מאמר שיטה

פרוטוקול משופר כדי לטהר ו מונו ישירות-Biotinylate BDNF בתוך צינור ללימודי סחר בתאי הסלולר בנוירונים

DOI:

10.3791/61262

⸱

11 ביולי 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאים HEK293 באופן חסכוני ומטוהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. לאחר מכן BDNFavi באופן ישיר מונו-biotinylated עם בירה אנזים בשפופרת. Bdn, ו מונו-biotinylbdni שמירה על הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה BDNF זמין מסחרית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקומביננטי BDNF המכיל רצף Avi (Bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 ולאחר מכן מטוהרים ביעילות על ידי כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול התפתחות פותחה כדי ישירות מונו-biotinylate אוחר Bdn, עם בירה אנזים בצינור. בתגובה זו, שומרת על הפעילות הביולוגית של מונו-ביוטיליס.

Neurotrophins הם מטרה נגזר גורמי הצמיחה לשחק תפקיד בפיתוח עצבי ותחזוקה. הם דורשים מנגנוני הובלה מהירה לאורך השביל endocytic כדי לאפשר איתות למרחקים ארוכים בין תאים עצביים שונים. התפתחות של כלים מולקולריים כדי ללמוד את הסחר של neurotrophins אפשרה מעקב מדויק של חלבונים אלה בתא באמצעות הקלטה vivo . בפרוטוקול זה פיתחנו הליך מיטבי וחסכוני לייצור BDNF מונו-biotinylated. משתנה bdnf רקומביננטי המכיל רצף avi biotinylable (bdnפאבאני) מופק בתאי HEK293 בטווח יקרוגרם ולאחר מכן מטוהרים בהליך מדרגי בקלות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. BDNF מטוהרים לאחר מכן יכול להיות מונו הומוגנזיס ביולוגי על ידי תגובה ישירה באמצעות מבחנה עם בירה אנזים בצינור. הפעילות הביולוגית של BDNF מונו-biotinated (mbtBDNF) יכול להיות מצומדת כדי streptavidin-מעלה מעלה לתוך fluorophores שונים. BDNFAvi ו בmbtbdnf לשמור על הפעילות הביולוגית שלהם הפגינו באמצעות זיהוי של מטרות זרחתי במורד הזרם באמצעות הכתם המערבי והפעלה של מקדם שעתוק CREB, בהתאמה. באמצעות streptavidin-הנקודות הקוואנטום, היינו מסוגלים לדמיין את הקשר באמצעות הפנמה במקביל עם ההפעלה של CREB, אשר זוהה עם נוגדן מסוים פוספהו-CREB. בנוסף, mbtBDNF מעלה מצועם streptavidin-הנקודות הקוונטיות היה מתאים לניתוח הובלה נסיגה בנוירונים בקליפת הבית הגדול בתאי מיקרופלואידיג. כך, בצינור המיוצר mbtBDNF הוא כלי אמין כדי לחקור את הדינמיקה של איתות פיזיולוגי אנדוכמה וסחר בנוירונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים הם יחידות תפקודית של מערכת העצבים בעל מורפולוגיה מורכבת ומיוחדת המאפשרת תקשורת סינפטית, ולכן, הדור של התנהגות מתואמת ומורכבת בתגובה לגירויים שונים. התחזיות הנוירואליות כגון דנדריטים ואקאונים הן תכונות מבניות קריטיות המעורבות בתקשורת עצבית, ונוירוטרופלנים הם שחקנים קריטיים בקביעת המבנה והתפקוד שלהם1. Neurotrophins הם משפחה של גורמי צמיחה מופרש הכוללים NGF, NT-3, NT-4, ואת המוח נגזר neurotrophic factor (BDNF)2. במערכת העצבים המרכזית (cn), bdnf משתתפת בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל neurotransmission, הארבוריזציה הדנדריטי, התבגרות של השדרה הדנדריטי, פוטנציאל לטווח ארוך, בין השאר3,4. לכן, BDNF משחק תפקיד קריטי בוויסות תפקוד עצבי.

תהליכים סלולאריים שונים מווסת דינמיקה BDNF ותפקוד. על פני השטח העצבי, BDNF מאגד את הקולטן הטרופויוסין קינאז B (TrkB) ו/או קולטן נוירוטרופין p75 (p75). Bdnf-trkb ו-bdnf-p75 מתחמי הם מסודרים וממוינותבתוךמערכות endocytic שונים 5,6,7,8. תקן סחר תאיים של מתחם bdnf/trkb נדרש עבור איתות bdnf נאות במעגלים עצביים שונים9,10,11. מסיבה זו, הבנה עמוקה של הדינמיקה הסחר BDNF ושינויים שנמצאו בתהליכים pathפסלוגיים הוא חיוני כדי להבין את האיתות BDNF בריאות ומחלות. התפתחות הרומן והכלים המולקולריים הספציפיים לניטור תהליך זה יסייעו לנהוג בשדה זה קדימה ולאפשר תפיסה טובה יותר של מנגנוני הרגולציה המעורבים.

ישנם מספר כלים זמינים למחקר של סחר BDNF בנוירונים. מתודולוגיה בשימוש נפוץ כוללת את הרקומביננטי bdnf מתויג עם מולקולות פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק (gfp) או הווריאציה monomeric אדום העביר המשתנה של gfp mcherry12,13. עם זאת, קיצור מרכזי של ביטוי overdnf הוא שזה מבטל את האפשרות של אספקת ריכוזים ידועים של נוירוטרופין זה. כמו כן, זה עלול לגרום רעילות הסלולר, מטשטש את הפרשנות של תוצאות14. אסטרטגיה חלופית היא העברה של מעבר החצייה של TrkB מתויג, כגון דגל-TrkB. מתודולוגיה זו מאפשרת ללמוד את הדינמיקה של TrkB הפנמה15, אבל זה כולל גם העברה, אשר עשוי לגרום לתפקוד שונה trkb ורעילות הסלולר. כדי להתגבר על מכשולים מתודולוגיים אלה, רקומביננטי משתנים של ngf ו bdnf המכיל רצף Avi (bdnפאבאני), אשר יכול להיות מונו-biotinated על ידי ביוטין-ligase אנזימים בירה, פותחו16,17. Biotinylated רקומביננטי BDNF יכול להיות מצמידים כלים שונים מאוגד streptavidin, אשר כוללים fluorophores, חרוזים, חלקיקים פאראמגנטים בין היתר לאיתור. מבחינת הדמיה של תא חי, נקודות הקוונטים (QD) הפכו לעתים קרובות fluorophores, כפי שהם מאפיינים רצוי עבור מעקב יחיד חלקיק, כגון בהירות מוגברת ועמידות הלבנת כאשר לעומת מולקולה קטנה fluorophores18.

הייצור של מונו-biotinylated BDNF (mbtBDNF) באמצעות Bdnפאבאני הושגה על ידי העברת שיתוף של פלמידים הנהיגה ביטוי של Bdnפאבאני ובירה, ואחריו טיהור של חלבון רקומביננטי על ידי כרומטוגרפיה של אהדה עם תשואה של 1-2 μg של BDNF ל 20 מ ' של מדיה תרבותית ממוזגת17. כאן, אנו מציעים שינוי של פרוטוקול זה המאפשר את טיהור BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג, אשר מבקש למקסם את ההתאוששות מחלבון בפרוטוקול מבוסס טור כרומטוגרפיה על קלות מניפולציה. הסוכן המשמש לזיהום, פוליאתילן, מבטיח שיטה חסכונית מבלי להקריב את התשואה החוצה. הצעד מונו-ביולציה הותאם לתגובת חוץ גופית כדי למנוע את הסיבוכים הקשורים בשיתוף פעולה ולהבטיח תוויות הומוגנית של BDNF. הפעילות הביולוגית של mbtbdnf הוכח על ידי כתמי המערבי וניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית, כולל הפעלת pcreb ולחיות הדמיה תא ללמוד הובלה סיבי הנסיגה של bdnf בתאי microfluidic. השימוש בפרוטוקול זה מאפשר מיטוב, ייצור תשואה גבוהה של מונו הומוגנית-biotinylated ו פעילים ביולוגית BDNF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות של CONICYT (הנציבות הלאומית של צ'ילה למחקר מדעי וטכנולוגי). הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדות הביוסקיוריטי והביואתיקה ובעלי החיים של האוניברסיטה האפיפיורית קתליקה דה צ'ילה. הניסויים הכרוכים בבעלי חוליות אושרו על ידי ועדת הרווחה של ביואתי ובעלי החיים של האוניברסיטה האפיפיורית קתליקה דה צ'ילה.

הערה: הפרוטוקול הבא נועד לטהר את BDNFAvi מתוך נפח כולל של 500 mL של בינוני ממוזג המיוצר בתאי HEK293. כמות המדיום הממוזג המיוצר ומעובד כדי לטהר את BDNFAvi יכול להיות למעלה או להוריד את קנה המידה לפי הצורך. עם זאת, אופטימיזציה נוספת עשויה להיות נחוצה בנסיבות אלה. ניתן למצוא את הרכב המדיה התרבותית והמאגרים הנמצאים בשימוש בכל הפרוטוקול בחומרים משלימים.

1. ייצור וטיהור של BDNFAvi מתוך מדיה ממוזגת HEK293

  1. העברה של תאי HEK293
    1. לגדול HEK293 תאים 70% המפגש בתוספת DMEM בינונית (10% בסרום העובר, 1 x מגלוטמט מוסף, 1x אנטיביוטי/antimycotic) ב 15 ס מ מנות התרבות ב 37 º C.
    2. שנה את המדיה הבינונית לחוצץ.
    3. הכן את תערובת הדי. אנ. איי. לזיהום העור השתמש בשני שונים 15 מ ל צינורות חרוטי כדי לדלל דנ א ו פיי 40 K, בהתאמה. לדלל 20 μg של DNA פלמיד בנפח הסופי של 500 μL בשפופרת אחת. לדלל 60 μg של ליניארי פיי 25K בנפח הסופי של 500 μL בצינור השני. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
    4. מערבב בזהירות את פתרון הדי-אן-איי. בצינור פיי, ערבוב פעם אחת בתנועה דגירה בטמפרטורת החדר עבור 25 דקות.
    5. טפטוף 1 מ ל של התערובת הפיי-די-אן-איי במהלך כל 15 ס מ המנה. מודיית את התאים עם התערובת פיי-די-אן במשך 3 שעות ב 37 º C.
    6. לשנות את המדיום לחיץ הדגירה טרי.
  2. איסוף ואחסון מדיה
    1. לאסוף את המדיום מכל הצלחות 48 h לאחר הגלגול של תאים HEK293. הכינו מלאי מרוכז של הפתרונות המתוארים בסעיף "מאגר השינויים supernatant" של קובץ משלים 1 והוסיפו אותם ל-HEK293-הסופראנט כדי להשיג את הריכוזים הסופיים המפורטים.
      הערה: ניתן להיפטר מתאים או לשחזר אותם לצורך ניתוח נוסף.
    2. מודאת המדיום בקרח עבור 15 דקות.
    3. מחלקים את המדיום לתוך צינורות צנטריפוגה.
    4. צנטריפוגה את המדיום ב 10,000 x g עבור 45 דקות בצנטריפוגה 4 ° c. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת תא ותאים מתים המושהים במדיה.
    5. לאסוף את הסופרנטנים, להוסיף BSA בריכוז הסופי של 0.1%. ולאחר מכן לאחסן ב-20 ° c. התקשורת יכולה להיות מצוטט לפני הקפאה על הפשרה מהר יותר במהלך שלב הטיהור.
      הערה: זמני אחסון של מדיה ממוזגת הקפואה של עד 2 חודשים הניבו תוצאות חיוביות, שעות אחסון ארוכות יותר לא הוערכו.
  3. ריכוז וטיהור מדיה
    1. הפשרת אמצעי התקשורת באמבט של 37 ° c.
    2. . מחלקים את המדיה לצינורות הצנטריפוגה
    3. צנטריפוגה את המדיום עבור 1 h ב 3,500 x g ב 4 מעלות צלזיוס צנטריפוגה מקורר. שלב זה מאפשר חיסול של פסולת התא הנותרים כדי להבטיח זרימה נאותה דרך העמודה כרומטוגרפיה.
    4. השתמש בריכוז חלבון עם הפסקת kDa 10 כדי להפחית את התקשורת מ 500 mL ל 100 mL. בצע את הפרמטרים הצנטריפוגה המומלצים של היצרן לצורך ריכוז אופטימלי.
    5. הוסף 500 μL של Ni-נ. ת. ד. חרוזים למדיה מרוכזת ו מודדת לילה ב 4 ° c ב נדנדה.
    6. הכנס את מכשיר הכרומטוגרפיה ושפוך את המדיה לתוכו. תן לו לנוח 5 דקות ולאחר מכן לפתוח את 2-הדרך רזלים תרנגול לתת את המדיום לזרום.
    7. לשטוף את החרוזים עם 5 מ ל של מאגר לשטוף עבור 5 דקות. הקפד להשהות מחדש את החרוזים בעמודה. לנקז את מאגר לשטוף ידי פתיחת הפקק 2-כיוון. . אני חוזר 3 פעמים
    8. הוסף 1 mL של מאגר הימנעות לעמודה. הקפד להשעות מחדש את החרוזים בעמודה. דגירה של 15 דקות, ולאחר מכן לאסוף את החומקת בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. חזור על שלב זה 3 פעמים עבור הימנעות מוחלטת של BDNFAvi.
    9. טען 5 μL של כל משחרו ריכוזים שונים של BDNF זמין מסחרית (40-160 ng) ב 15% פוליאקרילאמיד ג'ל. לזהות את החלבון הטהור על ידי הכתמים המערביים באמצעות נוגדן אנטי BDNF.
    10. לקבוע את הריכוז של BDNFAvi מטוהרים בכל להתחמק באמצעות עקומת ריכוז מוכן עם BDNF זמין מסחרית.
    11. הורדה ואחסון של BDNFAvi מטוהרים ב-80 ° c.

2. בתוך מונו-ביוקטילציה של BDNFAvi באמצעות אנזים בירה

  1. תגובת מונו-ביונילציה מחוץ למבחנה
    1. הכנת פתרונות מלאי מרוכזים של ריאגנטים מאגר biotinylation. השימוש במניות מרוכז יצמצם את הדילול של החלבון הרקומביננטי.
    2. לקחת סדרת מחלקים 800 ng של bdnfavi ולהוסיף את מאגר ביולציה ריאגנטים ואת בירה האנזים ביחס הטוחנת 1:1 bdnf. לדוגמה, עבור הוספת נפח תגובה סופי של 200 μL; 100 μL של פתרון המכיל 800 ng של BDNFAvi, 20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3, 20 μL ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100 mM, 20 μL d-biotin 500 μM, 0.8-1 μg עד 1 μL של בירה-GT, והשלם כדי 200 μL עם מים באולטרסאונד.
      הערה: התגובות biotinylation מוצלחת בוצעו עם aliquots של 400 μL המכיל ריכוז של כ 30 ng/μL BDNFAvi, וכתוצאה מכך bdnfavi באופן הומוגנטי ביולוגי לריכוז הסופי של ~ 20 ng/μL בתגובה הסופית.
    3. מודקון את התערובת ב 30 ° c בתנור הכלאה עבור 1 h. לערבב את התוכן על ידי היפוך צינור כל 15 דקות.
    4. הוסף את אותו כמות של ATP ובירה כמו בשלב 2.1.2 וחזור על 2.1.3 שלב.
    5. חנות ב-80 ° צ' לניתוחים עתידיים או לשמור על קרח לשימוש מיידי (לדוגמה, בקרת איכות biotinylation).
  2. ניתוח ביוטילציה
    1. בלוק 30 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin לדגימת BDNF ב 1 mL של חסימת מאגר. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h בתוך מסובבי הצינורית מיקרוצנטריפוגה.
    2. מזרז את החרוזים המגנטיים באמצעות מתלה הפרדה מגנטי במשך 3 עד 5 דקות או עד שהמאגר מופיע נקי לחלוטין מהחרוזים ומתעלם מהמאגר החוסם.
    3. הוסף 50 μL של מאגר חסימות טרי ו 80 ng של מונו-biotinylated BDNFAvi (mbtBDNF) לדגום את החרוזים, והקפד להשעות אותם לגמרי על ידי ביצוע.
    4. מודטה ב 4 ° c עבור 1 h בתוך מסובבי הצינורית מיקרוצנטריפוגה מסתובב כ 20 סל ד.
    5. לאסוף את החרוזים באמצעות מתלה ההפרדה המגנטי עבור 3 כדי 5 דקות, ולאסוף את supernatant, שמירה על 30 μl סדרת מחלקים לניתוח.
    6. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 500 μL של PBS, ולאחר מכן לאסוף אותם באמצעות מתלה ההפרדה המגנטי עבור 3 כדי 5 דקות. שחזר את הסופרנטאנט ושמור 30 μL לניתוח.
    7. הוסף 10 μL של מאגר טעינת 4x לחרוזים.
    8. מחממים את הדגימות עד 97 ° c במשך 7 דקות כדי לעבור את מתחת לשעון.
    9. זיהוי מmbtbdnf באמצעות נוגדן אנטי-BDNF מסוים19.

3. אימות הפעילות הביולוגית של בmbtbdnf

  1. זיהוי של pTrkB והטבה באבן חשופה מערבית.
    1. זרעי 2,000,000 מנות לתרבות הקליפת העצב בשנת 60 מ"מ.
    2. תרבות הנוירונים במשך 7 ימים (DIV7). לאחר מכן, לשנות את המדיום מדיה נוירובסיס שאינם בתוספת בעת הפעלת הניסוי.
    3. שעה אחת לאחר שינוי בינוני, להוסיף mbtBDNF לריכוז סופי של 50 ng/mL. מודקון למשך 30 דקות ב 37 º C. שמור על צלחת שליטה שלילית (לא מגורה עם BDNF) ו צלחת בקרה חיובית (מטופלים עם 50 ng/mL של BDNF זמין מסחרית).
    4. לאסוף את המדיום ולשטוף בעדינות כל צלחת עם 1x PBS. לאסוף ולמחוק את ה-1x PBS.
    5. הניחו את הכלים על הקרח והוסיפו 50-80 μL של מאגר הליזה לכל מנה. השתמש במגרד התא כדי להפעיל את התאים.
      הערה: יש לבצע את שלב הליזה במהירות האפשרית כדי למנוע התדרדרות והשפלה של חלבונים. 1-2 דקות של גירוד נמרץ מספיק כדי לדמיין את החלבונים של עניין על ידי בלוק המערבי.
    6. לאסוף את מאגר הליזה ומערבבים במיקסר מערבולת במהירות הגבוהה ביותר עבור 5 s.
    7. צנטריפוגה את מאגר הליזה ב14,000 x g (4 ° c) עבור 10 דקות.. תאסוף את הסופרנטאנט
    8. מכמת את תכולת החלבון של סופרנטנט על ידי פרוטוקול בדיקת חלבון BCA20.
    9. הוסף מאגר טעינת כדי סדרת מחלקים המכיל 30-50 μg של חלבון לכל מצב ולטעון אותו ב 12% אלקטרופורזה ג'ל עבור בלוק מערבי. זיהוי pTrkB והטבה באמצעות פוספפו-נוגדנים ספציפיים כדי לאמת את הפעילות הביולוגית של BDNFAvi.
  2. אימות של פעילות ביולוגית של BDNF-QD על-ידי pCREB אימונוoforסנס.
    1. זרע 40,000 הנוירונים בקליפת העצב בתוך 10 מ"מ שמיכות, בעבר אוטוקלבד וטיפל עם פולי-L-ליזין כפי שמתואר בעבר21.
    2. תרבות הנוירונים ב7-8 ימים במאגר תחזוקה עצבי (ראה חומרים משלימים) ב 37 º C.
    3. כדי להתחיל את הניסוי, לשנות את המדיום לבטל בינוני נוירובסיס neurobasal ב 37 º C עבור 1 h.
    4. הכינו mbtBDNF מבצוחה לנקודות הקוונטים (BDNF-QD) על-ידי הוספה ל-mbtBDNF, הנפח הדרוש של נקודה קוונטית streptavidin המשלים (streptavidin-QD) כדי להשיג 1:1 BDNF-QD היחס הטוחנת. אז, לדלל 20 μL עם מדיום נוירובסיס. עוטפים את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
      הערה: הכינו צינור אחר עם אותו כמות של נקודה קוונטית streptavidin המשלים ולדלל אותו 20 μL עם מדיום נוירוסיס כפקד שלילי.
    5. מודחה את תערובת mbtBDNF/streptavidin-QD במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ברוקר.
    6. לדלל את BDNF-QD לריכוז הסופי הרצוי (200 pM ו 2 ננומטר) במדיום neurobasal סיס.
    7. לאחר 1 h של הדגירה עם בינונית נוירובסיס שאינם בתוספת, לעורר את הנוירונים עם BDNF-QD או streptavidin-QD (שליטה) לריכוז הסופי של 200 pM ו 2 ננומטר של BDNF עבור 30 דקות ב 37 ° c.
    8. לשטוף את שמיכות 3 פעמים עם 1x PBS (37 ° c) ולתקן את התאים עבור 15 דקות על ידי טיפול coverslips עם 4% הפתרון פאראפורמלדהיד המכיל מעכבי פוספספטאז.
    9. לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS, ולאחר מכן דגירה עם חסימה/חדירות מאגר (BSA 5%, טריטון X-100 0.5%, 1x פוספאטאז מעכבי) עבור 1 h.
    10. דגירה עם נוגדן anti-pCREB 1:500 (ב 3% BSA, 0.1% טריטון X-100) לילה ב 4 ° c.
    11. למחרת, לשטוף 3 פעמים עם ה-PBS 1x, ו הדגירה עבור 1 h עם הנוגדן המשני 1:500 (3% BSA, 0.1% טריטון X-100).
    12. לשטוף 3 פעמים עם 1 x PBS. הוסף הואכסט פתרון כתמים גרעינית (5 μg/mL) עבור 7 דקות.
    13. לשטוף 3 פעמים עם 1 x PBS ו הר.
  3. ויזואליזציה של התחבורה הרטרוגרלית של BDNF-QD ב נוירונים חיים
    1. הכינו תאי מיקרו-פלואידים ונוירונים בזרעים כמתואר בעבר16.
    2. לאחר 7-8 ימים בתרבות, לשנות את המדיום למדיום נוירובסיס שאינו בתוספת.
    3. הכינו mbtBDNF מבצוחה לנקודות הקוונטים (BDNF-QD) על-ידי הוספה ל-mbtBDNF, הנפח הדרוש של נקודה קוונטית streptavidin המשלים (streptavidin-QD) כדי להשיג 1:1 BDNF-QD היחס הטוחנת. אז, לדלל 20 μL עם מדיום נוירובסיס. עוטפים את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור.
      הערה: הכינו צינור אחר עם אותו כמות של נקודה קוונטית streptavidin המשלים ולדלל אותו 20 μL עם מדיום נוירוסיס כפקד.
    4. מודחה את תערובת mbtBDNF/streptavidin-QD במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ברוקר.
    5. לדלל את BDNF-QD לריכוז הסופי הרצוי (2 ננומטר).
    6. לאחר 1 h של דגירה עם בינוני נוירובסיס שאינו בתוספת להוסיף את bdnf-qd או את התערובת בקרת לתאי סיבי של החדר microfluidic. מודקון עבור 210 דקות ב 37 ° צ' כדי להבטיח הובלה נטו נסיגה של BDNF-QD.
    7. עבור הדמיה של תא חי, באופן חזותי העברת התחבורה בקטע של המיקרוחריצים הנמצאים בראש תא הגוף התא באמצעות מטרה 100x באמצעות מיקרוסקופ המתאים למטרה זו (37 ° צ' צלזיוס ו-5% CO2). לרכוש תמונות ב 1 מסגרת/s.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בפרוטוקול מבוסס עמודות כרומטוגרפי מאפשר עיבוד של כמויות משמעותיות של מדיה ממוזגת HEK293. באיור 1, התוצאות של טיהור של BDNFAvi מ 500 mL של מדיה ממוזג מוצגים. הפרשות רצופות של BDNFAvi מ-Ni-נ. ת. ע. מחרוזת תשואה הפחתת ריכוזים של BDNFAvi (איור 1A). לאחר ארבע הפרשות רצופות (כל מתמשך 15 דקות), רוב BDNF שנתפסו החרוזים הוא התאושש. הריכוזים של הטווח להתחמק מ 6 כדי 28 ng/μL, ואת התפוקה הכוללת הסתכם כ 60 μg של BDNFAvi (טבלה 1). הופק BDNFAvi ביעילות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, מתודולוגיה ממוטבת לייצור וטיהור של mbtBDNF בהליך מבוסס כרומטוגרפיה הזיקה מתוארת, בהתבסס על עבודתם של סונג ומשתפי פעולה17. המיטובים כוללים את השימוש במיגיב התרגום החסכוני (פיי) תוך שמירה על יעילות של שיטות מעבר יקרות יותר כגון lipofectamine. מיטוב זה מיתרגם הפחתת עלות משמעותית בפרוטוקול, המאפשר מדרגיות תוך שמירה על עלות גבוהה-יעילות. הפרוטוקול כולל גם שיקולים של שימוש בקלות, כולל הקפאת המדיה הממוזגת למשך עד חודשיים. מיטוב אלה להפוך את ההליך להתאמה לצרכים של כל מעבדה, לשפר את העלות והאפקטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים בהכרת תודה התמיכה הפיננסית של Fondecyt (1171137) (FCB), מרכז בסיס של מצוינות במדע וטכנולוגיה (AFB 170005) (FCB), מילניום-גרעין (P07/011-F) (FCB), פרס החוקר הבכיר לאמון (107116/Z/15/Z) (GS) ו בבריטניה מחקר דמנציה פרס קרן (GS). העבודה הזאת נתמכת על ידי Unidad דה מיקרוצאדה Avanzada UC (UMA UC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2 כיווני stopcockBioRad7328102מכשיר כרומטוגרפיה רכיב
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF מאגר פליטה
אקרילאמיד/ביסקרילאמידBioRad1610154SDS-PAGE הכנת ג'ל
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF ריכוז
אמוניום פרסולפטסיגמאA9164SDS-PAGE הכנת ג'ל
נוגדן נגד B-III-טובוליןSigmaT8578מבחני כתם מערבי לזיהוי פעילות ביולוגית BDNF
אנטי נוגדן BDNFאלומוןAGP-021מבחני כתם מערבי לכימות BDNF
אנטי נוגדן BDNFאלומוןANT-010מבחני כתם מערבי לכימות BDNF
נוגדן אנטי ERK איתות9102מבחני כתם מערבי לזיהוי פעילות ביולוגית BDNF
נוגדן נגד pCREB (S133)איתות תאים9198מבחני כתם מערבי לזיהוי פעילות ביולוגית BDNF
נוגדן נגד pERK (T202, Y204)איתות תאים4370מבחני כתם מערבי לזיהוי פעילות ביולוגית BDNF
נוגדן נגד pTrkB (Y515)Abcamab109684בדיקות כתם מערביות לזיהוי פעילות ביולוגית BDNF
אנטיביוטיקה/אנטי-פטרייתGibco15240-062תחזוקת HEK293
ATPSigmaA26209BDNF מאגר מונוביוטינילציה
B-27 תוסףGibco17504-044תחזוקת נוירון
BicineSigmaB3876מאגר מונוביוטינילציה BDNF
BirA-GSTBPS Bioscience70031אנזים עבור BDNF AviTag מונוביוטינילציה
בקר סרום עובריHyCloneHC. SH30396.02HEK293 תחזוקה
סרום בקר אלבומיןג'קסון ImmunoResearch001-000-162רכיב שינוי מאגר BDNF, חסימת מאגר לכתם מערבי ואימונופלואורסצנטי
D-ביוטיןסיגמאB4639BDNF מאגר מונוביוטינילציה
DMEM גלוקוז גבוה בינוניGibco11965-092זריעת נוירונים
DMEM בינוניGibco11995-081HEK293 תחזוקה
Econo משפך עמודBioRad7310003רכיב מכשיר כרומטוגרפיה
EDTAMerck108418
ערכת EZ-ECLתעשיות ביולוגיות1633664זיהוי חלבון על ידי כתמים מערביים
GlutamaxGibco35050-061תחזוקת נוירון ו- HEK293
גליצרולMerck104094מאגר פליטה BDNF, מאגר ליזה לבדיקות כתם מערבי
צנטריפוגה Hettich Rotina 46R צנטריפוגה Hettichשהופסקההמשמשת לפינוי המדיום מפסולת
צנטריפוגה אוניברסלית Hettichשהופסקההמשמשת לצנטריפוגה של רכז חלבון
סרום סוסיםGibco16050-122זריעת נוירונים
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western Blot Image Acquisition
ImidazoleSigmaI55513BDNF רכיב שינוי מאגר
KClWinklerBM-1370PBS רכיב
KH2PO4Merck104873רכיב PBS
LamininInvitrogen23017-015ציפוי כיסוי לנוירונים ממודרים
מתאם צינורות לוארBioRad7323245רכיב מכשיר כרומטוגרפיה
Luminata™ Forte Western HRP SubstrateMillipore WBLUF0100זיהוי חלבון על ידי Western Blotting
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904מגיב הרכבה לבדיקות אימונופלואורסצנטיות
MyOne C1 Streptavidin חרוזים מגנטייםInvitrogen65001אימות ביוטינילציה
Na2HPO4Merck106586רכיב שינוי מאגר BDNF
NaClWinklerBM-1630PBS component, BDNF buffer
modification component NaH2PO4Merck106346BDNF buffer
modification component Neurobasal MediumGibco21103-049תחזוקת נוירון
Ni-NTA Agarose חרוזיםQiagen30210BDNF AviTag טיהור
Nikon Ti2-Eמיקרוסקופניקון להדמיה פלואורסצנטית
ממברנת ניטרוצלולוזהBioRad1620115העברת חלבון למערב ספיגה
ORCA-Flash4.0 V3 מצלמת CMOS דיגיטליתHamamatsuC13440-20CUמצלמה להדמיית אפיפלואורסצנציה
P8340 מעכב פרוטאז קוקטיילסיגמאP8340BDNF רכיב שינוי מאגר
ParaformaldehydeMerck104005מקבע לבדיקות אימונופלואורסצנטיות
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140-122תחזוקת נוירונים
כיסוי DLW354210 קורנינגפולי-די-ליזין לנוירונים ממודרים
Poli-L-LysineMilliporeP2363ציפוי כיסוי לנוירונים לא ממודרים
Poly-Prep כרומטוגרפיה עמודהBioRad7311550רכיב מכשיר כרומטוגרפיה
פוליאתילאימין 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 טרנספקציה
נקודות קוונטיות 655 סטרפטווידין מצומדInvitrogenQ10121MPמונוביוטינילציה BDNF AviTag תווית לניסויים בתאים חיים וקבועים
SaponinSigmaS4521חומר ניקוי לבדיקות אימונופלואורסצנטיות
Syldgard 184 בסיס אלסטומר סיליקוןפוארו4019862הכנת תא מיקרופלואידית
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE הכנת ג'ל
TrisWinklerBM-2000רכיב חיץ ליזה
Triton X100Merck108603חדירות תאים במבחני אימונופלואורסצנציה וכתם מערבי
טריפסין-EDTA 0.5%Gibco15400-054HEK293 מעבר
תא צנטריפוגה צנטריפוגה ציפוי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1(2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293(2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070(2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684(2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899(2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493(2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
  24. Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77(2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BDNFBDNFHEK293BirAWestern Blot

מאמרים קשורים