מאמר שיטה

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

DOI:

10.3791/61298

⸱

16 ביולי 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון במערכות קרום התא ממלאות תפקידים מכריעים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, החל מאינטראקציות בין תא לתא ועד העברת אותות; החל מחישה של אותות סביבתיים ועד לתגובה ביולוגית; מוויסות מטבולי לבקרה התפתחותית. מידע מבני מדויק של אינטראקציות חלבון-חלבון חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים של קומפלקסים של חלבוני ממברנה ולעיצוב מולקולות ספציפיות מאוד לווסת חלבונים אלה. גישות רבות in vivo ו- in vitro פותחו לגילוי וניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון. ביניהם הגישה הביולוגית המבנית היא ייחודית בכך שהיא יכולה לספק מידע מבני ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית. עם זאת, הביולוגיה המבנית של חלבון הממברנה הנוכחי עדיין מוגבלת במידה רבה לשיטות מבוססות חומר ניקוי. החיסרון העיקרי של שיטות מבוססות חומר ניקוי הוא שהם לעתים קרובות לנתק או denature קומפלקסים חלבון קרום פעם הסביבה המקומית שלהם bilayer השומנים מוסר על ידי מולקולות דטרגנט. פיתחנו מערכת ננו-חלקיקים של קרום התא המקומי לביולוגיה מבנית של חלבון קרום. כאן, אנו מדגימים את השימוש במערכת זו בניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון על קרום התא עם מקרה מבחן של המצב האוליגומרי של AcrB.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון חלבון (PPI) ממלאות תפקידים מרכזיים בביולוגיה, החל מתחזוקת המבנה והתפקוד של חלבונים ועד לוויסות מערכות שלמות. PPIs מגיעים בצורות רבות ושונות וניתן לסווג על סמך סוגי האינטראקציות שהם יוצרים. סיווג אחד כזה הוא הומו-אוליגומרי או הטרואוליגומרי, בהתבסס על השאלה אם האינטראקציות הן בין יחידות משנה זהות או חלבונים שונים הפועלים כיוני משנה. סיווג נוסף מבוסס על עוצמת האינטראקציה אם האינטראקציות מובילות להיווצרות קומפלקסים יציבים או מצבים מורכבים חולפים. מידע מבני על PPIs בין חלבונים הוא חיוני בהבנת המנגנון שבאמצעותו חלבונים לבצע את תפקידם. ההערכה היא כי מעל 80% של חלבונים להסתמך על היווצרות מורכבת על מנת לבצע את תפקידם התפקודי1. בהתחשב באחוז החלבונים שנצפו להסתמך על PPIs לתפקוד מולד תקין משמעותם בביולוגיה ניכרת בקלות, אך היכולת לחקור כראוי את החלבונים העוסקים באינטראקציות אלה נותרה מאתגרת בשל מגבלות בטכניקות הזמינות לצפייה ניסיונית כאשר חלבונים יוצרים PPIs.

יש רמה גבוהה של חילוקי דעות בין התוצאות עבור PPIs רבים שנקבעו בניסויים בשל כמות גבוהה של רעש, תוצאות חיוביות שגויות, ותשלילים כוזבים הנגזרים רבים של טכניקות קביעת PPI זמין כיום. זה במיוחד עבור מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H), ספקטרומטריית טיהור-מסה טנדם (TAP-MS), והעברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET), המייצגים שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר לקביעת PPI2,3,4,5,6,7. לשם השוואה, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מבנית של חלבונים, כגון תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות חלבון-חלבון עד לרמה האטומית ולאפשר אישור חזותי ישיר של האינטראקציות המתרחשות עבור חלבון יעד בעל עניין. כל PPI שאינו מבוסס על מבנה זמין כיום הקובע טכניקות מחקר (למשל, Y2H, TAP-MS ו- FRET) חסר יכולת זו ובנוסף סובלים מקושי בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות בין חלבונים5. חסרונות אלה משופרים עוד יותר כאשר לומדים חלבונים קרום בשל המורכבות הנוספת הביא על ידי המשתנה הנוסף של סביבת השומנים המשפיעה על היווצרות של מבנה quaternary הנכון הרכבה מורכבת הטרומרית.

חלבוני ממברנה מהווים חלק גדול של פרוטאום ידועים לשחק תפקידים מכריעים רבים בתפקוד התא תקין בתוך כל האורגניזמים החיים. למרות העובדה כי חלבוני ממברנה מוערך לפצות 27% של הגנום האנושי ומהווים ~ 60% מכל מטרות התרופה הנוכחית יש אנומליה גדולה במספר המודלים שנפתרו עבור חלבוני ממברנה המהווים רק ~ 2.2% מכלל מבני החלבון שפורסמו8,9,10. הגורם העיקרי לפער בזמינות של מידע מבני טמון בתכונות המהותיות של חלבוני הממברנה עצמם. בשל המסיסות הירודה שלהם, הסתמכות על אינטראקציות עם סביבת השומנים לשמירה על מבנה ותפקוד מקומיים, ותכונות פיזיוכימיות שונות של קרום השומנים עצמו, חלבוני קרום ממשיכים לייצג בעיה משמעותית בעת יישום טכניקות ביולוגיה מבנית כדי ללמוד אותם. מבין תכונות מהותיות אלה, החשוב ביותר להשגת מידע מבני מדויק הוא הדרישה לקיים אינטראקציות עם סביבת השומנים הטבעית שלהם כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהם. סביבת השומנים היא חלק בלתי נפרד מהמבנה והתפקוד של חלבוני הממברנה שהמושג של ממטאין (שילוב של המילים קרום וחלבון) הוצע כיחידה הבסיסית של מבנה חלבון קרום ותפקוד11. למרות החשיבות של אינטראקציות חלבון השומנים, טכניקות קביעת PPI המבוססות על מבנה הזמינות כיום דורשות לעתים קרובות שהחלבונים הנחקרים יהיו מסיסים או יהיו מסיסים בחומרי ניקוי. חשיפה לחומרי ניקוי קשים יכולה לרוקן את החלבונים או לגרום לחיוביות ותשלילים כוזבים עקב דילול, אשר יכול לגרום לצבירה, denaturation של חלבון, ניתוק של אינטראקציות שאינן covalent, היווצרות של מצבים אוליגומריים מלאכותיים. בשל הצורך בשמירה על סביבת שומנים טבעית לקביעה מדויקת של המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני ממברנה פיתחנו מערכת חלקיקי קרום התא המקומי (NCMNs)12 בהתבסס על שיטת Styrene Maleic Acid Lipid (SMALP)13 שדווחה בעבר.

SMALP משתמשת בקופולימר חומצה גברית סטירן כמו פולימר פעיל קרום כדי לחלץ ולטבול חלבוני קרום. פולי (Styrene-co-Maleic Acid) הוא פולימר אמפיפילי ייחודי בשל הסטירן ההידרופובי שלו moiety ו diametricic מול חומצה גברית הידרופילית moiety. זה יוצר חלקיקים על ידי ספיחה, ערעור היציבות, ושיבוש קרום התא במנגנון תלוי pH14. פעילות תפקודית זו של SMA היא המאפשרת לו להיות מנוצל כמערכת ללא חומרי ניקוי עבור מיצוי חלבון קרום ו solubilization. מערכת NCMN נבדלת ממערכת SMALP במספר היבטים. התכונה הייחודית ביותר של מערכת NCMN היא שיש לה ספריית פולימר פעילה קרום עם שפע של פולימרים בעלי תכונות ייחודיות שהופכות אותם מתאימים לבידוד של חלבוני ממברנה רבים ושונים הדורשים תנאים שונים ליציבות ותפקוד ילידי. למערכת NCMN יש גם פרוטוקולים שונים בהשוואה לשיטת SMALP כשמדובר בהכנת הננו-חלקיקים. דוגמה אחת לכך היא ש- NCMNs משתמשים בטיהור עמודת זיקה ניקל חד-שלבית לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה; ההשפעה של פרוטוקולים שונים אלה ניתן לראות בעת השוואת פרוטוקול NCMNs, אשר יצר 3.2 ו 3.0 Å קריו-EM AcrB מבנים, עם מחקר דומה באמצעות שיטת SMALP, אשר הביא מבנה AcrB cryo-EM ב 8.8 Åרזולוציה 12,15. תכונות ייחודיות אלה של מערכת NCMN הן השיפורים שנעשו בשיטת SMALP שהוקמה בעבר ולהפוך אותה למועמד אידיאלי לחקר PPIs.

טרנספורטר efflux multidrug AcrB קיים כהומוטרימר פונקציונלי ב E. coli12. ניתוח מוטגני הציע כי מוטציה נקודת P223G אחת, הממוקמת על לולאה האחראית ליציבות של שולי AcrB, מערערת את מצב השליש ומניבה מונומר AcrB כאשר הוא מוכן עם DDM חומר הניקוי, אשר יכול להיות מזוהה עם אלקטרופורזה ג'ל כחול יליד16. עם זאת, ניתוח FRET של מוטציית AcrB-P223G הציע כי כאשר בסביבת bilayer השומנים קרום התא המקורי, רוב מוטציה AcrB-P223G עדיין היה קיים כמו טרימר וכי רמות הביטוי עבור שני סוג פראי AcrB ו AcrB-P223G דומים. עם זאת, למרות תוצאות ניתוח FRET, בדיקה פעילות עבור טרנספורטר מוטנטים הראה כי הפעילות ירדה באופן דרמטי בהשוואה לסוג פראי16. למרות טכנולוגיית FRET שימשה העממית לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון, מחקרים הראו כי זה יכול לעתים קרובות לתת תוצאות חיוביות שגויות17,18,19,20.

לאחרונה, מבנים ברזולוציה גבוהה cryo-EM של טרימר AcrB נקבעו אשר הראו את האינטראקציה של AcrB עם bilayer השומנים קרום התא המקורי המשויך שלה באמצעות NCMNs12. באופן עקרוני, NCMNs יכול להיות מנוצל בקלות לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון נמצאו על קרום התא המקומי. במבחן של מערכת זו, ניסויים בוצעו כדי לבחון ישירות את המצב האוליגומרי של AcrB-P223G עם שימוש חלקיקי קרום התא המקומי מיקרוסקופ אלקטרונים כתמים שליליים. כדי להשוות עם חלקיקי AcrB מסוג פראי, השתמשנו באותו פולימר פעיל קרום (SMA2000 שנעשו במעבדה שלנו, אשר אינדקס כמו NCMNP1-1 בספריית NCMN) המשמש לקביעת מבנה cryo-EM ברזולוציה גבוהה של AcrB ופולימרים חלופיים שנמצאו בספריית NCMNs12. בהתבסס על התוצאות שדווחו בעבר, זה היה צפוי כי רוב מוטציה AcrB-P223G יתקיים בצורה של חלקיקי קרום תא מקורי טריטרי21. עם זאת, לא נמצאו חותכי AcrB במדגם, כגון אלה שנצפו עם סוג הפרא AcrB. זה מרמז על הרוב של AcrB-P223G אינו יוצר קוצצים על קרום התא המקורי כפי שהוצע בעבר.

כאן אנו מדווחים על ניתוח מפורט של המוטנט E. coli AcrB-P223G בהשוואה לסוג הפראי E. coli AcrB באמצעות NCMNs. מקרה מבחן זה של AcrB מצביע על NCMNs היא מערכת טובה לניתוח אינטראקציה חלבון חלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביטוי חלבון

  1. לחסן 15 מ"ל של מרק נהדר (TB) מדיה עם אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים עם BL21(DE3) pLysS תאים המכילים את AcrB המביעים פלסמידים ב 50 צינורות מ"ל לילה ב 37 °C (69 °F) עם רועד ב 250 סל"ד.
  2. בדוק את הצפיפות האופטית של תרבות הלילה ב 600 ננומטר (OD600) ולוודא שזה מעל 2.0.
  3. לדלל 5 מ"ל של תרבות התא לתוך 1 L של מדיה שחפת המכילה אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים דגירה ב 37 °C (67 °F) עם רועד עד OD600=0.8 ולאחר מכן לגרום עם IPTG כי יש ריכוז סופי של 1 mM.
  4. לבצע אינדוקציה ב 20 מעלות צלזיוס עם רועד במשך 20 שעות.
  5. גלולה במורד התאים באמצעות צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ו 4,000 x גרם.

2. תמוגת תאים ובידוד קרום

  1. Resuspend גלולת התא במאגר A(טבלה 1, להשתמש DDM מאגר A או NCMNs מאגר A בהתאם ערכת טיהור כי הוא לעקוב) באמצעות 80 מ"ל עבור כל 20 גרם של גלולת התא.
  2. הומוגניזציה כדורי התא resuspended באמצעות homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.
  3. מעבירים את הדגימה לתוך כיפת מתכת על קרח ו lyse התאים על ידי טעינת אותם לתוך הומוגניזר בלחץ גבוה ב 4 מעלות צלזיוס ו 1,500 בר.
    1. חזור על תהליך הטעינה של התאים לתוך homogenizer ומאפשר להם לעבור את homogenizer במשך 3-4 מחזורים או עד lysate מתחיל להבהיר.
  4. צנטריפוגה lysate ב 15,000 x g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. לאסוף את supernatant ולהעמיס לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה ב 215,000 x g עבור 1 שעה ב 4 °C (69 °F).
  6. להשליך את supernatant ולאסוף את כדורי הממברנה מן הצינורות ultracentrifuge. לאחסן כל גלולה קרום עודף ב -80 מעלות צלזיוס.

3. הכנת חלקיקי קרום התא המקומי

  1. Resuspend 1 גרם של גלולת ממברנה ב 10 מ"ל NCMNs מאגר A(טבלה 1).
  2. הומוגניזציה של דגימת קרום התא בשימוש חוזר עם homogenizer Dounce זכוכית ב 20 °C (69 °F).
  3. העבר את דגימת הממברנה המושעית לצינור פוליפרופילן 50 מ"ל והוסף פתרון מלאי פולימרים פעילים ממברנה ומאגר NCMNs נוסף A כדי להביא את המדגם לריכוז סופי של 2.5% (w / v) ממברנה פולימר פעיל (NCMNP1-1 או NCMNP5-2).
    הערה: פתרונות מלאי של פולימרים פעילים קרום צריך להתבצע במים מזוקקים כפולים ניתן לשמור בריכוזים שונים, אבל בדרך כלל 10% (w / v).
  4. לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.
  5. לטעון את המדגם לתוך ultracentrifuge ולהסתובב ב 150,000 x g עבור 1 שעה ב 20 °C (69 °F).
  6. בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל לאיזון עמודה 5 מ"ל Ni-NTA עם 25 מ"ל של מאגר NCMNs A.
  7. לאסוף את supernatant לאחר ultracentrifugation הושלם לטעון אותו על 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA בטמפרטורת החדר עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.
  8. לשטוף קווי כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) עם מספיק NCMNs מאגר B (טבלה 1) כדי לשטוף לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.
  9. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs B עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  10. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs C (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  11. יש לאלוט את החלבון ב-20 מ"ל של NCMNs Buffer D(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הדגימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.
  12. אחסן את דגימות החלבון ב-4°C.
  13. הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE על מנת לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.

4. אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE

  1. הכינו את תא הליהוק על ידי הידוק הזכוכית למנגנון הליהוק.
  2. מכינים את ג'ל ההפרדה 12% על פי המתכון המפורט בטבלה 1.
    הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.
  3. יוצקים את הג'ל, משאירים 2 ס"מ מתחת לתחתית המסרק עבור ג'ל הערימה.
  4. הסר את כל הבועות על ידי שכבות החלק העליון של הג'ל עם 100% isopropanol ולחכות ג'ל ההפרדה כדי polymerize.
  5. הסר את isopropanol ולשטוף את כל העקבות של isopropanol עם מים מזוקקים.
  6. מכינים את ג'ל הערימה לפי המתכון המפורט בטבלה 1.
    הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.
  7. יוצקים את ג'ל הערימה על גבי ג'ל ההפרדה.
  8. מוסיפים מסרק לתא כדי ליצור את הבארות ומחכים שהג'ל לערום יתוקן לחלוטין.
  9. מניחים μL אחד של 1 M DTT לתוך צינור microcentrifuge עבור כל מדגם שבר שצריך לרוץ על הג'ל.
  10. הוסף 7 μL של מאגר טעינה 4x לכל צינור גם כן.
  11. הוסף 20 μL של מדגם מן השברים כי צריך להיות לרוץ על הג'ל לכל צינור microcentrifuge.
  12. וורטקס הצינורות המכילים את הדגימות.
  13. סובבו את צינורות הדגימה באמצעות מיקרוצנטריפוגה על השולחן במשך 3 שניות וודאו שכל הדגימה חזרה לתחתית הצינורות.
  14. הכינו את תא האלקטרופורזה של הג'ל על ידי אבטחת קלטת ג'ל פוליאקרילמיד 12% למקומו ומילוי התאים הפנימיים והחיצונים של התא במאגר Tris-acetate-EDTA (TAE)(טבלה 1).
  15. טען את סמן המשקל המולקולרי לנתיב הראשון של הג'ל עם הנפח המתאים הנדרש על פי הוראותיו.
  16. טען 28 μL של המדגם מכל צינור מעורבב עם DTT ומאגר טעינה.
  17. הנח את המכסה של תא האלקטרופורזה על גבי התיבה וחבר את המכסה לאספקת החשמל.
  18. הפעל את ספק הכוח והגדר אותו ל- 100 V ואפשר לו לפעול במשך 20 דקות.
  19. לאחר 20 דקות, להגדיל את זרם אספקת החשמל ל 140 V ולהמשיך להפעיל אותו עוד 30-40 דקות או עד הלהקה של צבע מאגר טעינה מגיע לתחתית קלטת הג'ל.
  20. לאחר השלמת כתם אלקטרופורזה ו de-stain הג'ל כדי לדמיין את רצועות החלבון הכלולות בתוך הג'ל.

5. טיהור חלבונים באמצעות DDM

הערה: מטרת ביצוע תהליך טיהור זה היא לשמש כבקרה לניסויים העושים שימוש בפולימרים הפעילים של הממברנה.

  1. Resuspend 6-10 גרם של גלולת ממברנה, משלב 2.6, ב DDM Buffer A (טבלה 1) באמצעות 5 מ"ל / גרם של גלולת ממברנה.
  2. הומוגניזציה מדגם resuspended עם homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.
  3. להעביר מדגם 50 מ"ל של צינור פוליפרופילן ולהוסיף DDM ומאגר DDM נוסף A להביא את המדגם לריכוז הסופי של 2% DDM.
  4. לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. טען את הדגימה לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה עבור 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס ו 150,000 x גרם.
  6. בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל להכין את 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA על ידי כביסה עם 25 מ"ל של מאגר DDM A (טבלה 1).
  7. לאחר השלמת ultracentrifugation, לאסוף את supernatant ולהעמיס אותו על 5 מ"ל Ni-NTA עמודה ב 4 °C (69 °F) עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.
  8. שטיפת קווי FPLC עם מספיק DDM Buffer B + 0.05% DDM (טבלה 1)כדי לרוקן לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.
  9. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM B + 0.05% DDM עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  10. לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM C + 0.05% DDM (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.
  11. יש לטבול את החלבון ב-20 מ"ל של DDM Buffer D + 0.05% DDM(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הזרימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.
  12. בחר את השברים המכילים את שיא elution עבור איגום והתרכזות באמצעות רכז צנטריפוגלי צנטריפוגה ב 4,000 x g ו 4 °C (60 °F) עד להגיע 500 μL.
  13. באמצעות לולאת μL 500 לטעון את המדגם לתוך מכונת FPLC ולאחר מכן על עמודת אי הכללה בגודל 25 מ"ל ב 4 °C (69 °F). יש להשתמש ב-30 מ"ל של DDM Buffer E + 0.05% DDM (טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף כשברים כשגדלי השבר מוגדרים כ- 0.5 מ"ל לשבר.
  14. קח את השברים ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות ספיגה של 280 ננומטר כדי לאשר עקומת UV-Vis מגרף elution FPLC.
  15. לאסוף 20 μL מכל שבר מדגם התואמים פסגות שנצפו על גרף elution FPLC ואושרו להיות מדויק עם בדיקת הספיגה.
  16. להקפיא את שאר שברי מדגם אלה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש aliquots הרצוי ולאחסן דגימות חלבון ב -80 מעלות צלזיוס.
  17. הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE כפי שתואר קודם לכן כדי לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.

6. הכנת רשת כתמים שלילית

  1. מניחים את הרשתות כי הם הולכים לשמש להכנת מדגם על שקופית זכוכית עטוף נייר מסנן עם צד הפחמן פונה כלפי מעלה.
  2. מניחים את שקופית הזכוכית עם רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים לתוך התא של הפרש זוהר בין שתי האלקטרודות ולהחליף את מכסה הזכוכית לוודא שהוא ממורכז ואטום היטב.
  3. הפעל את מכונת פריקת הזוהר וודא שהאור הסגול שנוצר על-ידי הפלזמה נראה לעין.
  4. כאשר המכונה נעשית פועל, לחכות עד התא הגיע ללחץ אטמוספרי כדי להסיר את מכסה הזכוכית ולאחר מכן להחזיר את השקופית עם הרשתות לספסל שבו דגימות יהיה טעון עליהם.
  5. להתאים את הריכוז של דגימות חלבון מטוהרים על 0.1 מ"ג / מ"ל על ידי דילול המדגם עם המאגר המתאים או להתרכז באמצעות רכז צנטריפוגלי.
  6. לטעון 3.5 μL של דגימת חלבון על רשת פחמן 10 ננומטר עבה ולחכות 1 דקות.
  7. הסר את הנוזל מפני השטח של רשת EM עם נייר מסנן.
  8. לשטוף את משטח הרשת 3x על ידי להרים 3 טיפות μL של מים עם הרשת והסרת המים מהרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.
  9. לשטוף את משטח הרשת 2x על ידי להרים 3 טיפות μL של טרי, מסונן 2% אורניום אצטט ולהסיר את פתרונות לשטוף על הרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.
  10. הכתים את הרשת עם טיפה 3 μL של טרי, מסונן 2% אצטט אורניום במשך 1 דקות.
  11. הסר את פתרון אצטט אורניום על פני השטח של רשת EM עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשת לפחות 1 דקות.
  12. אחסן את הרשת בתיבת רשת לשימוש במועד מאוחר יותר.

7. הדמיה EM

  1. טען את הרשת המוכנה למחזיק הרשת בשולחן עבודה בטוח.
  2. מכינים את המיקרוסקופ על ידי הצבת המיקרוסקופים dewar לתוך תיבת פוליסטירן ולמלא את dewar 3/4th מלא חנקן נוזלי.
  3. ודא כי כיסוי הגומי של חלון המיקרוסקופ מכסה אותו ולאחר מכן לטעון את dewar על המיקרוסקופ על ידי הצבת חוטי נחושת לתוך dewar עד שהוא מתאים על הפלטפורמה.
  4. ממלאים את שארית החנקן בנוזל ומניחים כובע על גבי ה dewar כדי לכסות אותו.
  5. להפעיל את המתח הגבוה, להתנות את המיקרוסקופ, ולחכות מיקרוסקופ להתחמם וליצור רמת ואקום בטוח לשימוש.
  6. ברגע שהמיקרוסקופ מוכן לפתוח את שסתום העמודה ולאשר את הקרן קיימת על ידי הסרת כיסוי הגומי על חלון המיקרוסקופ.
  7. בדוק את סטיגמות הקרן על ידי התפשטות פנימה והחוצה על ידי התאמת עוצמת הקרן. אם אסטיגמציה קיימת הקרן תהיה צורה אליפטית כמו אחד נע מן הצלבה ואת הקרן צריכה להיות באותה צורה אליפטית משני הצדדים.
  8. התאם את משקפת המיקרוסקופ כך שתהיה הגובה והמרחק הנכונים לפי עיניו של הצופה.
  9. בדוק את מיקום הקרן עבור מצבי חיפוש, מיקוד וחשיפה על-ידי רכיבה על אופניים בכל שלושת המצבים עד שהקרן תמרכז בכל אחד מהם.
  10. סגור את שסתום העמודה והמשך לטעון את מחזיק הרשת למיקרוסקופ האלקטרונים.
  11. התאם את המיקרוסקופ לגובה האוצנטרי באמצעות התכונה microscopes wobbler והתאמת תנועת הבמה באמצעות ציר Z עד שלא תהיה תנועה מצד לצד של המדגם במרכז.
  12. באמצעות מצב חיפוש במינון נמוך על מיקרוסקופ לחפש את הרשת עבור אזור רצוי של ניגודיות סבירה עם מולקולות מדגם נוכח להתמקד במדגם.
  13. התמקד בדוגמה במצב מיקוד באמצעות גודל שלב גבוה עד שהדוגמה תיראה ולאחר מכן הקטן שלבים למציאת רמת המוקד הנכונה.
  14. אפס וריק הקרן ולאחר מכן להיות בטוח כרית הגומי מכסה את חלון המיקרוסקופ.
  15. במצב חשיפה, צלם את התמונה של אזור הרשת הרצוי לחשיפה של 1 שניות בהגדלה של 62,000x ובדוק את התמונה שהתקבלה.
  16. כאשר נעשה הדמיה רשת לסגור את שסתומי העמודה ולהסיר את מחזיק הרשת מהעמודה.
  17. כאשר סיים לדמיין את כל רשתות העניין לכבות את המיקרוסקופ על ידי כיבוי כוח חוטים והסרת חנקן נוזלי dewar מן המיקרוסקופ.
  18. מניחים משהו לספוג לחות על הדוכן שבו דיואר ישב לתפוס עיבוי מן סלילי הנחושת של המיקרוסקופ.
  19. הפעל את מצב מחזור Cryo וודא שמשאבת הטורבו כבויה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות ההליכים המוצגים כאן, דגימות של סוג פראי E. coli AcrB ו E. coli מוטציה AcrB-P223G טוהרו. הדגימות נספגו אז לרשתות מיקרוסקופיות של אלקטרון כתם שלילי פחמן ומוכתמות באמצעות אורניל אצטט בשיטת הכתםהצדדית 22. תמונות כתם שליליות נאספו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. תמונת הכתם השלילית של דגימת סוג הבר AcrB המטוהרת באמצעות DDM חושפת פתרון הומוגני של חלקיקים חד-ממדיים כאשר החלבון מציג מבנה רבעוני שלישוני מוגדר היטב (איור 1A). מבנים טרימריים אלה תואמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון חלבון חשובות לשלמות המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה. גישות רבות פותחו כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלבון. בהשוואה לחלבונים מסיסים, חלבוני ממברנה ו- PPIs שלהם קשה יותר ללמוד בשל המאפיינים המהותיים הייחודיים של חלבוני ממברנה. קושי זה נובע בעיקר מהדרישה של חלבוני ממברנה להיות מוטבע בסביבה bilayer השומנים המקומי עבור יציבות מבנית ופונקציונליות. זה הופך להיות בעייתי כי על מנת לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של החלבונים הם חייבים להיות מופקים מן קרום התא. FRET כבר טכנולוגיה פופולרית לחקור אינטראקציות חלבון חלבון על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

י.ג. רשום כממציא מערכת הפולימר הפעילה של הממברנה NCMNP5-2 ו- NCMN.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארט-אפ VCU (לי.ג.) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01GM132329 (ל- Y.G.) התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים למונטסראט סאמסו וקווין מקרוברטס על תמיכתם הנדיבה בהקלטת וידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כימיקלים
30% אקרילאמיד/BIS SOL (37.5:1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli Sample Buffer (מאגר טעינה)Bio-Rad1610747
חומצה אצטית GlacialThermoFisher ScientificA38S-212
אמוניום פרסולפט (APS)Bio-Rad161-0700
ChloramphenicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 אבקת כתמי חלבוןBio-Rad161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% טהור) ללא פרוטאזGoldbioDTT10
גליצרולThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisherScientific BP310-1
ImidazoleAffymetrix17525 1 ק"ג
IPTGGoldbioI2481C100
Kanamycin GoldbioK-120-25
מגנזיום כלוריד הקסהידרטThermoFisher ScientificAA3622636
מתנולThermoFisher ScientificA412-4
N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2עדיין לא זמין מסחריתהגש בקשה להשגה למחבר
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray Valleyהגש בקשה להשגה למחבר
נתרן כלוריThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Broth MediaAffymetrix75856 1 ק"ג
Tris BaseBio-Rad161-0719
אורניל אצטטאמבינטרAmb22348393
<חזק>ציוד
Avanti J-26S XPIבקמן קולטרB14538
Avanti JXN-30בקמן קולטרB34193
רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים פחמן (10 ננומטר)מדעי מיקרוסקופ אלקטרוניםCF300-Cu-TH
הומוגנייזר רקמות מומנטאברבךE7265
Corning LSE Mini MicrocentrifugeThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
Fraction Collector F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטרThermoFisher ScientificND-2000
אופטימה L-90K אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרPN LL-IM-12AB
PELCO easiמערכת ניקוי פריקת זוהרזוהר טד פלה91000S-230
מטחנת רקמות טחינה בטוחה של Potter-Elvehjem Wheaton358013
PowerPac ספק כוח בסיסיBio-Rad164-5050
Razel R99-E משאבתמזרק במהירות משתנהRazel Scientific Instruments
Superdex 200 להגדיל 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Type 70 Ti רוטור זווית קבועהבקמן קולטר
<חזק>חומרים כלליים
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהThermoFisher Scientific05-408-129
4 מ"ל Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA טהור 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 עמודה מ"לGE Healthcare Life Sciences17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
המקביל המקביל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50(2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390(2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Membrane Protein InteractionsElectron Microscopy AnalysisOligomeric State DeterminationMembrane Active PolymerNickel NTA ChromatographyNegative Stain GridsSize Exclusion ChromatographySDS PAGE AnalysisCryo Electron Microscopy

מאמרים קשורים