מאמר שיטה

הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

DOI:

10.3791/61285

⸱

13 ביוני 2020

 ,  ,  ,  , 
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science, University of Science & Technology (UST)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצגות שיטות כדי להבין השפעות אנטי סרטניות של לקטובצילוס ללא תאי supernatant (LCFS). קווי תאים סרטניים המעי הגס מראים מקרי מוות של תאים כאשר מטופלים עם LCFS בתרבויות תלת-ממד. תהליך יצירת כדוריות יכול להיות ממוטב בהתאם לפיגומים ושיטות הניתוח המוצגות שימושיות להערכת מסלולי האיתות המעורבים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להערכת מקרי מוות של תאים סרטניים בפרואידים תלת ממדיים (תלת-ממדיים) של תאים סרטניים רב תאיים באמצעות מזונות-על מתרבית תאי התסיסה לקטובצילוס , הנחשבים לתרבויות פרוביוטיקה. השימוש בתרביות תלת-ממד לבדיקת תחליב-על נטול תאי לקטובצילוס (LCFS) הם אפשרות טובה יותר מבדיקה במונו-שכבתיים דו-ממדיים, במיוחד לאור העובדה שתסיסה של L. יכולה לייצר השפעות אנטי-סרטניות במעיים. L. תסיסה supernatant זוהה להחזיק השפעות אנטי-שגשוג מוגבר נגד מספר תאים סרטן המעי הגס (CRC) בתנאי תרבית 3D. מעניין, תופעות אלה היו קשורים מאוד למודל התרבות, הדגמת היכולת הבולטת של L. תסיסה לגרום למוות תאים סרטניים. כדוריות יציבות נוצרו מ- CRCs מגוונים (תאים סרטניים המעי הגס) באמצעות הפרוטוקול המוצג להלן. פרוטוקול זה של יצירת כדורי תלת-ממדי הוא חיסכון בזמן וחסכוני. מערכת זו פותחה כדי לחקור בקלות את ההשפעות נגד סרטן של LCFS בסוגים מרובים של כדורי CRC. כצפוי, כדורי CRC שטופלו ב- LCFS גרמו מאוד למוות תאי במהלך הניסוי וביעו סמנים מולקולריים ספציפיים אפופטוזיס כפי שניתחו על ידי qRT-PCR, סופג מערבי, וניתוח FACS. לכן, שיטה זו היא בעלת ערך לחקר הכדאיות של התאים והערכת היעילות של תרופות נגד סרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוביוטיקה הם המיקרואורגניזמים היתרון ביותר במעיים שמשפר את ההומוסטזיס החיסוני ואת חילוף החומרים שלהאנרגיה המארחת 1. פרוביוטיקה מ לקטובצילוס וביפידובקטריום הם המתקדמים ביותר מסוגו שנמצאו במעי2,3. חקירות קודמות הראו כי לקטובצילוס יש השפעות מעכבות ואנטי-פרוliferative על מספר סוגי סרטן, כולל סרטן המעי הגס4. יתר על כן, פרוביוטיקה למנוע מחלות מעי דלקתיות, מחלת קרוהן, קוליטיס כיבית5,6. עם זאת, רוב המחקרים עם פרוביוטיקה בוצעו דו מימדי (2D) monolayers שגדלים על משטחים מוצקים.

מערכות תרבית מלאכותית חסרות תכונות סביבתיות, שאינן טבעיות לתאים סרטניים. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכות תרבות תלת מימדיות (3D) פותחו7,8. תאים סרטניים בתלת-ממד מראים שיפורים במונחים של מנגנונים ביולוגיים בסיסיים, כגון כדאיות תאים, התפשטות, מורפולוגיה, תקשורת תא-תאים, רגישות לתרופות, ורלוונטיות vivo9,10. יתר על כן, כדורי עשויים מסוגים רב תאיים של סרטן המעי הגס ותלויים באינטראקציות בין תאים לבין המטריצה החוץ תאית (ECM)11. המחקר הקודם שלנו דיווח כי פרוביוטיקה תאים ללא תאים supernatant (CFS) המיוצר באמצעות תסיסה לקטובצילוס הראה השפעות אנטי סרטניות על תרביות תלת-ממדיות של סרטן המעי הגס (CRC) תאים12. הצענו כי CFS היא אסטרטגיה חלופית מתאימה לבדיקת השפעות פרוביוטיות על כדורי תלת מימד12.

כאן, אנו מציגים גישה שיכולה להכיל סוגים רב תאיים של סרטן המעי הגס 3D לניתוח ההשפעות הטיפוליות של supernatant ללא תאים פרוביוטיים (CFS) על מספר מערכות חיקוי סרטן המעי הגס 3D. שיטה זו מספקת אמצעי לניתוח של השפעות פרוביוטיקה ואנטי סרטן הקשורות במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרביות תאים חיידקיים והכנת לבצילוס סופרנטנט ללא תאים (LCFS)

הערה: שלבים 1.2 – 1.9 מתבצעים בחדר אנאירובי.

  1. הכן צלחת אגר MRS ומרק המכיל L-ציסטאין ולחטא על ידי autoclaving.
  2. לפני הדגירה צלחת אגר MRS בתא אנאירובי H2 מתוחזק ב 37 °C (50 °F) עם חמצן 20 ppm.
  3. להפשיר ציר חיידקי לקטובצילוס ולחסן את צלחת אגר עם תרבית החיידקים(איור 1A (i).
  4. דגירה חיידקים במשך 2 - 3 ימים בתא אנאירובי H2 ב 37 °C (7 °F) ו 20 ppm חמצן עד מושבות חיידקים בודדים מתקבלים.
  5. לשטוף ולייבש את צינור תרבות אנרובי סוג Hungate. תאט-סטוב את צינור התרבות ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. ואז לדגור על הצינור בתא אנאירובי H2 ב 37 °C (7 °F) ו 20 ppm חמצן כדי להסיר חמצן.
  7. מניחים 2 - 3 מ"ל של מרק MRS לתוך הצינור. לאטום את הצינור עם פקק גומי בוטיל ולברג את הכובע.
  8. להשיג מושבה אחת עם לולאה למקם אותו לתוך צינור תרבות 1.5 מ"ל עם 500 μL של 1x PBS. (איור 1A (ii).
  9. השעיית המושבה באמצעות מזרק של 1 מ"ל (איור 1A (iii). לעשות זאת על ידי החדרת המחט של מזרק 1 mL במרכז מכסה הצינור, שאיפה המושבה המושעה ולאחר מכן resuspending אותו בחזרה למדיית מרק MRS. (איור 1A (iv).
  10. לדגור על מדיית מרק MRS באינקובטור שייקר במשך יומיים (37 °C (37 °C), 5% CO2, 200 סל"ד).
  11. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) באמצעות ספקטרופוטומטר לניטור עקומות צמיחה חיידקיות עד שהספיגה ב- OD620 תגיע ל-2.0.
  12. הפרד את כדורי החיידקים ואת המדיה המותנית על ידי צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות. לשטוף את כדורי חיידקים שנאספו עם 1x PBS ו resuspend ב 4 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי. אין לכלול אנטיביוטיקה במדיום.
  13. לשמור על כדורי חיידקים ב RPMI ודגרה באינקובטור שייקר עבור 4 שעות ב 37 °C (5% CO2 במהירות של 100 סל"ד.
  14. להכנת supernatant פרוביוטיקה, להסיר את הכדור החיידקי באמצעות צנטריפוגה ב 1000 x גרם, במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). מסנן סטרילי את supernatant התאושש באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב −80 °C (50 °F) עד השימוש.

2. דור כדורי

  1. הכנת קווי תאים סרטניים המעי הגס
    1. לגדל DLD-1, HT-29, וקווי תא WiDr כמו monolayers עד 70-80% conהשפעה ולדגירה את הצלחת ב 37 °C בחממה2 CO 5% (בינוני צמיחה: RPMI המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין).
    2. עבור תאים הגדלים בצלחת פטרי 100 מ"מ, לשטוף את הצלחת פעמיים עם 4 מ"ל של 1x PBS. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודגרה צלחת פטרי במשך 2 דקות ב 37 °C בחממה5% CO 2 כדי לנתק את התאים.
    3. לאחר הדגירה, לבדוק את ניתוק התא תחת מיקרוסקופ ולנטרל טריפסין-EDTA עם 5 מ"ל של מדיום צמיחה.
    4. העבר את התאים המנותקים לצינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x g.
    5. השלך את supernatant ו resuspend בעדינות עם 3 מ"ל של מדיה צמיחה.
    6. לספור את התאים עם כחול טריפן כדי לקבוע תאים קיימא באמצעות hemocytometer. (איור 1B (i))
  2. היווצרות כדורית
    1. בצינור חרוט 15 מ"ל, לדלל את התאים מ 2.1.5 כדי להשיג 1 - 2 x 105 תאים / מ"ל (איור 1B (ii))
    2. הוסף ריכוז סופי של 0.6% מתילצלולוז להשעיית התא והעבר את התאים המדוללים למאגר סטרילי.
      הערה: עבור כל קו תא, יש לצית את כמות המתילצלולוז הדרושה ולהיקבע בהתאם.
    3. השתמש pipette multichannel כדי לחלק 200 μL של תאים לכל באר של חיבור אולטרה נמוך 96-היטב מיקרו-לוח תחתון עגול. (איור 1B (iii))
    4. לדגור את הצלחת ב 37 °C בחממה5% CO 2 עבור 24 - 36 שעות.
    5. לאחר 24 - 36 שעות, התבונן בלוח תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח היווצרות כדורית.

3. טיפול בתאי סרטן המעי הגס תלת-ממדיים עם LCFS

  1. צור כדוריות כמתואר בשלבים 2 ו -3.
  2. לפני ביצוע הטיפול LCFS, להפשיר את LCFS קפוא בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 - 20 דקות.
  3. לחסן את פתרון מניית LCFS למדיום צמיחה. לדלל באופן סדרתי ל 25%, 12.5%, ו 6% במדיום הצמיחה (כלומר, 25% LCFS = 150 μL של בינוני צמיחה + 50 μL של LCFS).
  4. להוציא את צלחת תרבית התא המכיל כדורי מן האינקובטור ולהסיר כמה שיותר של מדיום הצמיחה ככל האפשר מכל באר באמצעות 200 μL pipette.
  5. הוסף את מדיה הצמיחה עם LCFS על התאים ודגרה ב 37 °C בחממהCO 2 5% עבור 24 - 48 שעות.
    הערה: אמצעי האחסון שישמש יהיה תלוי בגודל הצלחת כדלקמן: 2 מ"ל עבור לוחות תרבית תאים 6-well; 200 μL עבור 96-טוב לוחות תרבית התא.

4. כדאיות תאים עבור כדורי

  1. הכן 8 - 10 כדורי סרטן המעי הגס שטופלו ב- LCFS בלוחות רב-באריים אטומים (בוצעו 48 שעות לאחר טיפול LCFS).
  2. להפשיר את ריאגנט הכדאיות התא (ראה טבלה של חומרים) ב 4 °C (75 °F) ללילה.
  3. יש לתעד את ריאגנט הכדאיות של התא לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  4. לפני ביצוע ההסתה, להסיר 50% של מדיה הצמיחה מן spheroids.
  5. הוסף 100 μL של ריאגנט הכדאיות התא לכל באר.
    הערה: אמצעי האחסון שישמש תלוי בגודל הצלחת כדלקמן: 100 μL עבור לוחות תרבית תאים 96-well.
  6. מערבבים את ריאגנט במרץ במשך 5 דקות כדי לקדם תמוגה התא.
  7. דגירה במשך 30 דקות – 2 שעות ב 37 °C (7 °F).
  8. תקליט את ההארה.

5. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותי בזמן אמת עבור כדוריות

  1. עבור כל תנאי, להכין 10 - 15 כדוריות בצינור 2 מ"ל צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x גרם.
  2. השליכו את הסופרנט ושטפו את כדוריות פעמיים ב-1 מ"ל של PBS 1x קר כקרח.
    הערה: הימנע צנטריפוגה, תן כדורי להתיישב.
  3. שאפו כמה שיותר PBS 1x ולבודד RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית.
  4. סנתז cDNA מ- 1 מיקרוגרם של RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  5. הכן תערובת ראשית כדי להפעיל את כל הדוגמאות במשולש (ראה טבלה 1 וטבלה 2).
  6. בצע את ההגברה ב 20 μL של תערובת תבנית מאסטר לתוך כל צלחת qPCR היטב.
  7. מערבבים תגובות היטב ומסתובבים במידת הצורך.
  8. הפעל דוגמאות בהתאם להמלצות יצרן המכשירים (טבלה 3).

6. סופג מערבי מפרואידים

הערה: בעת איסוף כדוריות, להשתמש 200 μL pipette לחתוך את סוף הטיפים כדי למנוע הפרעה למבנה שלהם.

  1. עבור כל תנאי, להכין 30 - 40 כדוריות בצינור 2 מ"ל.
  2. מניחים את הצינור על קרח ולתת את כדורי להתיישב לתחתית צינור 2 מ"ל.
  3. להשליך את supernatant ולשטוף את כדורי פעמיים 1 מ"ל קר כקרח 1x PBS
    הערה: הימנע צנטריפוגה, תן כדורי להתיישב.
  4. שאפו כמה שיותר PBS 1x ולהוסיף חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז (10 כדורי = 30 μL של חיץ RIPA).
  5. ללקק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולבצע sonication עבור 30 s עם 30 s של מנוחה על קרח במשך 10 מחזורים.
  6. צנטריפוגות החלבון lysates ב 15000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
  7. קבעו את ריכוז החלבון עבור כל תא ליסייט.
  8. לפני הטעינה, להרתיח כל תא lysate במאגר מדגם ב 100 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
  9. לטעון כמויות שוות של חלבון לתוך הבארות של ג'ל SDS-PAGE ולהפעיל את הג'ל עבור 1 - 2 שעות ב 100 V.
  10. מעבירים את החלבון מהג'ל לקרום PVDF.
  11. לאחר ההעברה, לחסום את הממברנה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר באמצעות חוצץ חסימה (5% חלב רזה + TBS עם 0.05% Tween-20).
  12. לדגור על הממברנה עם 1:1,000 דילול של נוגדן ראשוני (טבלה 4) ב 1x TBST עם 5% חוצץ BSA ב 4 °C (5 °F) לילה.
  13. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, 15 דקות עבור כל לשטוף.
  14. לדגור על הממברנה עם 1:2,500 דילול של נוגדן משני במאגר חסימה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות (ראה טבלה של חומרים).
  15. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST, 15 דקות עבור כל לשטוף.
  16. הכן את הממברנה לגילוי HRP עם מצע כימותרפי.
  17. לרכוש תמונות מלימינסנט.

7. פרופיליום יודיד (PI) כתמים של כדורי

  1. הכן 5-10 כדוריות כמתואר בשלב 4.1 והנח את כדוריות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
  2. לדלל 1 מ"ג / מ"ל מלאי של PI 1:100 ב 1x PBS.
  3. מוציאים 50% מהמדיום מכל באר של צלחת 96-well.
  4. הוסף 100 μL של פתרון PI לכל באר ומניחים את הבארות באינקובטור ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 10 - 15 דקות.
  5. לשטוף את פתרון PI עם PBS 1x.
  6. הוסף 200 μL של מדיום צמיחה ולצלם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות תמונה J כדי לקבל את ספירת הכדאיות של הכדוריד.

8. ניתוח FACS של כדוריות

  1. ליצור כדוריות כמתואר בעבר.
  2. עבור כל תנאי, להכין 30 - 40 כדוריות בצינור FACS וצנטריפוגה במשך 3 דקות ב 400 x g ו RT.
  3. שאפו את supernatant ולשטוף את כדוריות ב 3 מ"ל של 1x PBS, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F).
  4. לשאוף supernatant ולהוסיף 200 μL של 0.25% טריפסין-EDTA, ולאחר מכן דגירה ב RT במשך 2 -3 דקות.
    הערה: זמן הדגירה תלוי בגודל הכדור וסוג התא.
  5. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS ונתק בעדינות את כדורי הכדוריד באמצעות פיפטה של 200 μL.
  6. צנטריפוגות התאים מנותקים ב 400 x g ו 4 °C (55 °F) במשך 3 דקות.
    הערה: מאגר FACS = 1x PBS + 2.5% FBS, מסונן באמצעות מסנן עליון של 0.22 מיקרומטר.
  7. השלך את supernatant ולהוסיף 7-AAD / Annexin V ריאגנט (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/מדגם).
  8. מערבולת בעדינות את התאים ודגרה במשך 13 - 30 דקות ב RT בחושך.
  9. הוסף 500 μL של מאגר FACS וסנן את התאים באמצעות מבחנות פוליסטירן חרוט כדי להסיר תאים צבירה.
  10. צנטריפוגה ב 400 x g ו 4 °C (5 °F) במשך 3 דקות.
  11. הוסף 500 μL של מאגר כריכת Annexin V לכל צינור ו resuspend.
  12. לנתח באמצעות cytometer זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את הפרוטוקול של קבלת כדוריות מקווי תאים שונים של סרטן המעי הגס. תוספי עם methylcellulose נדרש כדי ליצור כדוריות. אנו מציגים גם שיטה של הכנת LCFS ולהציג מודל כדי ללמוד את המתאם בין פרוביוטיקה וסרטן המעי הגס. תצורה כדורית ופרוטוקולי הכנה LCFS מודאים באופן סכמטי באיור 1A,B. כפי שניתן לראות באיור 2A, ריכוז מתיל צלולוז של 0.6% הופך את התאים הסרטניים לפרואידים קומפקטיים. תוצאה זו מצביעה על כך שספרואידים יכולים להיווצר ממספר סוגים של סרטן המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microenvironment הרקמה, כולל תאים שכנים ואת מטריצה חוץ תאית (ECM), הוא בסיסי לייצור רקמות חיוני בשליטה על צמיחת התא ופיתוחרקמות 13. עם זאת, לתרבויות 2D יש מספר חסרונות, כגון הפרעה של אינטראקציות תאיות, כמו גם שינויים במורפולוגיה של תאים, סביבות חוץ תאיות, ואת הגישה של חטיבה14. מערכות תרבית תאים תלת-ממדית נחקרו בקפדנות כדי להתרבות טוב יותר באפקטים של vivo, והוכחו כמערכות מדויקות יותר לבדיקות סרטן במבחנה15,16. יש צורך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילויים פיננסיים רלוונטיים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי "קביעת תקני מדידה לכימיה וקרינה", מספר המענק KRISS-2020-GP2020-0003, ו"פיתוח תקני מדידה וטכנולוגיה לביו-חומרים והתכנסות רפואית", מספר המענק KRISS-2020-GP2020-0004, במימון מכון המחקר של קוריאה לתקנים ומדעים. מחקר זה נתמך גם על ידי משרד המדע ו- ICT (MSIT), קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF-2019M3A9F3065868), משרד הבריאות והרווחה (MOHW), המכון לפיתוח תעשיית הבריאות בקוריאה (KHIDI, HI20C0558), משרד המסחר, התעשייה והאנרגיה (MOTIE) והמכון להערכה של קוריאה לטכנולוגיה תעשייתית (KEIT, 20009350). תעודת זהות ORCID (הי מין יו: 0000-0002-5951-2137; דוקג'ין קאנג: 0000-0002-5924-9674; סליל קים: 0000-0003-3465-7118; ג'ו-און לי: 0000-0002-2495-1439; ג'ינה לי: 0000-0002-3661-3701). אנו מודים לפארק צ'אנג וו על הסיוע בניסויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות

10% Mini-PROTEAN TGX ג'ל חלבון טרומי, 15 בארות, 15 ומיקרו; l		Biorad4561036חבילה של 10
יישומי ביוסיסטמס מיקרו אמפר דבק אופטי סרטתרמו פישר סיינטיפיק4311971100 מכסה
10x מאגר העברהאינטרוןIBS-BT031A1 ליטר
10X טריס-גליצין (W / SDS)אינטרוןIBS-BT0141 ליטר
אקסיג'ן 2.0 מ"ל MaxyClear Snaplock צינור מיקרוצנטריפוגה, פוליפרופילן, שקוף, לא סטרילי, 500 צינורות / חבילה, 10 חבילות/מארזקורנינגSCT-200-C500 צינורות/חבילה, 10 חבילות/מארז
BD Difco Bacto AgarBD214010500 גרם
BD Difco Lactobacilli MRS מרקBDDF0881-17-5500 גרם
CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תאים תלת מימדייםPromegaG9681100μ l/assay בצלחות של 96 בארות
קוקטייל מעכב פרוטאז שלםסיגמא-אולדריץ'11697498001בקבוקון של 20 טבליות
קורנינג פוספט-חוצץ מלח, 1X ללא סידן ומגנזיום, PH 7.4 ופלוסמן; 0.1קורנינג21-040-CV500 מ"ל
EMD Millipore Immobilon-P PVDF ממברנות העברתפישר ScientificIPVH0001026.5 ס"מ x 3.75 מ 'גליל; גודל נקבוביות: 0.45um
Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול, עם מסננת תאים מכסה הצמדקורנינג35223525/חבילה, 500/מארז
סרום בקר עוברי, מוסמך, מקורו בארה"בThermo Fisher Scientific16000044500 מ"ל
iScript cDNA ערכת סינתזה, 25 x 20 ומיקרו; l rxns #1708890Biorad170889025 x 20 ומיקרו; L rxns
iTaq אוניברסלי SYBR ירוק סופרמיקסBiorad17251215 x 1 מ"ל
לקטובצילוס פרמנטוםאוסף קוריאני לתרביות סוגKCTC 3112
L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראטסיגמא-אולדריץ'C6852-25G25 גרם
מתיל צלולוז (3500-5600mPa· s, 2% במים ב-20° C)TCIM0185500 גרם
מיקרואמפר אופטי מהיר 96 בארות צלחת תגובה עם ברקוד, 0.1 מ"למערכות ביולוגיות יישומיות434690620 צלחות
יחידת מסנן מזרק Millex-GS, 0.22 ומיקרו; m, אסטרי תאית מעורבים, 33 מ"מ, אתילן אוקסיד מעוקרMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V ערכת זיהוי אפופטוזיס עם 7-AADBiolegend640934100 בדיקות
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 מ"ל
Propidium IodideIntrogenP1304MP100 מ"ג
RIPA מאגר ליזה ומיצויתרמו פישר סיינטיפיק89901250 מ"ל
RNeasy מיני קיט (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 מ"ל
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםתרמו פישר סיינטיפיק25200056100 מ"ל
<חזק>שם חומרים/ציוד/תוכנה<חזק>חברהמספר קטלוגיהערות/תיאור
anti - p-Iκ B&אלפא; (ב-9)סנטה קרוזsc-8404200 ומיקרו; גרם/מ"ל
אנטי-BclxL (H-5)סנטה קרוזSC-8392200 ומיקרו; גרם/מ"ל
אנטי-PARP 1 (C2-10)סנטה קרוזSC-5364350 ומיקרו; l מיימת
אנטי-&בטא;-אקטין (C4)סנטה קרוזsc-47778200 µ g/mL
BD FACSverseBD Biosciencesסן דייגו, קליפורניה, ארה"ב
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 אינקובטורתרמו פישרHERAcell 150i
צינור חרוטי 15 מ"לSPL50015
צינור חרוטי 50 מ"לSPL50050
Corning Costar חיבור נמוך במיוחד צלחת באר מרובהסיגמא-אולדריץ'CLS7007
קורנינג קוסטאר חיבור נמוך במיוחד צלחתבאר מרובה סיגמא-אולדריץ'CLS3471
Costar 50 מ"ל מאגרי ריאגנטים, 5/שקית, סטריליCostar4870
שקופיות תא ספירת תאים רוזנתThermofisherC10228
רוזנת II FL מונה תאים אוטומטיinvitrogen
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, תוכנתEppendorf3122000051
TreeStarAshland, OR, ארה"ב
עז נגד עכבר IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621.5 מ"ל
IgG נגד ארנב עיזים (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 מ"ל
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmטוקיו, יפן
דגירהשל מעבדת שייקר מלווהSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,Fujifilmטוקיו, יפן
צפיפות אופטית (OD) LAMBDA UV/VIS ספקטרופוטומטריםפרקין אלמרוולת'אם, MA, ארה"ב
מיקרוסקופ ניגודיות פאזהאולימפוסטוקיו, יפן
צינור מיקרוצנטריפוגה SPL SPL 1.5 מ"לSPL60015
SPL מאגרים רב ערוציים, 12-CHS, PS, סטריליSPL21012
מערכתPCR בזמן אמת StepOnePlusתרמו פישר סיינטיפיקוולת'ם, MA, ארה"ב
מעבדי נוזל אולטרסאונד תא ויברהSONICS-vibra תאVC 505500 וואט מעבד קולי
ויניל תא אנאירובימוצרי מעבדה
AMQAF1000FlowJo 8 ערוצים COY

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557(2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886(2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016(2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711(2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LactobacillusWestern BlottingqRT PCR

מאמרים קשורים