הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

4.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61299

⸱

2 ביולי 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (>90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.

תקציר

מחלת כליות משפיעה על יותר מ -10% מהאוכלוסייה העולמית ועולה מיליארדי דולרים בהוצאות פדרליות. הצורות החמורות ביותר של מחלת כליות ואי ספיקת כליות סופנית בסופו של דבר נגרמות לעתים קרובות על ידי הנזק לפודוציטים גלומרולריים, שהם תאי האפיתל המיוחדים ביותר המתפקדים יחד עם תאי אנדותל וקרום המרתף הגלומרולרי כדי ליצור את מחסום הסינון של הכליה. ההתקדמות ברפואה הכליתית הופרעה על ידי הזמינות המוגבלת של רקמות ראשוניות והיעדר שיטות חזקות להפקת תאי כליות אנושיים פונקציונליים, כגון פודוקיטים. היכולת להפיק פודוקיטים ממקורות מתחדשים, כגון תאי גזע, יכולה לסייע בקידום ההבנה הנוכחית של מנגנוני התפתחות הכליות והמחלות האנושיות, וכן לספק כלים חדשים לגילוי טיפולי. מטרת פרוטוקול זה הייתה לפתח שיטה להפקת פודוקיטים בוגרים, פוסט-מיטוטיים מתאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם עם יעילות וספציפיות גבוהות, ובתנאים מוגדרים כימית. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS המיוצרים בשיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לשושלת היוחסין (כולל נפרין, פודוקין וגידול 1 של וילם) ומציגים את המאפיינים המורפולוגיים המיוחדים (כולל תהליכי כף הרגל הראשוניים והמשניים) הקשורים לפודוציטים בוגרים ופונקציונליים. באופן מסקרן, תכונות מיוחדות אלה נעדרות באופן בולט בקו התא הפודוקיט המונצח הנמצא בשימוש נרחב בתחום, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המתואר כאן מייצר פודוקיטים של כליות אנושיות שיש להן פנוטיפ בוגר יותר מבחינה התפתחותית מאשר קווי התאים הפודוקיטים הקיימים המשמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה של כליות אנושיות.

מבוא

ההתקדמות בתרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים צפויה לחולל מהפכה ברפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וסינון תרופות על ידי מתן מקור מתחדש ומדרגי של חומר ביולוגי שניתן להנדס כדי להשיג כמעט כל סוג תא בגוףהאדם 1. אסטרטגיה זו שימושית במיוחד להפקת סוגי תאים מיוחדים ופונקציונליים שאחרת היה קשה להשיג. תאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם2,3,4,5 הם אטרקטיביים במיוחד בשל מוצא התא הסומטי שלהם ואת הפוטנציאל שהם מייצגים לרפואה מותאמת אישית. עם זאת, פיתוח שיטות לגזור שושלות תאים אחרות מתאי hiPS נשאר מאתגר בשל השימוש התכוף בתנאי תרבות מוגדרים בצורה גרועה אשר מוביל ליעילות נמוכה ודור לא ספציפי של אוכלוסיות תאים הטרוגניים6,7.

מוצג כאן היא שיטה לגירוש של podocytes כליות בוגרות מתאי hiPS עם ספציפיות ויעילות גבוהה בתנאים מוגדרים כימית. על ידי בחינת התפקידים של גורמים מרובים בתוך microenvironment התא, אסטרטגיית בידול תאי גזע פותחה כי מעורבים אופטימיזציה של גורמים מסיסים המוצגים במדיום תרבית התא, כמו גם גורמים בלתי מסיסים, כגון רכיבי מטריצה חוץ תאית או מצעים דבק. בהתחשב בחשיבות האיתות האינקגרי בהתפתחות ובתפקוד של הפודוקיטה, הביטוי של קולטנים integrin על פני התא נבדק בתחילה. β1 integrins באו לידי ביטוי מאוד לא רק בתאי hiPS, אלא גם בנגזרותיהם כולל mesoderm ותאי mesoderm ביניים8,9,10. ניסויים הבאים אישרו כי ליגנדים שנקשרים לאינטגרינים β1 (כולל למינין 511 או למינין 511-E8) תומכים בהידבקות ובידול של תאי hiPS לפודוציטים כאשר נעשה בהם שימוש בשילוב עם המדיה האינדוקטיבית המסיסה המתוארת להלן.

אינדוקציה של מחויבות שושלת התאים יזמה על ידי אישור תחילה כי תאי hiPS בתרבית על המשטחים מצופים למינין במשך יומיים בנוכחות מדיום המכיל Activin A, CHIR99021, ומעכב סלע Y27632 יכול להבדיל לתאים המבטאים את סמני mesoderm מוקדם HAND1, עור ברווז, brachyury8,11. טיפול בתאי mesoderm במשך 14 ימים עם מדיום בתוספת חלבון מורפוגנטי עצם 7 (BMP-7) ו CHIR99021 אפשר את הנגזרת של תאי mesoderm ביניים שביטא את סמני תא נפרון-אבות גידול 1 (WT1), חלבון קשור דילוג מוזר 1 (OSR1)8,11, ואת הגן תיבת מזווג 2 חלבון (PAX2)12. כדי להפיק את הפודוקיטים הגלומרולריים הבוגרים של הכליות, תאי המסודרם הבינוניים טופלו במשך 4-5 ימים במדיום חדשני המורכב מ- BMP-7, Activin A, גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), חומצה ריטינואיתטרנסית ו- CHIR99021. ציטומטריית זרימה וחיסון שימשו כדי לאשר כי >90% מהתאים המתקבלים הציגו את המאפיינים המולקולריים, המורפולוגיים והתפקודיים של פודוקייט הכליות הבוגר8,11,13. מאפיינים אלה כוללים התפתחות של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל; הביטוי של גנים ספציפיים לשושלת שושלת פודוקיטים כולל SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 וביטוי של חלבונים כולל פודוקין, נפרין, ו WT114,15,16. בנוסף, נמצא כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS ניתן לשמור בתרבות עד ארבעה שבועות במבחנה באמצעות בינוני זמין מסחרית 8,11 אשר מספקגמישותנוספת בתזמון של ניסויים במורד הזרם. לקבלת מידע נוסף לגבי לוחות ציטומטריית הזרימה המשמשים לקביעת טוהר ה- hiPS-podocytes, עיין בפרסום הקודם שלנו11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

  1. לדלל 5x hiPS תרבית תאים מדיה (CCM) תוספת במדיום בזלת תרבית התא hiPS כדי להשיג פתרון 1x של hiPS CCM.
    הערה: תוספת CCM קפואה של 5x hiPS דורשת תהליך הפשרה איטי, באופן אידיאלי ב-4 °C (70°F) למשך הלילה. Aliquots של 1x hiPS CCM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 °C (70 °F).
  2. הכנת מטריצת קרום המרתף (BM) 1 מצופה צלחות עבור תרבית התא hiPS: מטריצת BM להפשיר 1 לילה על קרח ב 4 °C (70 °F). לאחר הפשרה, להכין aliquots עם גורמי דילול מתאימים כפי שהוצע על ידי היצרן.
    הערה: בדרך כלל, aliquots מוכנים לדילול הבא ב 25 מ"ל של DMEM קר / F12 בצינור חרוט 50 מ"ל ואחריו ערבוב יסודי כדי להמיס לחלוטין את מטריצת BM 1 ולהימנע היווצרות של גבישים שיורית.
  3. העבר 1 מ"ל של פתרון מטריצת BM 1 לכל באר של צלחת 6 טוב ודגרה ב 37 °C (1-2 שעות) או ב 4 °C (55 °F) לכל הפחות של 24 שעות, עטוף בסרט פרפין. מטריצת BM 1 -מצופה לוחות ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד 2 שבועות.
  4. הכנת מטריצת קרום מרתף (BM) 2 - לוחות מצופים: לדלל כמויות מתאימות של מטריצת BM 2 במים מזוקקים סטריליים 9 מ"ל כדי להכין ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל. הוסף 700 μL של פתרון מטריצת BM 2 לכל באר של צלחת 12 היטב ולדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות או לילה ב 4 °C (7 °F).
  5. הכן 100 פתרונות מלאי מיקרוגרם / mL כל BMP7, Activin A, ו VEGF כדלקמן: reconstitute BMP7 במים מזוקקים סטריליים המכילים 0.1% (wt/ vol) BSA ו Activin A ו- VEGF משוחזר בנפרד PBS סטרילי המכיל 0.1% (wt / vol) BSA. כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה תכופים, להכין 100 aliquots μL מכל פתרון מלאי ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.
  6. הכן פתרון מלאי 10 mM של Y27632 על ידי המסת 10 מ"ג של Y27632 ב 3.079 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים. Aliquot 100 μL מהמלאי ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.
  7. להמיס 2 מ"ג של CHIR99021 ב 143.4 μL של DMSO סטרילי כדי להכין פתרון מלאי 30 mM. הכן 5 עליקוטים μL ולאחסן ב -20 °C (5 °F) עד חודש אחד (או על פי המלצת היצרן).
  8. יש להמיס 10 מ"ג של חומצהרטינואית טרנסית ב-DMSO סטרילי 3.33 מ"ל. הכן 500 עליקוטים μL ולאחסן ב -20 °C (50 °F) עד 6 חודשים.

2. הכנת מדיה תרבותית

  1. הכן את מדיום בידול mesoderm על ידי שחזור פתרונות מלאי מתאימים לריכוז סופי של 100 ng / mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632, 1x B27 ללא סרום תוספת בנפח מתאים של DMEM/12 עם תוסף גלוטמין.
    הערה: מדיום בידול mesoderm צריך להיות מוכן טרי לפני צעדי בידול ובנפח המתאים בקנה המידה של הניסוי (בדרך כלל, 50 מ"ל של בינוני מתאים עבור שתי 12 לוחות היטב).
  2. הכן בינוני בידול מסודרם ביניים על ידי שחזור פתרונות מלאי מתאימים לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מ"ל BMP7, 3 μM CHIR99021 ותוספת 1x B27 ללא סרום ב- DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין.
    הערה: במידת הצורך, ניתן להשלים את המדיום עם 1% (vol/vol) פניצילין-סטרפטומיצין. כוונן את עוצמת המדיום באמצעות DMEM/F12 עם תוספת גלוטמין. מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות; עם זאת, מומלץ לאחסן aliquots קטן יותר (למשל, 45 מ"ל ב 50 mL צינורות חרוט) כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה חוזרים ונשנים. מדיה זו יכולה להיות מאוחסנת ב -20 °C (50 °F) עד 3 חודשים וניתן להפשיר אותה ב 4 °C (55 °F) לילה לפני השימוש.
  3. הכן את מדיום האינדוקציה podocyte על ידי reconstiting לריכוז הסופי 100 ng / mL BMP7, 100 ng / mL activin A, 50 ng / mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 ללא סרום תוספת, ו 0.1 μM כל טרנס חומצה רטינואית DMEM / F12 עם תוספת גלוטמין. להגן על בינוני מפני אור (למשל, על ידי עטיפה מיכל עם נייר כסף).
    הערה: מדיום זה יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות ומאוחסנים בחושך ב -20 °C (50 °F) עד 3 חודשים. עליקוט קפוא יש להפשיר לילה בשעה 4 °C (70 °F) לפני השימוש.
  4. הכן 25 מ"ל של פתרון נטרול טריפסין על-ידי הוספת 10% (vol/vol) חום מומת FBS ב- DMEM / F12 ומסנן בתנאים סטריליים.
  5. לתחזוקה לאחר בידול של פודוקיטים שמקורם בתאי גזע, הכינו את Complete Medium עם מדיית התחזוקה של הפודוקיטים על ידי הוספת התוספת למדיום הבזל לפי הנחיות היצרן, ואחסנו ב-4 °C (7°F) למשך עד שבועיים.

3. תרבית תאי HIPS ללא מאכיל באמצעות מדיום תרבית תאים hiPS

  1. שאפו את התמיסה השיורית של מטריצת BM 1 מהצלחות המצולפות מראש ושטפו את הבארות 3 פעמים עם 1 עד 2 מ"ל של DMEM / F12 מחומם.
  2. שאיפה בילה hiPS CCM מתאי hiPS ולשטוף את התאים 3 פעמים עם DMEM / F12 מחומם. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים חמים ודגרה במשך 1 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי לעזור לנתק את התאים. בצע בדיקה חזותית של תאים תחת מיקרוסקופ תרבית רקמות וודא כי הקצוות של מושבות התא מופיעים מעוגלים, ולאחר מכן במהירות לשאוף את פתרון ניתוק התאים מהתאים (להבטיח כי מושבות התא עדיין מחוברים לצלחת, אם כי באופן רופף). יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת באמצעות DMEM/F12 כדי להסיר את פתרון ניתוק התאים.
  3. הוסף 3 מ"ל של hiPS CCM לתאי hiPS (בכל באר של צלחת 6-well) שטופלו בתמיסת ניתוק התא. לגרד מושבות באמצעות מרים תא, בעדינות pipette תא השעיה למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים דבוקים באופן רופף. לשטוף את הצלחת ביסודיות כדי להבטיח את כל התאים נקצרים.
    הערה: מומלץ להשתמש בצינור 5 מ"ל כדי למנוע גיזמה עודפת על התאים.
  4. העבר 0.5 מ"ל של השעיית התא לתוך כל באר של צלחת חדשה של מטריצת BM 1 מצופה 6-באר המכיל 2 מ"ל של hiPS CCM לבאר. הזז את הצלחת בצורה איור-שמונה כדי להפיץ מושבות תאים בתוך בארות ודגורה ב 37 °C בחממה 5 % CO2. רענן מדי יום עד שהתאים יהיו מוכנים למעבר או לשימוש לניסוי הבידול (כ-70% השפעה).
    הערה: גודל המושבה האידיאלי עבור passaging שגרתי של iPSCs הוא בין 200-500 מיקרומטר בתנאים ללא מאכיל באמצעות hiPS CCM (ללא מעכב ROCK). אם תאים הם אינדיבידואליים במהלך הטיפול עם אנזימי דיסוציאציה או מאגרים, hiPS CCM ניתן להשלים עם מעכב ROCK (למשל, 10 μM Y27632) כדי לשפר את הכדאיות התא.

4. בידול של תאי hiPS לתאי mesoderm (ימים 0-2)

  1. בעוד תרביות התא hiPS נמצאות בשלב הצמיחה המעריכי (בערך בתוך 4 ימים של תרבות לאחר המעבר, וכ -70% השפעה), לבדוק חזותית את נוכחותם של תאים מובחנים באופן ספונטני בתוך ומסביב לקצוות המושבות. במידת הצורך, א-פסטי לגרד את אזורי בידול.
  2. שאפו ל-HIPS CCM מתאי HIPS ושטפו את התאים 3 פעמים ב-DMEM/F12 חם. לדגור על התאים עם 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תאים ללא אנזימים במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F) ולבדוק את הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. עקב הבדלים אינהרנטיים בין קווי תא hiPS שונים, יש לקבוע את זמן הדגירה בפועל עבור מאגר דיסוציאציה של התא עבור קו תא נתון.
  3. לגרד בעדינות את הבאר עם מרים תא כדי לשחרר תאים דבוקים באופן רופף ולהעביר את השעיית התא לצינור חרוטי 15 מ"ל, ואחריו צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להתאים אישית את תאי hiPS.
    1. הביאו את מתלה התא לנפח של 15 מ"ל עם DMEM/F12 חם וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-290 x גרם בטמפרטורת החדר.
    2. שאפו בעדינות את supernatant ו resuspend התאים עם DMEM חם / F12 לסיבוב נוסף של צנטריפוגה כדי להסיר את שאריות מטריצת BM 1 ורכיבי חיץ דיסוציאציה.
  4. שאפו את תאי העל והתוכן מחדש ב-1 מ"ל של מדיום אינדוקציה מסודרמי כמתואר לעיל. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer או מונה קולטר כדי לקבוע את הנפח המתאים של מדיום בידול mesoderm הדרוש כדי להשיג ריכוז של 1 x 105 תאים / מ"ל.
  5. שאפו את תמיסת ECM מלוחות המטריצה עם 2 מצופים של BM ושטפו את הצלחות פעמיים ב-DMEM/F12 חם. מערבבים את ההשעיה של תאי HIPS בעדינות על ידי צנרת כמה פעמים. מעבירים מ"ל אחד של מתלה התא לכל באר של צלחות 12-באר מטריצת BM מצופה 2 ולאחר מכן בעדינות לנער את הצלחות כדי להפיץ את התאים באופן שווה יותר.
  6. לדגור על הצלחת ב 37 °C (5° C) אינקובטורCO 2. רענן את מדיום האינדוקציה mesoderm למחרת.
    הערה: לאחר יומיים, תאי mesoderm שמקורם בתא hiPS יהיו מוכנים לאינדוקציה מסודרם ביניים.

5. בידול של תאי mesoderm שמקורם בתא hiPS למסודרם ביניים (ימים 2-16)

  1. ביום 2 של פרוטוקול הבידול, לשאוף mesoderm אינדוקציה בינונית ולחדש עם 1 מ"ל לכל מדיום אינדוקציה mesoderm ביניים היטב.
  2. רענן מדיום כל יום כדי לשמור על סף מדויק של גורמי גדילה ומולקולות קטנות עבור התאים הפעילים מטבולית. אם יש צמיחת תאים משמעותית דלדול מהיר של חומרים מזינים מדיה (מסומן על ידי הצהבה של התקשורת), נפח בינוני בידול mesoderm ניתן להגדיל ל 1.3 מ"ל לכל באר של 12 לוחות היטב.
  3. תאי תרבות במשך 14 ימים נוספים כדי להשיג תאי mesoderm ביניים. ביום 16, תאים אלה יכולים להיות cryopreserved לשימוש מאוחר יותר.

6. הבחנה בין תאי mesoderm מתווכים שמקורם בתא HIPS לפודוציטים (ימים 16 עד 21)

  1. לשטוף את תאי mesoderm ביניים עם DMEM חם / F12 ואחריו דגירה של התאים עם 0.5 מ"ל לבאר של 0.05 % טריפסין-EDTA במשך 3 דקות ב 37 °C (5 ).C (70 °F). בצע בדיקה חזותית כדי לוודא שהתאים מתחילים להתנתק.
  2. לגרד תאים באמצעות מרים תא pipette השעיית התא מספר פעמים באמצעות קצה 1,000 μL pipette כדי להשיג אינדיבידואלי (או גושים קטנים של) תאים.
    הערה: בשלב זה, ודא כי התאים מנותקים לחלוטין כמו תאים מצטברים עלול להיכשל ברכישת פנוטיפ מובחן סופני בתוך ציר הזמן של הפרוטוקול.
  3. הוסף כ 2 מ"ל לבאר של פתרון נטרול טריפסין כדי לעצור את הפעילות של טריפסין.
  4. העבר תאים לצינור חרוטי 50 מ"ל ולהביא את הנפח עד 50 מ"ל באמצעות DMEM / F12, ולאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 201 x g בטמפרטורת החדר.
  5. שאפו את תאי העל והתוכן מחדש במדיום האינדוקציה של הפודוקיט. לקבלת תוצאות מיטביות, להבטיח צפיפות זריעה סופית של כ 100,000 תאים / באר של צלחת 12 היטב. הוסף את מתלה התא ללוחות מצופים 2 מטריצת BM ונער בעדינות את הצלחת כדי לעזור להפיץ את התאים באופן שווה יותר.
  6. דגירה תאים ב 37 °C ו 5% CO2 לרענן בינוני מדי יום עד 5 ימים כדי לקבל podocytes ביום 21.
    הערה: פודוקיטים שמקורם בתא hiPS וכתוצאה מכך ניתן לשמור בתרבות במשך 2-4 שבועות נוספים באמצעות מדיום מלא עם מדיה תחזוקה podocyte. פעם אחת במדיה תחזוקה podocyte, התאים ניתן להאכיל כל יומיים, עשוי לשמש למחקרים הבאים או ניתוחים במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת פרוטוקול זה הייתה להדגים כי פודוקיטים אנושיים בוגרים יכולים להיגזר מתאי hiPS בתנאים מוגדרים כימית. הנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות קו התא DU11 hiPS17, אשר נבדקו לראשונה, ונמצאו נקיים ממיקופלסטיסמה. ניתוח כרומוזומלי בוצע גם, והתאים נמצאו תקינים קריוטיפיים. החל מתאי ה-DU11 hiPS הלא מובחנים, אסטרטגיית הבידול (איור 1)המתוארת בדו"ח זה הועסקה תחילה כדי להבדיל בין תאי הגזע (איור 2A) לתא מסודרם המבטאים ברכיורי (T) (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוקיטים גלומרולריים בכליות מתאי hiPS. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS מציגים תכונות מורפולוגיות ומולקולריות הקשורות לפנוטיפ פודוקיט הכליות הבוגר13. בפרסומים קודמים, הראינו כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS יכולים לחקות את המבנה ואת פונקציית הסינון הסלקטיבי של הגלומרולוס של הכליות כאשר הם מתורבתים יחד עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים גלומרוליים במכשיר איברים על שבב מיקרופלואידי זלוף8,11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

S.M. הוא מחבר על פטנט הממתין לשיטות ליצירת פודוקיטים כליות מתאי גזע פלוריפוטנטים (בקשת פטנט בארה"ב 14/950859). המחברים הנותרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר פראט להנדסה באוניברסיטת דיוק, המחלקה לנפרולוגיה בבית הספר לרפואה דיוק, פרס מחקר של יו"ר מהמחלקה לרפואה באוניברסיטת דיוק, ופרס מעבר קריירה PDEP של קרן בורוז וולקום ל- S.M. M.B נתמך על ידי תכנית מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע. אנו מודים למעבדת בורסאק על שסיפקה לנו בנדיבות את קו תאי הגזע DU11, ואת מעבדת ורגזה באוניברסיטת דיוק על שיתוף זמני של מתקן תרבות הרקמות שלהם עם הקבוצה שלנו. פרסום זה מוקדש לפרופ' לורה ל. קסלינג, פרופסור נוברטיס לכימיה במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, לרגל יום הולדתה ה-60.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<תאים חזקים>
DU11 תאיקו תאי iPS של DU11 (שיבוט אוניברסיטת דיוק #11) נוצר במתקן הליבה iPSC של אוניברסיטת דיוק וסופק לנו על ידי מעבדת Bursac באוניברסיטת דיוק. קו זה נבדק למיקופלזמה ונבדק לאחרונה ביולי 2019 על ידי המעבדה שלנו, ונמצא תקין קריוטיפי.
<חזק>גורמי גדילה ותוספי מדיה
חומצה רטינואית All-trans (500 מ"ג)72262תוסף תזונה ללא סרום
17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004Stemgentעשוי להראות שונות מאצווה לאצווה
ערכה בינונית מלאה עם CultureBoost-R4Z0-500-Rמערכות תאיםאמצעי תחזוקה לפודוציטים
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 עם תוסף GlutaMAX10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 עם תוסף גלוטמין
FBS 10082147Thermo/Life Technologies
פעיל אנושי PHC9564Thermo/Life טכנולוגיות
BMP7 אנושיPHC9544טכנולוגיות
אנושי VEGFPHC9394טכנולוגיות תרמו/חיים
mTeSR1 בינוני05850טכנולוגיות תאי גזעמדיה לתרבית תאים hiPS (CCM)
פניצילין– סטרפטומיצין, נוזלי (100&)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 מעכב ROCK1254Tocris
<חזק>נוגדנים
Alexa Fluor 488– ו-Alexa Fluor 594– נוגדנים משניים מצומדיםA32744; A32754; A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R& D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
ECM מולקולות
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8)שבר N-892012Iwai צפון אמריקהמטריצת קרום מרתף (BM) 2
מטריצה מוסמכת hESC של מטריג'ל, בקבוקון 5 מ"ל354277BD Biosciencesמטריצת קרום הבסיס (BM) 1. עשוי להראות שונות מאצווה לאצווה
<חזק>אנזימים וריאגנטים אחרים
AccutaseA1110501Thermo/Life Technologiesתמיסת ניתוק תאים
BSAA9418סיגמא-אולדריץ
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)D2438סיגמא-אולדריץ'DMSO רעיל. יש לטפל במכסה המנוע של בטיחות כימית
מאגר דיסוציאציה של תאים נטולי אנזימים, האנק' מלח מאוזן13150016Thermo/Life Technologies
תמיסת אתנול, 70% (נפח/נפח), דרגת ביוטכנולוגיה97065-058VWRאתנול דליק ורעיל
FBS431097Corning
Paraformaldehyde (PFA)28906Thermo/Life Technologiesיש לטפל ב-PFA במכסה אדים כימי עם ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי ראייה בטיחותיים. יש להימנע משאיפה וממגע עם העור.
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
מים מזוקקים סטריליים15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Trypsin-EDTA, 0.05%25300-120Thermo/Life Technologies
Equipment
פיפטות שאיבה, עטופות בנפרד29442-462Corning
Avanti J-15R צנטריפוגהB99516בקמן קולטר
צינור צנטריפוגה חרוטי
המיקרוסקופ
הפלורסנט EVOS M7000AMF7000Thermo/Life Technologiesהמשמש לרכישת תמונות של תאי iPS קבועים ומוכתמים ונגזרותיהם
Hemocytometer100503-092חממת VWR
Heracell VIOS 160i CO251030403Thermo/Life Technologiesלתרבית ותחזוקה שגרתית של תאי iPS ונגזרותיהם
Zeiss Axio Observer הפוך מצויד במצלמת AxioCam 503491916-0001-000 (מיקרוסקופ) ; 426558-0000-000 (מצלמה)מיקרוסקופיה קרל זייסמשמש לרכישת תמונות ניגודיות פאזה של תאי iPS חיים ונגזרותיהם בכל שלב של התמיינות פודוציטים
כפפות ניטריל קימברלי-קלארק40101-346VWR
Kimwipes, גדול21905-049VWR
Kimwipes, קטן21905-026VWR
P10 קצות פיפטה מחסום מדויקP1096-FRדנוויל סיינטיפיק
P100 קצות פיפטה מחסוםP1125דנוויל סיינטיפיק
P1000 קצות פיפטה מחסוםP1126דנוויל סיינטיפיק
P20 טיפים לפיפטה מחסוםP1121דנוויל סיינטיפיק
P200 קצותפיפטה מחסוםP1122פיפטה סרולוגית מדעית
, 10 מ"ל, עטופה בנפרד356551פיפטה סרולוגית של קורנינג
, 25 מ"ל, עטופה בנפרד356525של קורנינג
5 מ"ל, עטופה בנפרד356543קורנינג
סטריפליפ, 0.22 μ m, PESSCGP00525EMD Millipore
צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים1138W14תומאס סיינטיפיקלציטוט גורמי גדילה
תרבית רקמות– צלחות 12 בארות מטופלות353043תרבית רקמות קורנינג
צלחות שש בארות מטופלות353046קורנינג
VWR לבן מעיל מעבדה techuni10141-342VWR
מרים תאים רחב משופע3008קורנינג
iPS אנושיים B27 של Stem Cell Technologies תרמו/חיים' צינור צנטריפוגה חרוטי , 352097 15 מ"ל קורנינג, 50 מ"ל 352098 קורנינג קריוקופסאות 3395465 טכנולוגיות תרמו/חיים לאחסון קפוא של דנוויל פיפטה סרולוגית ,

מקורות

  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145(1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
  7. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
  8. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
  9. Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
  10. Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
  11. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
  12. Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
  13. Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
  14. Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
  15. Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
  16. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
  17. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
  18. Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
  19. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  20. Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
  21. Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
  22. Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
  23. Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
  24. Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
  25. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

iPSodermWT1
הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.