הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

3.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61297

⸱

15 במאי 2020

 ,  , 
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא להזריק רודמין מצומד אקטין כדורי לתוך עוברים Drosophila ואת התמונה הרכבה מוט actin תוך גרעיני בעקבות עומס חום.

תקציר

מטרת פרוטוקול זה היא לדמיין מוטות אקטין תוך-גרעיניים המתכנסים בעוברים חיים של דרוזופילה מלנוגאסטר בעקבות עומס חום. מוטות אקטין הם סימן היכר של תגובת מתח Actin שמורה ובלתי ניתנת להכנעה (ASR) המלווה פתולוגיות אנושיות, כולל מחלה נוירודגנרטיבית. בעבר, הראינו כי ASR תורם כשלים morphogenesis וכדאיות מופחתת של פיתוח עוברים. פרוטוקול זה מאפשר את המשך המחקר של מנגנונים שבבסיס הרכבת מוט actin ו ASR במערכת מודל כי הוא מאוד נוח הדמיה, גנטיקה וביוכימיה. עוברים נאספים ומורכבים על כיסוי כדי להכין אותם להזרקה. אקטין כדורי מצומד רודמין (G-actinאדום)מדולל וטעון לתוך microneedle. זריקה אחת נעשית למרכזו של כל עובר. לאחר ההזרקה, העוברים הם דגירה בטמפרטורה גבוהה מוטות actin תוך גרעיניים הם דמיינו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסויים photobleaching (FRAP) ניתן לבצע על מוטות actin; ומבנים אחרים עשירים באקטין בציטופלסמה יכולים גם הם להדמיינו. אנו מוצאים כי G-actinאדום polymerizes כמו G-actin אנדוגני ואינו, בכוחות עצמו, להפריע להתפתחות העובר נורמלי. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי יש לנקוט טיפול במהלך ההזרקה, כדי למנוע פגיעה חמורה בעובר. עם זאת, עם תרגול, הזרקת G-actinאדום לתוך עוברים Drosophila היא דרך מהירה ואמינה לדמיין מוטות actin והוא יכול לשמש בקלות עם זבובים של כל גנוטיפ או עם כניסתה של לחצים הסלולר אחרים, כולל היפוקסיה ומתח חמצוני.

מבוא

פרוטוקול זה מתאר כיצד להזריק G-actinאדום כדי לדמיין את ההרכבה של מוטות actin תוך גרעיני בעוברים לחוצים חום שעוברים תגובת מתח Actin בלתי ניתנת לערעור (ASR)1. פיתחנו פרוטוקול זה כדי לסייע במחקרים של ASR, אשר בעוברים מוביל מורפוגנזה משובשת וכדאיות מופחתת, ובסוגי תאים אנושיים בוגרים קשורה פתולוגיות כולל אי ספיקת כליות2, מיופתיות שרירים3, אלצהיימר ומחלת הנטינגטון4,5,6,7,8. זה ASR הוא המושרה על ידי לחצים תאיים רבים, כולל הלם חום9,10,11, מתח חמצוני4,6, סינתזת ATPמופחתת 12, ו האנטינטין חריג או אוליגומריזציה עמילואיד β4,5,6,7,9,13,14,15,16. סימן ההיכר של ASR הוא הרכבה של מוטות אקטין חריגים בציטופלסמה או בגרעין של תאים מושפעים, המונע על ידי היפראקטיביות הנגרמת על ידי מתח של חלבון אינטראקציה actin, Cofilin1,5,6,10. למרבה הצער, פערי ידע מרכזיים נשארים לגבי ASR. לדוגמה, הפונקציה של מוטות actin אינו ידוע. איננו מבינים מדוע מוטות נוצרים בציטופלסמה של סוגים מסוימים של תאים, אלא בגרעין של אחרים. כמו כן לא ברור אם ASR הוא מגן או לא מתאים עבור תאים או עוברים שעברו מתח. לבסוף, אנחנו עדיין לא יודעים את המנגנונים המפורטים שבבסיס היפראקטיביות Cofilin או הרכבה מוט actin. לפיכך, פרוטוקול זה מספק בדיקה מהירה ורב-תכליתית כדי לחקור את ASR על ידי הדמיה היווצרות מוט actin ודינמיקה במערכת ניסיונית ניתנת להפעלה מאוד של עובר זבוב הפירות החי.

הפרוטוקול כדי microinject G-actinאדום לתוך עוברים חיים Drosophila פותחה בתחילה כדי ללמוד את הדינמיקה של מבנים נורמליים cytoplasmic actin17 במהלך אירועי בניית רקמות. במחקרים אלה, מצאנו כיהזרקת אדום G-actin לא השפיעה לרעה על תהליכים התפתחותיים מוקדמים בעובר, כולל ציטוקינזיס או גסטריולציה17,18. לאחר מכן שינינו את הפרוטוקול, התאמת הטיפול בעוברוהזרקת אדום G-actin כדי לאפשר הדמיה של מוטות actin בחום עוברים ASR1. שיטות אחרות מלבדהזרקת אדום G-actin ניתן להשתמש כדי לדמיין actin בעוברים. שיטות אלה מסתמכות על ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים (FPs) המתויגים לפעול או לתחומים של חלבונים מחייבים actin, כגון Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, ו Moesin-GFP (נבדק בשנת19). עם זאת, באמצעות בדיקות FP אלה דורש זהירות כי הם יכולים לייצב או לשבש כמה מבנים actin, לא באותה מידה תווית כל מבני actin20, ובמקרה של actin-GFP, הם מוגזמים מאוד – בעייתי לניתוח של הרכבת מוט אשר לא רק תלוי מתח אלא גם actin ריכוז תלוי1. לכן, G-actinאדום הוא החללית המועדפת על מחקרי מוט בעוברים לעוף, ואת הגודל הגדול של העובר מאפשר הזרקה קלה שלה.

זרימת העבודה של פרוטוקול זה דומה לטכניקות microinjection מבוססות אחרות ששימשו להזרקת חלבונים, חומצות גרעין, תרופות, אינדיקטורים פלואורסצנטיים לתוך עוברי Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. עם זאת, בעקבות microinjection של אדום G-actin כאן, עוברים נחשפים ללחץ חום קל כדי לגרום ASR והרכבה מוט actin תוך-גרעיני. עבור מעבדות עם גישה זבובים אסדת הזרקה, שיטה זו צריכה להיות מיושמת בקלות להתאמה עבור קווי לימוד ספציפיים לגבי ASR, כולל אינדוקציה שלה על ידי לחצים שונים או אפנון ברקעים גנטיים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת כוסות איסוף עוברים וצלחות אגר מיץ תפוחים

  1. חמישה ימים לפני ניסוי ההזרקה, לבנות28 או לרכוש לפחות שתי כוסות אוסף עוברים קטנים. הפוך טרי 60 מ"מ מיץ תפוחים צלחות אגר לשמש עם כוסות אוסף קטנות28. יש לאחסן צלחות בקופסאות פלסטיק מכוסות במגבות נייר לחות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: כוסות איסוף עוברים קטנות, המאוכלסות במספרי זבובים כמתואר בשלב 1.3, יספקו מספרי עוברים מספיקים לכל ניסוי, תוך הקפדה על טיפול והזרקת עוברים תוך זמן קצר מספיק כדי לאפשר הדמיה של שלבים התפתחותיים מוקדמים.
  2. צלחות מיץ תפוחים חמות עד 18 מעלות צלזיוס ומוסיפים טיפה של משחת שמרים למרכז הצלחת. משחת שמרים היא הדבק פשוט של שמרים פעילים ומים מזוקקים.
  3. כדי לקדם את הטלת הביצים הנדיבה ביותר, הקימו כוסות איסוף עם זבובים יומיים לפני הניסוי. מוסיפים לפחות 100 נקבות ו-50 זבובים זכרים ל כוסות האיסוף, ומעליהם צלחת מיץ תפוחים מוכנה(איור 1,שלב 1). בימים שלפני ניסוי ההזרקה לשנות את צלחות מיץ תפוחים לפחות פעמיים בכל יום, פעם בבוקר ופעם בערב.
    הערה: תוצאות ההזרקה וההדמיה הטובות ביותר מתקבלות כאשר כוסות איסוף העובר נשמרות ב 18 °C (69 °F) עם אור 12 שעות על / מחזור כיבוי אור.

2. הכן פתרון מלאי עובד של אדום G-actin עבור microinjection

הערה: הכנה זו עושה רק 2 μL של 5 מ"ג / מ"ל עובד מלאי של G-actinאדום, כך שאם משתמשים אינם מורגלים טכניקת microinjection, זה יתרון לדלג לשלב 3 ולתרגל את microinjections עם מאגר pH ניטרלי כדי לשמר מלאי עבודה יקר. מלאי 10 מיקרוגרם של אדום G-actin מהספק ניתן לאחסן באריזתו המקורית בצנצנת 16 עוז העליון בורג עם ~ 500 גרם של יבוש ב 4 °C (6 °F) עד 6 חודשים.

  1. הכן פתרון מלאי G-buffer מראש: 5 mM Tris-HCl, 0.2 mM CaCl2, pH 8.0. מסננים ומאחסנים בטמפרטורת החדר.
  2. ביום של זריקות, להכין 1 מ"ל של פתרון עבודה G-buffer בצינור microcentrifuge כובע הצמד טרי על הקרח באמצעות מלאי G-buffer משלב 2.1, בתוספת הדברים הבאים בריכוזים הסופיים המצוין: 1 mM dithiothreitol (DTT) ו 0.2 mM ATP, pH 8.0.
    הערה: נפח 1 מ"ל של פתרון עבודה G-buffer הוא יותר ממה שנדרש לניסוי אבל מפשט את ההכנה. עודף יכול להימחק לאחר הניסוי או שמשתמשים יכולים לצמצם בהתאם להעדפותיהם.
    1. שמירה על 10 מיקרוגרם G-actin מלאיאדום על קרח, הראשון להוסיף 1 μL של מים מסוננים, מזוקקים לחלק העליון של טיפה ורודה של אדום G-actin בתוך הצינור.
    2. לאחר מכן, הוסף μL אחד של פתרון העבודה קר, טרי מוכן G-buffer משלב 2.2. Pipet למעלה ולמטה ~ 20 פעמים כדי לערבב היטב עם נפח פיפטה מוגדר 1 μL. מניית G-actinאדום יהיה עכשיו בדילול הסופי של 5 מ"ג / מ"ל.
  3. דגירה G-actinאדום מוכן במשך 30 דקות על קרח באין מפריע.
  4. צנטריפוגה G-actinאדום מוכן ב 16,000 x g במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס במיקרוצנטריפוגה כדי להסיר כל משקעים.
  5. בזהירות pipet 1.5 μL של supernatant לתוך צינור microcentrifuge כובע הצמד טרי על הקרח, הימנעות גלולה ורוד כהה.
  6. לאחסן את G-actinאדום supernatant מוכן על הקרח עד 6 שעות עד מוכן לטעון לתוך microneedle.
    הערה: Microneedles ניתן למשוך מצינורות נימי מראש על מושך micropipette, ולאחר מכן מאוחסן בטמפרטורת החדר על רצועה של חימר דוגמנות בצלחת פטרי 100 x 20 מ"מ. פרמטרים מוצעים למשיכת מיקרונידל ניתן למצוא בספר הבישול פיפט29.

3. לאסוף עוברים ולהרכיב להזרקה

  1. אפשר זבובים להניח עוברים במשך 30 דקות על צלחות מיץ תפוחים עם משחת שמרים ב 18 מעלות צלזיוס.
  2. בעוד זבובים מניחים, מחממים מראש צלחת אגר מיץ תפוחים ללא משחת שמרים לטמפרטורת החדר, חותכים טריז מלבני של 4 ס"מ x 1 ס"מ של מיץ תפוחים אגר עם סכין גילוח, ומניחים על מגלשת זכוכית 25 מ"מ x 75 מ"מ.
    1. צלחת הקציר מהאוסף של 30 דקות ועוברים דקוריונטים על ידי שפיכת אקונומיקה טרייה, מדוללת 1:1 עם מים מזוקקים, על הצלחת ומסתחררת את הצלחת במשך דקה אחת, כמתוארב-28 (איור 1,שלב 2).
      הערה: מותגים שונים של אקונומיקה נמכרים בריכוזים שונים. אקונומיקה המשמש כאן הוא 6% hypochlorite נתרן מהבקבוק והוא מדולל לריכוז הסופי של 3% hypochlorite נתרן. מותגי אקונומיקה אחרים בריכוזים מעט נמוכים יותר יעבדו טוב באותה מידה.
    2. יוצקים את האקונומיקה והעוברים המופקרים לסל איסוף (מסננת תאים של 70 מיקרומטר) ושוטפים את הצלחת פעמיים במים מזוקקים מבקבוק גמירה, ומוסיפים את השטיפות האלה לסל האיסוף.
    3. שוטפים במרץ את העוברים המנוכרים בסל האיסוף במים מזוקקים עד שלא ניתן לראות גושי שמרים והסל אינו משאיר סימנים ורודים מאקונומיקה עודפת כאשר הם נמחקים על מגבת נייר.
  3. באמצעות מברשת צבע עם זיפים מעומעמים במים מזוקקים, מעבירים עוברים דקוריונים ושטופים מסל האיסוף אל טריז מיץ התפוחים המוכן על מגלשת הזכוכית.
  4. השתמשו בזוג פינצטה עדינה או במחט מנתחת כדי לסדר עשרה עוברים בקו ישר לאורך הציר הארוך של טריז אגר המלבני(איור 1, שלב 3). מסדרים את העוברים ראש אל זנב, כך שהקוטב הקדמי שלהם פונה ימינה וצד הגב פונה אל החוקר (איור 1, שלב 3, מוגדל).
  5. חותכים 0.5 ס"מ מקצה קצה פיפטה P200 עם סכין גילוח וטובלים לתוך "דבק העובר" (המתואר ב-28). מצפים בנדיבות אזור ברוחב 5 מ"מ (איור 1, שלב 4)לאורך הקצה הארוך של כיסוי מלבני בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ, ומניחים לצד יבש ודבק כלפי מעלה. ייבוש ייקח ~ 30 s והוא שלם פעם את כל האזור מצופה דבק מופיע מט ולא רטוב או מבריק.
    הערה: הכינו "דבק עובר" לפחות 48 שעות מראש. הוסף n-Heptane לרצועות של קלטת דו צדדית בבקבוקון נצנצים כמתואר ב28.
  6. לאחר "דבק העובר" התייבש, בעדינות למקם את הצד דבק coverslip למטה על גבי השורה של עוברים מיושר על אגר, משאיר 2-3 מ"מ של רווח בין קצה הכיסוי לבין שורת העוברים.
    הערה: הדבקת העוברים קרוב מדי לקצה הכיסוי עלולה להוביל לכך שהעוברים יתייבשו יותר מדי במהלך הניסוי.
  7. הפוך את הכיסוי כך שהעוברים פונים כעת כלפי מעלה. הם צריכים להיתקע בשורה לאורך קצה אחד ארוך של הכיסוי, והאזור הגחוני שלהם פונה לקצה הקרוב ביותר של הכיסוי (איור 1,שלב 4, מוגדל).
  8. לייבש את העוברים על ידי הנחת כיסוי עם עוברים בעדינות על גבי 150 גרם של יבוש כחול טרי מאוחסן בצנצנת 16 עוז בורג העליון. בורג חזק על המכסה והדגירה למשך 8-10 דקות(איור 1, שלב 5).
  9. לאחר התייבשות, הסירו את הכיסוי מצנצנת הייבוש והקלטת כל צד קצר של הקליפה למגלשת מיקרוסקופ, צד העובר כלפי מעלה, עם שתי חתיכות 4 ס"מ2 של סרט הדבקה דו-צדדי, כך שכיסוי העובר יתאים לשלב ההזרקה (איור 1, שלב6).
  10. הוסיפו 2-3 טיפות שמן Halocarbon 27 עם פיפט פסטר כדי לכסות את העוברים המיושרים ולהגן עליהם מפני התייבשות נוספת(איור 1, שלב 6).

4. להזריק ולחמם עוברי מתח כדי לקדם היווצרות מוט actin

הערה: כל הזריקות נעשות בחדר מבוקר טמפרטורה ב 18 °C (60 °F).

  1. הכינו תאי דגירה לחים מצלחת פטרי מזכוכית בגודל של לפחות 100 מ"מ x 20 מ"מ ומרפדים את התא בפיתולים של מגבי רקמת מעבדה מעומעמים במים מזוקקים(איור 1,שלב 8). מחממים מראש את תאי הדגירה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס או את טמפרטורת הדגירה הרצויה לפני הזרקת עוברים.
  2. פתח את שסתום זרימת האוויר עבור microinjector ולהדליק את microinjector (אוויר דחוס או אוויר הבית בלחץ של לפחות 90 psi מתאים).
  3. בעוד העוברים מתייבשים, טען לאחור את ה-G-actinRed supernatant שהוכן קודם לכן לתוך המיקרונידל באמצעות קצה מטעין מיקרו. הגדר את הפיפט כדי לצייר 1-1.5 μL.
    הערה: בגלל הצמיגות של actin, טעינת כרכים לא יכול להיות מדויק וייתכן שיש מספיק actin עזב לטעון לפחות אחד עד שני microneedles יותר. ניתן להזריק עד 60 עוברים לכל מיקרונידל טעון אם המיקרונידל מכויל כראוי ואינו סתום במהלך הניסוי.
  4. חבר את המיקרונידל למחזיק המחט והדק את הבורג. חבר את צינור האוויר למיקרו-יין וודא שהלחץ על הזרימה האחורית על המיקרונידל שווה ל-30 hPa.
  5. כייל את הגדרות microinjector לגרש בועה בקוטר 100 מיקרומטר של אדום G-actin (~ 500 pL) על מיקרומטר שקופית. לסובב את ידית הלחץ (500-1500 hPa) ואת ידית זמן הדופק הזרקה (0.1-0.5 s) על microinjector כדי לקבל את גודל הבועה הנכון. התאם הגדרות אלה בכל פעם שמיקרונידל חדש נטען כדי להסביר את השונות בצמיגות actin ובגודל קצה המיקרונידל.
    הערה: אדום G-actin מוכן הוא צמיג וייתכן שיש אוויר בקצה microneedle כי צריך להיות מגורש לפני הזרקת עוברים. אם G-actinאדום אינו בקלות לגרש מקצה microneedle, בעדינות לשבור את קצה microneedle נגד קצה של מיקרומטר שקופית.
  6. הנח את השקופית עם עוברים רכובים על במת המיקרוסקופ.
    הערה: כל זריקה להגדיר יהיה שונה, כך החוקרים יצטרכו להתאים את שיטת ההזרקה שלהם בהתאם. כאן העוברים מועברים ביחס למיקרונידל נייח, מזריקים כל עובר על ידי הפעלת העובר לתוך המיקרונידל.
  7. כוונן את שלב המיקרו-מניפולטור והתמקד במטרה 10x במיקרוסקופ האור כך שהעוברים יהיו גלויים. העוברים נמצאים במישור המוקד הנכון כאשר קווי המתאר של קרום הויטליין הם החדים ביותר והעובר נראה הגדול ביותר. בחר עוברים להזריק כי הם בשלב ההתפתחותי הנכון, כך שעד הדגירה שלאחר ההזרקה הושלמה, רוב המצמד מגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי (למשל, להזריק עוברים בשלב 2-330 של Bownes על מנת לצפות מוטות ב cellization לאחר עומס חום ב 32 מעלות צלזיוס).
  8. השתמש בפקדי microneedle כדי להביא את המחט לאותו מישור מוקד כמו העוברים.
    הערה: אם microneedle תופס על כריכה בעת הזזת הבמה או microneedle, אז microneedle קרוב מדי לשקופית והוא לא במישור המוקד הנכון. המיקרונידל צריך להיות מקביל לכיסוי, ולא בזווית משמעותית (איור 1, שלב 7).
  9. הכנס את המיקרונידל לעובר כך שהוא יפגע בעובר באמצע אזור הגחון שלו, בעובר "קו המשווה". הזרקת טריגר עם דוושת כף הרגל או כפתור "הזרקה" כאשר קצה המיקרונידל נראה באמצע העובר (איור 1, שלב 7).
  10. להזריק את G-actinאדום פעם אחת לאט להסיר את microneedle. להזיז את הבמה ולחזור על כל עובר של השלב ההתפתחותי המתאים.
    הערה: הרחבת העובר היא נורמלית כמו אדום G-actin מוזרק קצת ציטופלסמה עלולה לדלוף מתוך העובר.
  11. לאחר שכל העוברים הוזרקו, הנח את המגלשה עם העוברים בתא הדגירה הלח המוכן וסגור את המכסה (איור 1, שלב 8). אם מנסים להשיג עוברים שמגיעים לתאליזציה, החום מדגיש את העוברים ב 32 מעלות צלזיוס במשך 60-75 דקות בתא הדגירה הלח.
    הערה: זמני הדגירה מצוינים המאפשרים הדמיה של מוטות בהבאת עוברים הדגיש חום. זמן הדגירה יהיה ארוך יותר עבור עוברים שאינם בקרת מתח חום כי הפיתוח יהיה איטי יותר בטמפרטורה נמוכה יותר31. עוברי בקרה אלה יכולים להיות דגירה בתאים לחים בטמפרטורות כגון 18 °C (69 °F) או 25 °C (69 °F), בהתאם לעיצוב הניסוי הספציפי ואת השאלה שיש לשאול. זמן הדגירה המינימלי הדרוש עבור אדום G-actin להתפזר לאורך העובר הוא 30 דקות.

5. מוטות אקטין תמונה בחום עוברים הדגיש על ידי מיקרוסקופיה confocal

  1. בזמן שהעוברים לחוצים בחום, הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקאלי ובחר את ערוץ הלייזר 561 ננומטר.
  2. הזז את העדשה האובייקטיבית (מומלץ 25x, 40x או 63x) לעמדת העבודה.
  3. אם הדמיית חום הדגיש עוברים, ואז להגדיר את החממה שלב מחומם כדי להשיג טמפרטורה פנימית של 32 מעלות צלזיוס. מדחום נקודה וירה או אינפרא אדום יכול לשמש כדי לבדוק את הטמפרטורה ב או ליד המטרה.
  4. הסר את השקופית עם עוברים מוזרקים מתא הדגירה הלח לאחר השלמת הדגירה (איור 1, שלב 9).
  5. עבודה מהירה, בעדינות לחטט חתיכות קלטת דו צדדית ששימשו לדבוק כיסוי עם עוברים רכובים לשקופית (איור 1, שלב 9).
    התראה: היה עדין במהלך שלבים אלה, שכן כיסויים יכולים להתנפץ בקלות אם מופעל כוח רב מדי.
  6. תדביקו יחד שתי חתיכות באורך 2.5 ס"מ של סרט הדבקה דו-צדדי ותחתכו את הסרט לחצי לאורך כדי ליצור שתי רצועות, באורך 2.5 x 0.5 ס"מ(איור 1,שלב 10).
  7. מקל שני שלישים של האורך של כל רצועת קלטת על כריכה הראשונה, אגף כל צד של העוברים ב Halocarbon 27 שמן (איור 1,שלב 10, כתום),משאיר שליש רצועות קלטת תלוי מקצה הכיסוי הראשון שבו העוברים תקועים. השתמש בידיים כפפה והיזהר לא לגעת בעוברים במהלך שלב זה.
  8. מניחים בעדינות כיסוי מלבני שני על גבי רצועות הסרט כדי לכרוך את העוברים בין העטיפות(איור 1,שלב 10, כחול). יישר את הקצוות של 25 מ"מ אך שמור על היסט הקצוות של 50 מ"מ זה מזה ברוחב של 1 ס"מ.
    הערה: המשטח המלא של ה-coverslip השני יהפוך למשטח ההדמיה החדש שיפנה לעדשה האובייקטיבית, לכן הקפידו לא לקבל טביעות אצבעות או שמן Halocarbon 27 על משטח הכיסוי השני . הקיזוז נחוץ כדי שניתן יהיר להוסיף שמן Halocarbon 27 נוסף כדי לטבול באופן שווה את העוברים. במידת הצורך, הוסיפו שמן Halocarbon 27 בתפר שבו שני הכיסויים נפגשים בחלק העליון של הכריך והוא יצפה את העוברים בפעולה נימית (ראו קווים מקווקווים באיור 1, שלב 10).
  9. הקש בעדינות על אזורי הכיסוי שנמצאים ישירות על גבי רצועות הסרט עם הצד הקהה של razorblade כדי לקבל את הכיסוי לדבוק בקלטת.
  10. הופכים את כריך הכיסוי ומניחים על מגב רקמת מעבדה כדי לשמור על משטח ההדמיה נקי ולשאת למיקרוסקופ הקונפוקלי(איור 1, שלב 11). ודא שהקלטת דבוקה לחלוטין לשני החלקים לפני ההדמיה.
  11. ודא כי השלב מחומם הוא בטמפרטורה ואם באמצעות מיקרוסקופ הפוך, להוסיף נוזל טבילה על העדשה המטרה שנבחרה.
  12. הניחו את כריך ה-coverslip על הבמה בזהירות כדי להבטיח שמשטח ההדמיה החדש (2nd coverslip) הוא זה שנוגע בנוזל הטבילה(איור 1, שלב 11).
    הערה: במידת הצורך, לדבוק כריך coverslip לבמה עם שתי חתיכות קטנות של סרט דו צדדי כדי למנוע תנועה מיותרת במהלך ההדמיה אם coverslips אינם מתאימים היטב בשלב מחומם.
  13. התמקדו בעובר שנמצא בתווית (Bownes שלב 4a30) או בשלב ההתפתחותי הרצוי באמצעות אור משודר או פלואורסצנטיות.
  14. לאחר העובר הובא לפוקוס, לעבור למצב רכישת לייזר על מיקרוסקופ confocal ולהתאים כוח לייזר ורווח, גודל מסגרת, ריצוף, הגדרות הקרנה לפי הצורך.
  15. קח תמונות פני השטח דרך מישורי המוקד של הגרעינים של העובר כדי למצוא מוטות אקטין תוך-גרעיניים. מוטות אמורים להופיע בכיוונים מרובים כפסים בהירים או כנקודות בתוך הגרעינים הכהים יחסית(איור 2A, 2C).

6. ניסויי הדמיה אלטרנטיביים

  1. בצע FRAP כדי לחקור תחלופת actin לאורך מוטות actin תוך-גרעיניים או במבנים actin ציטופלסמי, כגון קצות תלמי קרום הפלזמה במהלך הסלולר.
  2. בתוכנת ההדמיה, בחר אזור מלבני סביב טיפים תלמים או מוטות actin שבו לרכוש את הניסוי.
  3. בחר אזור מרובע קטן של מרכז מוט actin בתוך אזור הרכישה המלבנית כדי להלבין. ודא כי קצות מוט actin גלויים ולא לקבל מולבן במהלך הניסוי כדי לאפשר מעקב מדויק של המוט בתוך הגרעין.
  4. הגדר את לייזר אקונומיקה כדי לחזור 50x ולהגדיר את כוח לייזר אקונומיקה למקסימום.
  5. בחר קורס זמן כדי לרכוש תמונות בכל שנייה עבור סך של עד 120 שניות במהירות מקסימלית של השתהות פיקסלים והגדר את הלייזר להלבין לאחר שתי השניות הראשונות של רכישת התמונה.
  6. לכמת את הנתונים כדי לקבוע את המחצית של התאוששות פלואורסצנטיות1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זרימת עבודה סכמטית של טיפול בעובר מתוארת באיור 1, ולוח זמנים לניסוי טיפוסי מוצג בטבלה 1. הערכה לתוצאה ניסיונית טובה היא שעל כל 10 עוברים שהוזרקו, לפחות מחצית מהעוברים שנצפו יהיו בשלב ההתפתחותי הנכון, לא ניזוקו, ויפגינו ASR חזק עם עומס חום ב 32 מעלות צלזיוס. ASR זה יתגלה על ידי הרכבה של מוטות אקטין תוך-גרעיניים כפי שמוצג בתמונת תצוגת פני השטח הייצוגית של עובר באיור 2A (לוח ימני). מוטות אקטין יופיעו במספר כיוונים (מקבילים או בניצב למישור ההדמיה) ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

משמעותה של שיטה זו היא שהיא משתמשת בפרוטוקול מבוסס היטב של microinjection בעוברים Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 כדי לאפשר מחקר חדש לגבי ASR וליווי הרכבת מוט actin. היתרון העיקרי של הזרקת אדום G-actin לעוברים חיים הוא כי ASR ניתן ללמוד תחת מגוון רחב של הקשרים. עבור מחקרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מודים בהכרת תודה על עבודתם של ליוליו ז'נג וזנגווי שו, שעזרו לחלוץ טכניקה זו במעבדת סוקאק, כמו גם חסן סד שעזר בניתוח. העבודה למחקר זה ממומנת על ידי מענק מ- NIH (R01 GM115111).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדנוזין טריפוספט (ATP)Millipore-Sigma A23835Gרכיב של G buffer
מיץ תפוחים, Mott's, 64 אונקיות נוזלMott's014800000344רכיב של צלחות מיץ תפוחים
Bacto AgarBD214010רכיב של צלחות מיץ תפוחים
אקונומיקה, קוטל חיידקים PureBright, 6.0% נתרן היפוכלוריטKIK International059647210020לעוברים מפרקים
סידן כלוריMillipore-Sigma C1016500G
מסננת תאי חיץ G, 70 μ mFalcon352350לאיסוף עוברים מפורקים
מיקרוסקופ קונפוקלי, LSM 880 34 ערוצים עם AiryscanZeiss0000001994956להדמיית מוטות אקטין תוך-גרעיניים
DesiccantDrierite24001לייבוש עוברים
מיקרוסקופ ניתוח, סטריאוסקופ Stemi 508 עם זום 8:1Zeiss 4350649000000לסידור עוברים על טריז אגר
מחט ניתוח, 5 בFisher Scientific08965Aלסידור עוברים על טריז אגר
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificBP1725מאגר G
, סקוטי קבוע, 0.5 אינץ' x 250 ב3M021200010323להכנת דבק עוברי
כלוב איסוף עובריםGenessee Scientific59100לשיכון זבובים בוגרים ואיסוף עוברים
פינצטה עדינה, פינצטה דומונט, סגנון 5מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72701Dלסידור עוברים על טריז אגר
נימי זכוכית, זכוכית בורוסילקטית, דקה 1 מ"מ x 0.75 מ"מWorld Precision Instruments, Inc.TW1004למיקרו-מחטים
שמן הלוקרבון 27Millipore-SigmaH8773100MLלהידרציה של עוברים
אינקובטור שלב מחומםZeiss4118579020000, 4118609020000, 4118609010000להדמיה קונפוקלית
מגבי רקמות מעבדה, KimWipesKimberly-Clark34155מגבי רקמות מעבדה
מיקרוסקופ אור, Invertoskop 40C ניגודיות פאזה הפוכה מיקרוסקופ,מיקרוסקופ הזרקהZeissשהופסק
מתיל-4-הידרוקסיבנזואטMillipore-SigmaH36471KGרכיב של צלחות מיץ תפוחים
מיקרו-מזרק, FemtoJet4xEppendorf5253000025מיקרו-מזרק
מיקרו טיפים למעמיס, epT.I.P.S. 20 μ LEppendorf5242956003להעמסת מיקרו-מחטים
מיקרומניפולטור ושלב הזרקה עם חוגות x,y,z להתאמת מחטBernard Instruments, Inc (יוסטון, טקסס)מותאם אישיתלביצוע מיקרו-הזרקות
חולץ מיקרופיפטה, דגם P-97, מכשירי סאטר בוערים/חומיםP97למשיכת צינורות נימיים לייצור מיקרו-מחטים
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 24x50-1.5פישר סיינטיפיק12544Eלהרכבת עוברים
שקופיות מיקרוסקופ, לילך קולפרוסט, נקי מראש, 25 x 75 x 1 מ"מפישר סיינטיפיק22037081להרכבת עוברים להזרקה
n-HeptaneFisher ScientificH3601רכיב של דבק עובר
מטרה, 10xZeissהופסק10x מטרה למיקרוסקופ
הזרקהאובייקטיבי, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCSZeiss4217679971711מטרת מים 40x למטרה קונפוקלית
, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 לטבילה בשמן, מים, שמן סיליקון או גליצרין (D=0-0.17 מ"מ) (WD=0.57 מ"מ ב-D=0.17 מ"מ)Zeiss420852987100025x מטרת טבילה מעורבת למטרה קונפוקלית
, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRAZeiss4207829900799-63x מטרת שמן עבור קונפוקלי
מכחול, רוברט סימונס ביטוי E85 מחודד בגודל עגול 2038372016954 Daler-Rowneyלהעברת עוברים
מגבות נייר, מגבות נייר קלינקס C-fold, 884266344845קימברלי-קלארקלמסננת תאים
, 5 3/4 בפישרסיינטיפיק1367820Aלכיסוי עוברים
בשמן צלחת פטרי, זכוכית, 100 x 20 מ"מקורנינג3160102לתא דגירה לח
צלחת פטרי, פלסטיק, 60 x 15 מ"מVWR25384092לצלחות מיץ תפוחים
פיפטה, אפנדורף התייחסות 0.5-10 μ LEppendorf2231000604להעמסת קצה הפיפטה המיקרו-מחט
, xTIP4 250 μ LBiotix63300006להוספת דבק עוברי לכיסוי
סכין גילוחVWR55411050לחיתוך טריז אגר, סרט, קצות פיפטה
אקטין כדורי מצומד רודמין, טסיות דם אנושיות (לא שריר; 4x10 μ ז)Cytoskeleton, Inc.APHR-AG-actin^ בקבוקון
נצנוץ אדום, 20 מ"ל בורוסיליט זכוכית עם תוחם פוליאתילן ומכסי אוריאהFisher Scientific033377להכנת דבק עוברי
צנצנת עליונה בורגית, 16 אונקיותNalgene000194414195לייבוש עוברים
שלב מיקרומטראלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית602104PGלכיול נפח הזרקת G-actin
סוכרוזMillipore-Sigma840971KGרכיב של צלחות מיץ תפוחים
בסיס TrizmaMillipore-Sigma T15031KGרכיב של
שמרי G buffer, שמרי Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 אונקיותLesaffre Yeast Corporation117929157002רכיב של משחת שמרים
רכיב של רכיב של סרט דו צדדי משופץ לבן פסטר

מקורות

  1. Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
  2. Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
  3. Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
  4. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
  5. Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
  6. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  7. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
  8. Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
  9. Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
  10. Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
  11. Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
  12. Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
  13. Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
  14. Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
  15. Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
  16. Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
  17. Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
  18. Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
  19. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  20. Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
  21. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).
  22. Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).
  23. Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).
  24. Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).
  25. Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).
  26. Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
  27. Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
  28. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).
  29. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
  30. Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
  31. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
  32. Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עקה תרמיתטכניקת מיקרו-הזרקהמיקרוסקופיה קונפוקליתניסויי FRAPG-actin Redתגובת מאמץ של אקטיןקיבוע עובריםהתאוששות פלואורסצנטית
הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.