט שלב אחר שלב כולל רשימת פתרון בעיות הזמינה ב- Loessner et al.33.
5.1 ו-6.2תחנת עבודה אינה מגיבה לפקודותבעיות חיבורתסובב את הכל ותכבה את המחשב. כבה את ספק הכוח עבור 10 שניות. הפעל מחדש את המחשב ואת תחנת העבודה.
5.1 ו-6.2תחנת עבודה אינה מגיבה לפקודותבעיות חיבורבדוק אם המחשב מזהה את חיבור ה- USB ויציאת ה- USB מוגדרת כראוי. ודא שחומת האש אינה מונעת את תהליך החיבור (עיין בקישור מתחת לטבלה 2).
5.1 ו-6.2אין אפשרות לפתוח קובץספריה שגויהבדוק את המנהל (נתיב תיקיה) כדי לוודא שהנתיב הנכון נמצא בשימוש. אם קובץ (לדוגמה, interface.py) לא נמצא, סביר להניח שנעשה שימוש בנתיב הלא נכון.
6.6.2הקצה אינו מחובר כראוי או נופל במהלך התנועהבעיית כיולחזור על שלבי הכיול עבור פיפטה וודא כי בוכנה נימי מחובר כראוי עם פיפטה.
6.6.2הקצה אינו מחובר כראוי או נופל במהלך התנועהבעיית קובץ מצורףפיפטה אינה מחוברת כראוי לציר הפיפטה וזזה במהלך שלבי התנועה. הדקו את הברגים בחוזקה כדי למנוע זאת.
6.6.2טיפ הוא שאיפה מעל החומרבעיית כיולחזור על הכיול של סוג מגש זה כדי להגדיר גובה כראוי.
6.6.2טיפ הוא שאיפה מעל החומרבעיית כיולבדוק את עוצמת הקול בצינור וודא שאמצעי האחסון שווה לאמצעי האחסון המוגדר ביישום מעצב הפרוטוקול.
6.6.2החומר טובל במהלך התנועהיותר מדי חומר עודף על קצההוסף אפשרות עגינה למגע קצה; לחלופין, ניתן גם להגדיל את הזמן למגע קצה.
6.6.2החומר מוצק או צמיגי מדי לצינורותהתנהגות תרמו-סרבוקטיבית של חומרבדוק את אפיון החומר התרמו-תגובה והתאם את טמפרטורת החימום/קירור של עגינה בטמפרטורה בהתאם.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

טבלה 2: פתרון בעיות בטבלה עם בעיות מזוהות, סיבות אפשריות וכן פתרונות לפתרון הבעיות.

קובץ משלים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צנרת של חומרים צמיגים, במיוחד הידרוג'לים עבור יישומים ביו-רפואיים19,20,21,33,47, הן משימות שגרתיות במעבדות מחקר רבות להכנת ריכוז מוגדר על ידי המשתמש או סדרת דילול עם ריכוזים שונים. למרות שזה חוזר על עצמו ואת הביצוע הוא פשוט למדי, זה מבוצע בעיקר באופן ידני עם תפוקת מדגם נמוכה18. מדריך זה מציג את הפעולה של תחנת עבודה בקוד פתוח, אשר תוכנן במיוחד עבור חומרים צמיגים, כדי לאפשר ערבוב אוטומטי של חומרים צמיגים עבור הדור לשחזור של ריכוזים הרצויים. תחנת עבודה זו ממוטבת עבור צנרת של הידרוג'לים כדי לאפשר טיפול אוטומטי ואמין מאוד על ידי שילוב של רציפי טמפרטורה עבור חומרים תרמוספונזיים, פיפטות תזוזה חיוביות לחומרים צמיגים, ומעגן מגע קצה אופציונלי כדי להסיר חומר עודף מהקצה. מודול הצינורות עבר אופטימיזציה ספציפית כדי לאפשר עיבוד של חומר צמיג באופן סטנדרטי ואוטומטי. בהשוואה לפיפטות כרית אוויר (איור 5a), פיפטות עקירה חיוביות (איור 5b) מחלקות חומרים צמיגים מבלי להשאיר שאריות חומר שנותר בקצה, וכתוצאה מכך שאיפות מדויקות וחלוקת כמויות. תחנת המגע האופציונלית מסירה עודפי חומר לדוגמה מהקצה (איור 5c,d), שהוא שימושי לחומרים דביקים (לדוגמה, 4% (w/v) alginate).

יישום מעצב הפרוטוקול מתוכנת במיוחד עבור הידרוג'לים ומאפשר דילול של עד ארבעה ריאגנטים עם ריכוזים שונים ועד שני דילונטים. הסיכון של שגיאות בחישוב של דילול סופי נמנע ביישום זה, כמו משתמשים רק לבחור את הריכוז הרצוי או את שלבי דילול סדרתי. אמצעי אחסון נדרשים של שאיפה וחלוקה מחושבים באופן אוטומטי, נשמרים בקובץ טקסט נפרד של תיעוד ולאחר מכן מתמלאים בקובץ ה- Script של הפרוטוקול. יישום עיצוב פרוטוקול זה מעניק למשתמש שליטה מלאה על כל הפרמטרים הניסיוניים (למשל, מהירות צנרת) ומבטיח תיעוד פנימי של הפרמטרים החשובים. אפליקציית עיצוב הפרוטוקול לוקחת בחשבון את רמת המילוי של המאגר (למשל, ובכן) ומשנה את גובה השאיפה/חלוקה כדי למנוע טבילה מיותרת בחומרים הצמיגיים. תכונה משולבת זו מונעת הצטברות חומר על הקיר החיצוני של הקצה, ובכך, מבטיחה שאיפה אמינה וחלוקת משימות לאורך הפרוטוקול. למרות יישום מעצב הפרוטוקול פותח עבור שלבי דילול הידרוג'ל, זה יכול לשמש גם עבור דילול של נוזלים nonviscous, כגון צבעי אורנג 'G. יישום מעצב הפרוטוקול, הנגיש באמצעות המאגר תחת '/דוגמאות/פרסום-JoVE', הוא הגרסה המוסברת בסעיף הפרוטוקול ומודגשת בסרטון הווידאו. גירסה זו לא תעודכן. עם זאת, גירסה מעודכנת של יישום מעצב הפרוטוקול זמינה דרך דף המאגר הראשי. מסוף הכיול פותח בתחילה על ידי Sanderson48 והוא עבר אופטימיזציה לכיול של פיפטות עקירה חיוביות.

כמתואר בפרוטוקול סעיף 4, פיפטות כמו גם מכולות חייב להיות מכויל בתחילה. תהליך כיול זה חיוני כדי להגדיר ולשמור את העמדות המשמשות לאחר מכן לחישוב מרווחי התנועה. לכן, ביצוע פרוטוקול מוצלח מסתמך על עמדות כיול מוגדרות היטב, כמו נקודות כיול שגויות עלול לגרום לקריסת הקצה לתוך מיכל. מכיוון שמיקום הבוכנה של הפיפטות חייב להיות מכויל באופן ידני, דיוק ודיוק הצינורות תלויים במידה רבה בכיול המבוצע. הליכי כיול אלה תלויים מאוד בחוויית המשתמש עם מודול הצינורות, ולכן, הדרכה עם צוות מנוסה מומלץ בהתחלה כדי להבטיח הליכי כיול נאותים. בנוסף לכיול הידני במודול הצינורות, יש לכייל את הפיפטה עצמה כדי להבטיח צנרת מדויקת. מומלץ לכייל את הפיפטות לפחות כל 12 חודשים כדי לעמוד בקריטריוני הקבלה כמפורט ב- ISO 8655. כדי להעריך את כיול פיפטה באופן פנימי, אימות ואימות זמינים כמתואר על ידי Stangegaard et al.16.

עבור הדור של ערכת נתונים אמינה, זה חיוני כדי להתחיל עם ריאגנטים באיכות גבוהה. הדבר חשוב במיוחד עבור משימות עיבוד הידרוג'ל, שכן וריאציות אצווה לאצווה עשויות להשפיע על התוצאות שנוצרו בפרוטוקול זה. בנוסף לווריאציות של אצווה לאצווה, שינויים עדינים בהכנת אמצעי אחסון קטנים עשויים גם לתרום להבדלים במאפיינים. כדי למנוע זאת, מומלץ להכין כרכים גדולים יותר, אשר ניתן להשתמש בהם עבור הניסויים המלאים.

הליכי האימות והאימות מסתמכים על שימוש בצבע כדי לזהות תערובות אמינות. הפרוטוקול המוצג מתאר את היישום של אורנג ' G, אך ניתן להתאים את זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול והניתוח לצבעים פלואורסצנטיים49,50. השימוש של אורנג 'G מפחית את הדרישות הטכניות של spectrophotometer ומבטל אמצעי זהירות שננקטו כדי למנוע הלבנה של צבעי פלורסנט לאחר חשיפה לאור. בעיות בהתנהגות המסה או היווצרות אשכול של הצבע לא נצפו עם החומרים המוצגים במהלך ניסויים, אבל עשוי להופיע עם חומרים אחרים. היווצרות אשכול פוטנציאלית, ולכן, האינטראקציה בין צבע וחומר ניתן לזהות בקלות עם מיקרוסקופ.

ההליכים והטכניקות המוצגים במדריך זה מוסיפים יכולת אוטומציה לזרימות עבודה נוכחיות עבור חומרים צמיגים כדי להשיג משימות אמינות ביותר עם עבודה אנושית מינימלית. טבלת פתרון הבעיות שסופקה (טבלה 2) כוללת בעיות שזוהו ומציגה סיבות אפשריות וכן פתרונות לפתרון הבעיות. תחנת העבודה שהוצגה הוחלה בהצלחה על חומרים פולימריים טבעיים (ג'לטין, ג'לן גאם, מטריג'ל) וסינתטיים (למשל פולי(אתילן גליקול) [PEG], פלורוני F127, לוטרול F127) חומרים פולימריים למשימות צנרת אוטומטיות. בפרט, השילוב של תחנת עבודה בקוד פתוח ויישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח המיועד לחומרים צמיגים יהיה שימושי מאוד עבור חוקרים העובדים בתחומי ההנדסה הביו-רפואית, מדעי החומר והמיקרוביולוגיה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CM ו- DWH הם מייסדים ובעלי מניות של Gelomics Pty בע"מ. CM הוא גם דירקטור של Gelomics Pty בע"מ. המחברים מצהירים על שום ניגוד אינטרסים רלוונטי לנושא מאמר זה. למחברים אין זיקות רלוונטיות אחרות או מעורבות פיננסית עם כל ארגון או גוף בעל אינטרס כספי או סכסוך כספי עם הנושא או החומרים הנדונים במאמר מלבד אלה שנחשפו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לחברי המרכז לרפואה רגנרטיבית ב- QUT, בפרט, אנטוניה הורסט ופאבל מייזצ'נק על ההצעות והמשוב המועילים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר לתואר שני של QUT עבור SE, ועל ידי מועצת המחקר האוסטרלית (ARC) תחת הסכם מענקים IC160100026 (מרכז ההכשרה לטרנספורמציה תעשייתית ARC ב- Additive Biomanufacturing). NB נתמך על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) פיטר דוהרטי מלגת מחקר קריירה מוקדמת (APP1091734).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 שפופרות תגובהFisher Scientific, Inc. (ארה"ב)14-959-53A
שפופרות 5 מ"לPacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. Ltd. (אוסטרליה)SCT-5MLתלוי בפרוטוקול הניסוי; ניתן להשתמש גם בשפופרות Eppies (0.5, 1, 1.5 מ"ל) או Falcon (15, 50 מ"ל); המוצר מיוצר על ידי Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
צינורות תגובה של 50 מ"לFisher Scientific, Inc. (ארה"ב)14-432-22
70% w/w אתנולLabChem, Inc. (ארה"ב)aja726-5Lpl
צלחת 96 בארותThermo Fisher Scientific, Inc. (ארה"ב)https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
AlginateNovaMatrix4200001https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
ג'לטין מתקרילואיל (GelMA)
ליתיום פניל-2,4,6-טרימתיל-בנזויל פוספינאט (LAP)סיגמא-אולדריץ', בע"מ (ארה"ב)900889
מפתח M4 ו-M5 אלןOpenBuilds, inc. (ארה"ב)179, 190זמין גם בכל חנות לחומרי בניין. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeGפישר סיינטיפיק (ארה"ב)O267-25https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Thermo Fisher Scientific, Inc. (ארה"ב)14190-144לסירוגין: טבליות PBS: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
<חזק>ציוד
בלוקים מאלומיניום לרציף טמפרטורהRatek Instruments Pty. Ltd. (אוסטרליה)SB16עבור גדלי צינורות שונים זמינים.
http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html איזון אנליטיSartorius AG (גרמניה)ED224S
רובוט לטיפול בנוזלים בקוד פתוח: מוצר מסחריOpentrons Laboratories, Inc. (ארה"ב)OT-One S Prohttps://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
רובוט לטיפול בנוזלים בקוד פתוח: פתוח חומרת מקורמורכבים בתוך החברה בגישתקבצי חומרה ותוכנה נגישים באופן חופשי ב-GitHub וב-Zenodo (קישורים מסופקים); הוראות בנייה מסופקות. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
פיפטה תזוזה חיובית: MicromanEGilson, Inc. (ארה"ב)FD10006תלוי בגודל הנדרש. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
ספקטרופוטומטרBMG LABTECH GmbH (גרמניה)CLARIOstar
טיפים: בוכנות נימיותGilson, Inc. (ארה"ב)F148180תלוי בגודל הנדרש. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191
גודל מים דה-מינרליים או טהורים במיוחד (MilliQ)פרוטוקול מפורט פנימי מסונתז (כולל חומרים והפניות) זמין ב-Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 בלוקים קוד פתוח

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
  2. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  3. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
  4. Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
  5. Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712(2011).
  6. Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
  7. Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  8. Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344(2010).
  9. Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
  10. Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
  11. Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
  12. Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
  13. Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
  14. Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
  15. Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
  16. Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
  17. Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
  18. Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002(2019).
  19. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  20. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Advances in engineering hydrogels. Science. 356 (6337), (2017).
  21. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  22. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  23. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
  24. Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018(2018).
  25. Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
  26. Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
  27. Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510(2020).
  28. Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
  29. Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
  30. Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75(2018).
  31. Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
  32. Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
  33. Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  34. Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
  35. Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976(2016).
  36. Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
  37. Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
  38. O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
  39. LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
  40. Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
  41. Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
  42. Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
  43. Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
  44. Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
  45. Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
  46. Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
  47. Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  48. Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
  49. Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
  50. Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GelMA Alginate

מאמרים קשורים