Method Article

ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול להמציא מכשיר מבוסס נייר להעשרת האפקטיבית והבידוד של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות ואקסוזומים הן קרומי שלפוחיות קטנות שפורסמו לסביבת החילוץ והופץ ברחבי הגוף. מכיוון שהם מכילים שונים תא הורים biomolecules כגון DNA, mRNA, miRNA, חלבונים, ושומנים, שלהם העשרה ובידוד הם צעדים קריטיים לניצול שלהם כמו סמנים פוטנציאליים יישומים קליניים. עם זאת, שיטות בידוד קונבנציונאלי (למשל, הטיות) גורמות לאובדן משמעותי ונזק למיקרושלפוחיות ואקסוזומים. שיטות אלה דורשות גם שלבים חוזרים ונשנים מרובים של העברת החומרים, טעינה, ובזבוז של ריאגנטים. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת לעיצוב התקן המבוסס על נייר אוריגמי (Exo-PAD) המיועדת להעשרה ולבידוד יעילים של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים באופן פשוט. העיצוב הייחודי של ה-Exo-PAD, המורכב משכבות רב-אקורדיון הכוללות שכבות משולבות משולבות עם שטחים לדוגמה מתכנסת, משולבים עם טכניקת הקיטוב של ריכוז היונים, ובכך מאפשרת לעשרת העשרה של המיקרושלפוחיות והאקסוזומים על שכבות ספציפיות. כמו-כן, המיקרושלפוחיות והאקסוזומים המועשרת מבודדים על-ידי התגלגלות בפשטות של ה-Exo-PAD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות ואקסוזומים הן ממברנות קטנים מדידת מדידה 0.2-1 מיקרומטר ו 30-200 ננומטר, בהתאמה. הם מופרשים לתוך סביבת החילוץ על ידי כמה סוגי תאים שונים1,2,3,4,5. הם מכילים מידע תא הורים בצורה של תת קבוצות של DNA, mrna, mirna, חלבונים, ושומנים, ולזרום ברחבי הגוף באמצעות נוזלי גוף שונים כגון סרום, פלזמה, שתן, נוזל שדרתי, נוזל שפיר, ורוק6,7,8,9. לכן, טכניקות לבידוד יעיל של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים מנוזלים ביולוגיים יכולים לספק הזדמנויות נרחבות בתחומים של אבחון, פרוגנוזה, ניטור בזמן אמת של מחלות, כמו גם בפיתוח של therapeutics חדש.

עם זאת, שיטת הבידוד המקובלת למיקרו-שלפוחית ואקסוזומים המבוססת על הארכה היא זמן רב וגורמת לאובדן וזיהום משמעותיים של המדגם. זה בגלל שהוא כרוך מספר pipetting מסורבלת וטעינה שלבים ומהשליך של ריאגנטים שונים עם חוזר ונשנה5,6,10,11,12. יתר על כן, את המתח להטות גבוה הנגרמת על ידי מעקב (~ 100,000 x g) יכול לגרום לפירוק הפיזי של מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים, מניב שיעורי התאוששות גרועה (5-כ 23%)6,13,14. לכן, יש לפתח טכניקת בידוד יעילה ובעלת משקל למיקרו-שלפוחיות ואקסוזומים כדי להפחית את הנזק וההפסד, ובכך להשיג שיעורי התאוששות גבוהים יותר.

התקן המבוסס על נייר אוריגמי (Exo-PAD) פותח לבידוד פשוט, עדין ויעיל מאוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים6. העיצוב של ה-Exo-PAD הוא נייר רב-מקופל, עם שטחים לדוגמה המחוברים באופן סדרתי היורדים בהדרגה בקוטר. טכניקת ההפולריזציה (הקאמרי), שהיא תופעה ננו-אלקטרוקינטית הטעונה בbiomolecules, משולבת בעיצוב ייחודי זה. השימוש ב-Exo-PAD הביא להעשרת העשרה של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים בשכבות מסוימות ובבידוד שלהם על ידי התפתחות המכשיר. מאמר זה מתאר את ה-Exo-PAD בפירוט, החל מייצור ההתקן ומהפעולה הכוללת לניתוח השימוש בו, כדי להמחיש את השיטה ולהציג את תוצאות הנציגים6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור התקנים

  1. הגדר את האזור שיודפס על נייר באמצעות תוכנת מדפסת (טבלת חומרים).
    הערה: העיצוב כולל 12 שכבות בדוגמת שעווה שבהן הקטרים של האזורים העגולים מעוגלים בהדרגה ממרחק של 5 מ"מ עד 2 מ"מ (איור 1A).
  2. הדפס שעווה הידרופובי על האזורים המיועדים משני צידי הנייר הצלולוזה (טבלת חומרים) באמצעות מדפסת שעווה מסחרית (לוח חומרים) (איור 1b).
  3. מניחים את נייר השעווה מודפס בתנור מעבדה עבור 80 s ב 120 ° c.
    הערה: שלב זה מאפשר לשעווה להגיע לתוך הנייר באמצעות הזרמה תרמית של השעווה המודפסת. בעזרת פרוטוקול דגירה זה, הרזולוציה של התבנית היא ~ 2 מ"מ. לפיכך, להיזהר לא להדפיס דפוסים של פחות מ 2 מ"מ. אחרת הדפוסים ייחסמו על ידי השעווה.
  4. חותכים את נייר שעווה מודפס עם חותך כדי ליצור התקנים בודדים (איור 1C).
  5. טיפה 5 μL ו-2 μL של ממברנה בררנית (g., Nafion; רשימת חומרים) על האזורים לדוגמה בשכבות הימניות והימניות ביותר, בהתאמה (איור 1D).
  6. מניחים את השכבות מצופות עם קרום permselective על צלחת חם ב 70 ° c עבור 30 דקות כדי להתאדות את המסת קרום permselective.
  7. אטום את המשטח החיצוני ביותר של השכבה מצופה מול פתרון מאגר עם נייר רגיש ללחץ, משאיר חור קטן.
  8. מקפלים את המכשיר בודד מודפס (כלומר, Exo-PAD) הלוך ושוב לאורך הקווים הלבנים.
    הערה: על-ידי קיפול ההתקן, כל האזורים לדוגמה הופכים למחוברים בעדינות (איור 1E). עיצוב ממיר זה מתמקד בקווי השדה החשמליים כאשר המתח מוחל על הזרם הקאמרי, ומקבל ריכוז אינטנסיבי יותר של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים.

2. העשרה והתמקדות מרחבית של שלפוחיות ואקזומים באמצעות ריכוז הקיטוב

  1. טעינת 15 μL של המיקרו-שלפוחית ומדגם אקסוזום (~ 3 x 10/11 חלקיקים/mL ב-0.1 x פוספט באגירה מלוחים [PBS] עם 0.05% רצף 20) באזורים לדוגמה המתכנסת על ידי ליטוף והמתן כמה שניות כדי להבטיח הרטבה מלאה של כל האזורים לדוגמה (איור 1f).
  2. מניחים שני חדרי אקריליק בשני הקצוות של Exo-PAD ולהדק את Exo-PAD באופן מאובטח עם קטעי אוגדן קטנים כדי למנוע התפתחות (איור 1G).
  3. ממלאים את התאים עם 110 μL של 0.1 x PBS ולהוסיף שני אלקטרודות Ag/AgCl (איור 1H).
  4. החלת 30 וולט על אלקטרודות עבור 20 דקות באמצעות מערכת מדידה מקור מתח נוכחי (טבלת חומרים).
    הערה: המתח המוחל יוצר את תופעת הקאמרי ולכן מקדם את המיקרו-שלפוחית והאקסוזומים בשכבות 8 ו -9 של ה-Exo-PAD.

3. בידוד מיקרושלפוחיות ואקסוזומים מועשרים

  1. הפרד את Exo-PAD מקופל מתאי אקריליק ולגלות את המכשיר כדי לבודד את המיקרושלפוחיות מועשר ואקסוזומים מן השכבות האחרות (איור 1I).
  2. החוצה את האזורים לדוגמה בשכבות 8 ו -9, כאשר המיקרושלפוחיות והאקסוזומים מועשרים, לניתוח במורד הזרם (איור 1J).

4. סריקת אנליזה של מיקרוסקופ אלקטרוני

  1. תקן את המיקרושלפוחיות המועשרת והאקסוזומים על-ידי התעשרת את האזורים הנוקבים ב-2.5% גלוטאלדהיד בשנת 0.1 m נתרן קא, מאגר של 1 h ו-1% אוסמיום tetroxide בשנת 0.1 M נתרן קאבאיחור 1 h.
    התראה: אוסממיום tetroxide הוא כימיקל רעיל ומסוכן מאוד. בגלל אוסמיום tetroxide יכול לחדור לפלסטיק, זה חייב להיות מאוחסן בזכוכית. כל טיפול של אוסממיום tetroxide חייב להתבצע בתוך מכסה כימי עם כפפות ניטריל.
  2. ביטול המיקרושלפוחיות ואקסוזומים קבועים עם ציונים עולים של 200 הוכחה אתנול (כלומר, 50%, 70%, 90%, ו-100%) עבור 30 דקות כל אחד.
  3. יבש כימי את המדגם על ידי הכשרת הבית בתוך הdesiccator למשך 30 דקות.
    התראה: הג הוא כימיקל דליק ורגיש לחות. זה חייב להיות מאוחסן באזור יבש ומאוורר הרחק ממקורות ההצתה.
  4. מעיל את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים מיובשים לחלוטין עם זהב/פלדיום (~ 20 ננומטר) באמצעות התזה ולכידת סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תמונות.

5. ניתוח מעקב ננו-חלקיק

  1. להכניס את האזורים לדוגמה בשכבות 6, 8, ו 10 באמצעות אגרוף ביופסיה לאחר 20 דקות של פעולת התקן.
  2. הישאב כל אזור מנוקב בתמיסה מאגר (0.1 x PBS עם 0.01% רצף 20).
  3. מערבולת עבור 10 דקות ו צנטריפוגה עבור 30 s ב 6,000 סל ד כדי להשעות מחדש את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים מועשר.
  4. הסירו את האזורים הנוקבים מהפתרון ומדדו את ריכוז המיקרושלפוחית והאקסוזומים באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיק (שולחן החומרים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זמן הפעולה חייב להיות מיטבי כדי להשיג את התשואה המקסימלית של המיקרושלפוחיות והאקסוזומים המועשרת. לא מספיק זמן אינו מאפשר העברה מספקת של המיקרו-שלפוחית והאקסוזומים, אשר מפחית את ההעשרה, בעוד זמן מופרז מתדרדר המיקוד המרחבי ולכן מפזר את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים. לפיכך, באמצעות שלב האופטימיזציה הזמן, הגורם המקסימלי הריכוז המרבי של מיקרולושלפוחית ואקסוזומים והמיקום הסופי בו ניתן לזהות את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים. כדי למצוא את המיקום הסופי של המיקרוסקופים והאקסוזומים, הגירה בזמן של שימוש בשיטת המיקרו-שלפוחיות ואקסוזומים המסו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות Exo-PAD שימש בהצלחה עבור העשרה ובידוד של מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים, מספר נקודות קריטיות צריך להיחשב בזהירות: 1) הדגירה של התנור זמן וטמפרטורה במהלך הכנת המכשיר, 2) זמן עיבוד, 3) יישום של מתח עם מספרי שכבות משתנות, שטח לדוגמה קטרים, ו 4) הישימות

זמן הדגירה והטמפרטורה הניתנים בפרוטוקול הם תנאים ממוטבים כדי להמציא מכשיר אמין. זמני דגירה ארוכים יותר או טמפרטורה גבוהה יותר עלול לגרום עיוות של העיצוב מתכנסת עקב הזרמה מוגזמת של שעווה מודפסת. הדבר ימנע את היווצרות קווי השדה החשמליים המתמקדים ובכ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה, גרנט NRF-2018R1D1A09084044. י. ה. לי היה נתמך על ידי מלגת מחקר מאוניברסיטת Kwangwoon בשנת 2019. הייארין קים נתמכת על-ידי תוכנית הפיתוח של מומחי התעשייה של המשרד הקוריאני למסחר, תעשייה ואנרגיה (MOTIE), מופעל על ידי מכון קוריאה לקידום טכנולוגיה (KIAT) (לא. P0002397, תוכנית HRD להתכנסות תעשייתית של התקנים חכמים לבישים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אלקטרודות Ag/AgClA-M Systems, Inc.531500אלבומין בקוטר 0.15 אינץ'
מסרום בקר (BSA), Alexa Fluor 594 מצומדThermo Fisher ScientificA13101BSA מצומד עם Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 ננומטר)
מאגר קרבונט-ביקרבונטSigma-AldrichC3041-50CAPמאגר קרבונט
תוכנת CorelDraw (Coral Co., קנדה)מדפסת Corel Corporationלהגדרת הדפסת שעווה אזור
ColorQube 8870שעווהשל Xerox Corporation
נייר כרומטוגרפיה דרגה 1Whatman3001-861נייר תאית, מידות: 20 * 20 ס"מ
תקני אקסוזום עם תווית פלואורסצנטיתHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100אקסוזום עם תווית FITC (Ex/Em: 490/520 ננומטר)
Keithley 2410 מד מקור זרם/מתחKeithley Instruments, Inc.זרם– מערכת מדידת מקור מתח
Nafion תמיסת שרף פרפלואוריתSigma-Aldrich31175-20-9ממברנה סלקטיבית, 20 wt.% בתערובת של אלכוהולים אליפטיים נמוכים יותר ומים; מכיל 34% מים
NanoSight LM10NanoSight Technologyמכונת ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA)
מי מלח חוצץ פוספט (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001
תוכנת מדפסת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175(2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles