מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (>90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלת כליות משפיעה על יותר מ -10% מהאוכלוסייה העולמית ועולה מיליארדי דולרים בהוצאות פדרליות. הצורות החמורות ביותר של מחלת כליות ואי ספיקת כליות סופנית בסופו של דבר נגרמות לעתים קרובות על ידי הנזק לפודוציטים גלומרולריים, שהם תאי האפיתל המיוחדים ביותר המתפקדים יחד עם תאי אנדותל וקרום המרתף הגלומרולרי כדי ליצור את מחסום הסינון של הכליה. ההתקדמות ברפואה הכליתית הופרעה על ידי הזמינות המוגבלת של רקמות ראשוניות והיעדר שיטות חזקות להפקת תאי כליות אנושיים פונקציונליים, כגון פודוקיטים. היכולת להפיק פודוקיטים ממקורות מתחדשים, כגון תאי גזע, יכולה לסייע בקידום ההבנה הנוכחית של מנגנוני התפתחות הכליות והמחלות האנושיות, וכן לספק כלים חדשים לגילוי טיפולי. מטרת פרוטוקול זה הייתה לפתח שיטה להפקת פודוקיטים בוגרים, פוסט-מיטוטיים מתאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם עם יעילות וספציפיות גבוהות, ובתנאים מוגדרים כימית. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS המיוצרים בשיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לשושלת היוחסין (כולל נפרין, פודוקין וגידול 1 של וילם) ומציגים את המאפיינים המורפולוגיים המיוחדים (כולל תהליכי כף הרגל הראשוניים והמשניים) הקשורים לפודוציטים בוגרים ופונקציונליים. באופן מסקרן, תכונות מיוחדות אלה נעדרות באופן בולט בקו התא הפודוקיט המונצח הנמצא בשימוש נרחב בתחום, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המתואר כאן מייצר פודוקיטים של כליות אנושיות שיש להן פנוטיפ בוגר יותר מבחינה התפתחותית מאשר קווי התאים הפודוקיטים הקיימים המשמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה של כליות אנושיות.
מבוא
ההתקדמות בתרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים צפויה לחולל מהפכה ברפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וסינון תרופות על ידי מתן מקור מתחדש ומדרגי של חומר ביולוגי שניתן להנדס כדי להשיג כמעט כל סוג תא בגוףהאדם 1. אסטרטגיה זו שימושית במיוחד להפקת סוגי תאים מיוחדים ופונקציונליים שאחרת היה קשה להשיג. תאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם2,3,4,5 הם אטרקטיביים במיוחד בשל מוצא התא הסומטי שלהם ואת הפוטנציאל שהם מייצגים לרפואה מותאמת אישית. עם זאת, פיתוח שיטות לגזור שושלות תאים אחרות מתאי hiPS נשאר מאתגר בשל השימוש התכוף בת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ריאגנטים
- לדלל 5x hiPS תרבית תאים מדיה (CCM) תוספת במדיום בזלת תרבית התא hiPS כדי להשיג פתרון 1x של hiPS CCM.
הערה: תוספת CCM קפואה של 5x hiPS דורשת תהליך הפשרה איטי, באופן אידיאלי ב-4 °C (70°F) למשך הלילה. Aliquots של 1x hiPS CCM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 °C (70 °F). - הכנת מטריצת קרום המרתף (BM) 1 מצופה צלחות עבור תרבית התא hiPS: מטריצת BM להפשיר 1 לילה על קרח ב 4 °C (70 °F). לאחר הפשרה, להכין aliquots עם גורמי דילול מתאימים כפי שהוצע על ידי היצרן.
הערה: בדרך כלל, aliquots מוכנים לדילול הבא ב 25 מ"ל של DMEM קר / F12 בצינור חרוט 50 מ"ל ואחריו ערבוב יסודי כדי להמיס לחלוטין את מטריצת BM 1 ולהימנע היווצרות של גבישים שיורית. - הע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מטרת פרוטוקול זה הייתה להדגים כי פודוקיטים אנושיים בוגרים יכולים להיגזר מתאי hiPS בתנאים מוגדרים כימית. הנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות קו התא DU11 hiPS17, אשר נבדקו לראשונה, ונמצאו נקיים ממיקופלסטיסמה. ניתוח כרומוזומלי בוצע גם, והתאים נמצאו תקינים קריוטיפיים. החל מתאי ה-DU11 hiPS הלא מובחנים, אסטרטגיית הבידול (איור 1)המתוארת בדו"ח זה הועסקה תחילה כדי להבדיל בין תאי הגזע (איור 2A) לתא מסודרם המבטאים ברכיורי (T) (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוקיטים גלומרולריים בכליות מתאי hiPS. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS מציגים תכונות מורפולוגיות ומולקולריות הקשורות לפנוטיפ פודוקיט הכליות הבוגר13. בפרסומים קודמים, הראינו כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS יכולים לחקות את המבנה ואת פונקציית הסינון הסלקטיבי של הגלומרולוס של הכליות כאשר הם מתורבתים יחד עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים גלומרוליים במכשיר איברים על שבב מיקרופלואידי זלוף8,11.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
S.M. הוא מחבר על פטנט הממתין לשיטות ליצירת פודוקיטים כליות מתאי גזע פלוריפוטנטים (בקשת פטנט בארה"ב 14/950859). המחברים הנותרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר פראט להנדסה באוניברסיטת דיוק, המחלקה לנפרולוגיה בבית הספר לרפואה דיוק, פרס מחקר של יו"ר מהמחלקה לרפואה באוניברסיטת דיוק, ופרס מעבר קריירה PDEP של קרן בורוז וולקום ל- S.M. M.B נתמך על ידי תכנית מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע. אנו מודים למעבדת בורסאק על שסיפקה לנו בנדיבות את קו תאי הגזע DU11, ואת מעבדת ורגזה באוניברסיטת דיוק על שיתוף זמני של מתקן תרבות הרקמות שלהם עם הקבוצה שלנו. פרסום זה מוקדש לפרופ' לורה ל. קסלינג, פרופסור נוברטיס לכימיה במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, לרגל יום הולדתה ה-60.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <תאים חזקים> | |||
| DU11 תאי | קו תאי iPS של DU11 (שיבוט אוניברסיטת דיוק #11) נוצר במתקן הליבה iPSC של אוניברסיטת דיוק וסופק לנו על ידי מעבדת Bursac באוניברסיטת דיוק. קו זה נבדק למיקופלזמה ונבדק לאחרונה ביולי 2019 על ידי המעבדה שלנו, ונמצא תקין קריוטיפי. | ||
| <חזק>גורמי גדילה ותוספי מדיה | |||
| חומצה רטינואית All-trans (500 מ"ג) | 72262 | תוסף תזונה ללא סרום | |
| 17504044 | Thermo/Life Technologies | ||
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | עשוי להראות שונות מאצווה לאצווה |
| ערכה בינונית מלאה עם CultureBoost-R | 4Z0-500-R | מערכות תאים | אמצעי תחזוקה לפודוציטים |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 עם תוסף GlutaMAX | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 עם תוסף גלוטמין |
| FBS 10082147 | Thermo/Life Technologies | ||
| פעיל אנושי PHC9564 | Thermo/Life טכנולוגיות | ||
| BMP7 אנושי | PHC9544 | טכנולוגיות | |
| אנושי VEGF | PHC9394 | טכנולוגיות תרמו/חיים | |
| mTeSR1 בינוני | 05850 | טכנולוגיות תאי גזע | מדיה לתרבית תאים hiPS (CCM) |
| פניצילין– סטרפטומיצין, נוזלי (100&) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 מעכב ROCK | 1254 | Tocris | |
| <חזק>נוגדנים | |||
| Alexa Fluor 488– ו-Alexa Fluor 594– נוגדנים משניים מצומדים | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM מולקולות | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) | שבר N-892012 | Iwai צפון אמריקה | מטריצת קרום מרתף (BM) 2 |
| מטריצה מוסמכת hESC של מטריג'ל, בקבוקון 5 מ"ל | 354277 | BD Biosciences | מטריצת קרום הבסיס (BM) 1. עשוי להראות שונות מאצווה לאצווה |
| <חזק>אנזימים וריאגנטים אחרים | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | תמיסת ניתוק תאים |
| BSA | A9418 | סיגמא-אולדריץ | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | D2438 | סיגמא-אולדריץ' | DMSO רעיל. יש לטפל במכסה המנוע של בטיחות כימית |
| מאגר דיסוציאציה של תאים נטולי אנזימים, האנק' מלח מאוזן | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| תמיסת אתנול, 70% (נפח/נפח), דרגת ביוטכנולוגיה | 97065-058 | VWR | אתנול דליק ורעיל |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | יש לטפל ב-PFA במכסה אדים כימי עם ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי ראייה בטיחותיים. יש להימנע משאיפה וממגע עם העור. |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| מים מזוקקים סטריליים | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| פיפטות שאיבה, עטופות בנפרד | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R צנטריפוגה | B99516 | בקמן קולטר | |
| צינור צנטריפוגה חרוטי | |||
| המיקרוסקופ | |||
| הפלורסנט EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | המשמש לרכישת תמונות של תאי iPS קבועים ומוכתמים ונגזרותיהם |
| Hemocytometer | 100503-092 | חממת VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 | 51030403 | Thermo/Life Technologies | לתרבית ותחזוקה שגרתית של תאי iPS ונגזרותיהם |
| Zeiss Axio Observer הפוך מצויד במצלמת AxioCam 503 | 491916-0001-000 (מיקרוסקופ) ; 426558-0000-000 (מצלמה) | מיקרוסקופיה קרל זייס | משמש לרכישת תמונות ניגודיות פאזה של תאי iPS חיים ונגזרותיהם בכל שלב של התמיינות פודוציטים |
| כפפות ניטריל קימברלי-קלארק | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, גדול | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, קטן | 21905-026 | VWR | |
| P10 קצות פיפטה מחסום מדויק | P1096-FR | דנוויל סיינטיפיק | |
| P100 קצות פיפטה מחסום | P1125 | דנוויל סיינטיפיק | |
| P1000 קצות פיפטה מחסום | P1126 | דנוויל סיינטיפיק | |
| P20 טיפים לפיפטה מחסום | P1121 | דנוויל סיינטיפיק | |
| P200 קצות | פיפטה מחסוםP1122 | פיפטה סרולוגית מדעית | |
| , 10 מ"ל, עטופה בנפרד | 356551 | פיפטה סרולוגית של קורנינג | |
| , 25 מ"ל, עטופה בנפרד | 356525 | של קורנינג | |
| 5 מ"ל, עטופה בנפרד | 356543 | קורנינג | |
| סטריפליפ, 0.22 μ m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים | 1138W14 | תומאס סיינטיפיק | לציטוט גורמי גדילה |
| תרבית רקמות– צלחות 12 בארות מטופלות | 353043 | תרבית רקמות קורנינג | |
| צלחות שש בארות מטופלות | 353046 | קורנינג | |
| VWR לבן מעיל מעבדה techuni | 10141-342 | VWR | |
| מרים תאים רחב משופע | 3008 | קורנינג |
מקורות
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
