מוצג כאן פרוטוקול עבור זיהום Pseudomonas aeruginosa ויישום טיפול phage בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס (CF).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יישום טיפול Phage כדי לנטרל זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס
במאמר זה
סיכום
תקציר
עמידות מיקרוביאלית, תוצאה גדולה של אי-ודאות אבחונית ויתור יתר מיקרוביאלי, היא גורם מוכר יותר ויותר לזיהומים חמורים, סיבוכים, ותמותה ברחבי העולם עם השפעה עצומה על החברה שלנו ועל מערכת הבריאות. בפרט, חולים עם מערכות חיסוניות בסכנה או פתולוגיות קיימות וכרוניות מראש, כגון סיסטיק פיברוזיס (CF), נתונים לטיפולים אנטיביוטיים תכופים כדי לשלוט בזיהומים עם המראה ופיזור של מבודדים עמידים multidrug. לכן, יש צורך דחוף לטפל טיפולים חלופיים כדי לנטרל זיהומים חיידקיים. שימוש bacteriophages, האויבים הטבעיים של חיידקים, יכול להיות פתרון אפשרי. הפרוטוקול המפורט בעבודה זו מתאר את היישום של טיפול phage נגד זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה CF. עוברי דגי זברה נדבקו P. aeruginosa כדי להוכיח כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa כפי שהוא מפחית קטלניות, נטל חיידקי ותגובה חיסונית פרו דלקתית בעוברי CF.
מבוא
טיפול Phage, השימוש באויבים הטבעיים של חיידקים להילחם בזיהומים חיידקיים, הוא צובר עניין מחודש כמו עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה הופךנפוץ 1,,2. טיפול זה, המשמש במשך עשרות שנים במזרח אירופה, יכול להיחשב טיפול משלים לאנטיביוטיקה בריפוי דלקות ריאות בחולים עם CF וחלופה טיפולית אפשרית עבור חולים נגועים בחיידקים עמידים בפני כל הנוכחי בשימושבאנטיביוטיקה 2,3. היתרונות של טיפול אנטיביוטי הם bacteriophages להכפיל באתר הזיהום, בעוד אנטיביוטיקה הם מטבוליזם ומבוטלמהגוף 4,5. אכן, ניהול קוקטיילים של phages ארסי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגי זברה בוגרים(Danio rerio)מזן AB (מרכז המשאבים האירופי של דגי הזברה EZRC) נשמרים על פי הגנה בינלאומית (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU) והנחיות לאומיות (צו איטלקי 4מרץ 2014, נ' 26) על הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. תנאים סטנדרטיים מוגדרים במתקן הדגים עם 14 שעות של אור / 10 שעות מחזור כהה וטמפרטורת מים מיכל ב 28 ° C.
1. הכנת פתרונות וכלים
- הכן פתרון מניות של 50x ופתרונות עבודה של פי 1 עבור מדיום עובר E3 לגידול עוברי דגי זברה (ראה טבלה 1).
- להפוך את פתרון חסימת פיגמנטציה, כדי לחסום את פיגמנטציה העובר מ 24 שעות לאחר הפריה (24 hpf) (ראה טבלה 1).
- הכן מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות ונתונים המוצגים כאן מכונים עוברי CF שנוצרו באמצעות הזרקת cftr morpholinos כמתוארקודם לכן 10 ובצעד 5. כדי לאמת את פנוטיפ CF, המיקום הלקויה של איברים פנימיים כגון לב, כבד, ולבלב כפישתואר קודם לכן 17 (איור 1) נחשבו. תוצאות דומות הושגו במקרה של עוברי WT כפי שדווח בפרסום הקודם שלנו19.
נטל חיידקים הופחת על ידי טיפול phage בעוברי CF נגוע PAO1. יתר על כן, הערכנו את הנטל החיידקי ב 8 hpi.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בכתב יד זה, תיארנו את הפרוטוקול לבצע P. aeruginosa (PAO1) זיהום בעוברי דגי זברה ואיך ליישם טיפול phage עם קוקטייל של phages שזוהו בעבר כמסוגל להדביק PAO1 כדי לפתור את זה. השימוש bacteriophages כחלופה לטיפולים אנטיביוטיים כבר עניין גובר מאז השנים האחרונות. זה בעיקר בשל דיפוזיה של זיהומים חיידקיים עמידים לתרופות מרובות (MDR), המהווים בעיה רצינית לבריאות הציבור. כמובן, היקף העבודה הזו מוגבל ליישום של טיפול בפאג' למודל של בעלי חיים ולא לבני אדם. עם זאת, יצרנו מודל זברה סיסטיק פיברוזיס עם הזרקת מורפולינו מיקוד הג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס האיטלקית (FFC#22/2017; אסוציאציה "גלי אצ'י דלה ריטי" קסניגו ו-FFC#23/2019; האו"ם respiro בפיו Onlus La Mano tesa Onlus).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| סידן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | 10043-52-4 | |
| CsCl | סיגמא-אולדריץ' | 289329 | |
| מי מלח חוצץ פוספט של דולבקו PBS | סיגמא-אולדריץ' | D8537 | |
| אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונאט | סיגמא-אולדריץ' | 886-86-2 | שם נפוץ טריקאין |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| פלמינג/חום P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| נמס נמוך אגרוז | סיגמא-אולדריץ' | CAS 9012-36-6 | |
| מגנזיום גופרתי | סיגמא-אולדריץ' | 7487-88-9 | |
| מתיל כחול | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| מחטי מיקרו-הזרקה | הרווארד | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | שתוכננו על ידי החוקר | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | 7447-40-7 | |
| פרונאז | סיגמא-אולדריץ' | 9036-06-0 | |
| נתרן כלורי מגיב ACS, ≥ 99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| סטריאומיקרוסקופ | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| טריפטון | אוקסואיד | LP0042B | |
| תמצית שמרים | אוקסואיד | LP0021B | |
| Z-MOLDS מיקרו-הזרקה | Word מכשירים מדויקים |
מקורות
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
