מאמר שיטה

אלקטרואנצפלוגרמה וידאו רציפה במהלך היפוקסיה-איסכמיה בעכברים יילודים

DOI:

10.3791/61346

⸱

11 ביוני 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Virginia, 2Department of Neurology, University of Virginia, 3Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 4Brain Institute, University of Virginia, 5Department of Neuroscience, University of Virginia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר שיטה להקלטות EEG וידאו מתמשכות באמצעות אלקטרודות עומק מרובות בעכברים יילודים העוברים היפוקסיה-איסכמיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היפוקסיה איסכמיה היא הגורם הנפוץ ביותר להתקפי יילודים. מודלים של בעלי חיים חיוניים להבנת המנגנונים והפיזיולוגיה שבבית התקפי יילודים ואיסכמיה היפוקסיה. כתב יד זה מתאר שיטה לניטור אלקטרואנצפלוגרמה וידאו רציף (EEG) בעכברים יילודים כדי לזהות התקפים ולנתח רקע EEG במהלך איסכמיה היפוקסיה. השימוש בווידאו ו- EEG בשילוב מאפשר תיאור של סמיולוגיה של התקפים ואישור התקפים. שיטה זו מאפשרת גם ניתוח של ספקטרוגרמות כוח ומגמות דפוסי רקע EEG לאורך תקופת הניסוי. במודל היפוקסיה איסכמיה זה, השיטה מאפשרת הקלטת EEG לפני הפציעה כדי לקבל בסיס נורמטיבי במהלך פציעה והתאוששות. זמן הניטור הכולל מוגבל על ידי חוסר היכולת להפריד גורים מהאם במשך יותר מארבע שעות. אמנם, השתמשנו במודל של התקפים היפוקסיים-איסכמיים בכתב יד זה, שיטה זו לניטור EEG וידאו יילודים יכול להיות מיושם מודלים שונים של מחלות ותפיסות מכרסמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנצפלופתיה איסכמית היפוקסית (HIE) היא מצב המשפיע על 1.5 ב-1,000 תינוקות בשנה והוא הגורם השכיח ביותר להתקפי יילודים1,2. תינוקות ששרדו נמצאים בסיכון למוגבלויות נוירולוגיות שונות כגון שיתוק מוחין, נכות שכלית ואפילפסיה3,4,5.

מודלים של בעלי חיים ממלאים תפקיד קריטי בהבנת וחקירת הפתופיזיולוגיה של איסכמיה היפוקסיה והתקפי יילודים6,7. מודל Vannucci שונה משמש כדי לגרום היפוקסיה איסכמיה (HI) ביום שלאחר הנתיחת 10 (p10)7,8. גורי עכברים בגיל זה מתרגמים בערך נוירולוגית למונח הניאונט האנושי המלא9.

ניטור אלקטרואנצפלוגרפיה רציף של וידאו (EEG) המשמש בשילוב עם מודל פגיעה זה מאפשר הבנה ואפיון נוספים של התקפים איסכמיים היפוקסיים יילודים. מחקרים קודמים השתמשו בשיטות שונות לניתוח התקפי יילודים במכרסמים, כולל הקלטות וידאו, הקלטות EEG מוגבלות והקלטות EEG טלמטריה10,11,12,13,14,15,16. בכתב היד הבא, אנו דנים לעומק בתהליך הקלטת EEG וידאו רציף בגורי עכבר במהלך היפוקסיה-איסכמיה. טכניקה זו לניטור EEG וידאו רציף בגורי עכבר יילודים יכולה להיות מיושמת על מגוון מודלים של מחלות ותקפים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת וירג'יניה.

1. בניין אלקטרודה / בניין כבלים

  1. השתמש בחוט נירוסטה מבודד חד קוטבי (קוטר חשוף בגודל 0.005 אינץ', מצופה "0.008) כדי ליצור אלקטרודה המחוברת למחבר שקע נקבה (מחבר כלי קיבול נשי 0.079).
  2. השתמש בכבל מיוחד בהתאמה אישית כדי לחבר בעלי חיים למגבר.
    1. חבר מחבר זכר בעל 4 פינים (מחבר זכר 0.079) לאחדות של 4 ערוצים, השג עכום התואם למגבר תפעולי (op-amp). חבר נגד 10K לחוטים המתחברים לסוללת ה-9 V. חוט קרקע שאינו מחובר למגבר הפעולה פועל כנקודת האמצע של הסוללה.
    2. חבר קצה אחד של הכבל (AWG, 0.012" OD) למגבר החיבור וחבר את הקצה השני של הכבל למגבר.

2. ניתוח השתלת אלקטרודה

  1. הרדמה הגור (לאחר ההונאה 9) עם 4-5% איזופלוראן במכסה המנוע זרימה כלפי מטה. לפני תחילת ההליך, להזריק את הגורים עם bupivacaine (0.02-0.05 מ"ל, 0.25% חדירה מקומית תת עורית).
  2. ברגע שהחיה חסרת תנועה, העבר לשלב סטריאוטקטי עם חרוט באף. השתמש בצד ההפוך של מוט האוזן כפי שהוא רך להחזיק את הראש יציב. בגיל זה, גורים אין אוזן מפותחת לחלוטין להשתמש בקצה מחודד של חטיף האוזן.
  3. להנמיך את זרימת האיזופלוריין ולשמור אותו ב 2.5-3%. לפקוח עין על נשימה קבועה של הגור לאורך כל הניתוח. צבוט את הזנב כדי לבדוק את תגובת הכאב ולאחר מכן להמשיך לתחכים.
  4. לחטא את אזור ההשתכה על הגולגולת עם betadine ואלכוהול (3 מחזורים של יוד לסירוגין ו 70% אתנול). עוטפים את חלק הגוף שמסביב כך שאזור ההסתה נראה לעין.
  5. פתחו את הקרקפת הקדמית-אחורית מעט מעל העיניים וחזרו בהן כ-0.5 ס"מ מהעור. מקם מחדש את ראש העכבר על הבמה הסטריאוטקסית כך שהעור מושך החוצה וחושף את הגולגולת.
  6. החל מי חמצן על הגולגולת באמצעות צמר גפן ולגרד את הגולגולת נקי באמצעות להב אזמל. הגולגולת רכה מאוד; לנקוט זהירות בעת גירוד.
  7. החל טיפה אחת (כ 50 μL) של דבק ולהפיץ אותו סביב אזור הגולגולת החשוף באמצעות אפליקטור שלה. לחשוף לאור UV במשך 40 s כדי להגדיר את הדבק.
  8. מדוד את הקואורדינטות באמצעות ברגמה החשופה כהפניה. שתל אלקטרודות דו-צדדיות באזור CA1 של ההיפוקמפוס [-3.5 מ"מ דורסל-גחון (DV), ±2 מ"מ מנדל-לרוחב (ML), -1.75 מ"מ עמוק (D)] ובדו-צדדי בקליפת המוח הקודקודית [-1.22 מ"מ DV, ±0.5 מ"מ ML, -1 מ"מ D] ואלקטרודה ייחוס במוח הקטן17. השתמש במחט 32 G כדי ליצור חור באזור המסומן.
  9. נקה את הדם מפני השטח של הגולגולת. אלקטרודות נמוכות המחוברות למחבר השקע הנשי למוח בעזרת הזרוע הסטריאוטקסית ולתקן במקום עם אקריליק שיניים. להשתיל את האלקטרודה במוח. אוזניות מחבר השקע יושבות על גבי הגולגולת מודבקות יחד על ידי אקריליק דנטלי.
  10. הזריקו קטופרפן (5 מ"ג/ק"ג) באופן תת עורי באזור הבין-כוכבי לאחר שהחשמל תוקן. מחזירים את הגורים לאם.
    הערה: הצג חצי מהפסולת עם האוזניות בבת אחת לאם במקום להציג אותן אחת בכל פעם. זה ימנע מאמא לפגוע באוזניות של הגור.

3. הגדרה והקלטה של EEG (בסיסי/טרום פגיעה)

  1. לאחר 24 שעות של התאוששות לאחר השתלת אלקטרודה, מניחים כל חיה בתא פרספקס מחומם (37 °C) בהתאמה אישית להקלטת EEG. חדר זה ישמש גם כתא היפוקסיה.
  2. חברו גורים בתא למערכת ניטור וידאו-EEG באמצעות כבל גמיש (כבל op-amp בהתאמה אישית).
    הערה: עם האוזניות במקום, העכברים ניידים באופן חופשי ואינם מפגינים הבדלים בהתנהגות. לאחר חיבור חוטי האלקטרודה, החוטים חייבים להיות מותאמים בתוך כבל התא על מנת לספק את הכמות הנכונה של מרווח, כך הגור יכול לנוע בחופשיות ברחבי התא.
  3. דיגיטציה של נתוני ה- EEG ב- 1000 הרץ עם רווח 1K באמצעות מגבר דשא. סקור את אות ה- EEG (מסנן מעבר רצועה בין 3-70 הרץ) מאוחר יותר באמצעות תוכנה (למשל, LabChart Pro).
  4. הקלט EEG בסיסי לפני פציעה במשך 30 דקות לפני ניתוק בעלי חיים עבור הליך קשירת עורק עורקים.

4. קשירת עורק עורקים שמאלית

  1. הרדמה הגור (לאחר היילוד 10) עם 4-5% איזופלוראן במכסה זרימה כלפי מטה ומניחים אותם על התקנה מסודרת במיוחד על כרית מרחץ מים. מקם את עלון החיה ואבטח את החלק המנומר עם סרט נייר.
    1. תנמיך את זרימת האיזופלוריין ל-2-3%. צבוט את הזנב לתגובה לכאב ולנטר את הנשימה לאורך כל ההליך.
  2. לחטא את אזור הסינג '(בין הלסת הלסת לבריח) בצד שמאל של הצוואר עם בטדין ואלכוהול (3 מחזורים של יוד לסירוגין ו -70% אתנול).
  3. בצע תרסיס באורך של כ-1 ס"מ בצד שמאל של הצוואר באמצעות מיקרו-רסיסים. באמצעות מיקרוסקופ מנתח, בזהירות לסגת הרקמה התת עורית ואת העור כדי לחשוף את העורק הראשי. יש להקפיד לזהות את עצב הוואגוס (ריצה רוחבית לעורק) ולהפריד בעדינות ולהסיר אותו מהעורק.
  4. השחיל תיל משי סטרילי באורך 5 ס"מ מתחת לעורק באמצעות מיקרו-כוחספס. לקשור תיל כפול קשור סביב העורק כדי לחנוק את זרימת.
  5. חותכים את התפר העודף וסוגרו את העורק החשוף על ידי משיכת הרקמה והעור התת עורי. השתמש בקשר וטרינר כדי לאטום את החתירה.
  6. מניחים את החיה בחזרה על ניטור EEG רציף בתא בטמפרטורת החדר, אשר ממוקם על מזרן חימום. יש ליטול בדיקת טמפרטורת אינפרא אדום נקודתית של טמפרטורת הליבה של הגור כדי להימנע מפתיחת התא. אפשר לחיה להתאושש במשך שעה אחת לפני היפוקסיה.

5. EEG והיפוקסיה

  1. צג באופן רציף FiO2 (שבריר של חמצן השראה) בתוך התא באמצעות צג חמצן.
  2. לשטוף את התא עם 60 L / min של 100% N2 ו 0.415 L / min עבור 100% O2. ברגע רוויית החמצן בתא מגיע 12%, להקטין את זרימת N2 ל 10 L / min תוך שמירה על זרימת O2 ללא שינוי. עם התאמות קטנות, לשמור על FiO2 ב 8% במשך 45 דקות.
  3. לאחר 45 דקות של חשיפה היפוקסיה, להחזיר FiO2 ל 21%.
  4. יש גורים להתאושש בתא ולפקח על EEG עבור 2 שעות לאחר היפוקסיה.
  5. לאחר סיום תקופת ההקלטה, נתק עכברים מהקלטת EEG וחזר לאם.

6. ניתוח EEG

  1. נתח את קובץ ה- EEG באמצעות וידאו ב- LabChart Pro. יש חוקר עיוור לסמן את EEG להתקפים ודפוסי רקע17. התקפים מוגדרים כאירוע אלקטרוגרפי הנמשך יותר מ -10 שניות עם הפרשות גל חדות בקצב גבוה (≥3x בסיסי) עם אבולוציה ברורה17.
  2. יש סקירת חוקר עיוור שני אירועים מסומנים באקראי להסכמה.
  3. סקור וידאו משויך עבור כל אירוע אלקטרוגרפי מסומן ולנתח על פי ציון תפיסה התנהגותית מכרסם יילודים16. בקצרה, ציון זה נע בין 0-6 (חוסר תנועה להתנהגות טוניק-קלוני חמור). כדי לאפיין עוד יותר את סמילוגיית ההתקפים, ניתחו התנהגות לרוחב (תנועות רב-מוקדיות/דו-צדדיות לעומת מוקד/חד-צדדי לעומת מעורב).
  4. צור ספקטרוגרמת כוח. השתמש בהסטת פורייה מהירה עם חלון נתונים של Cosine-Bell בגודל של 1024 נקודות נתונים. צור ציר x חלק בספקטרוגרמה בעזרת חפיפת חלון של 87.5%. לבטא את הכוח כמו μV218.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סמיולוגיה של התקפים

חשיפה להיפוקסיה-איסכמיה יילודים גורמת להתקפים כלליים ומוקדיים בעכברים (איור 1A-C). הקלטות EEG וידאו מאפשרות לממצאים אלקטרוגרפיים להיות מתואמים להתנהגות בוידאו. התנהגויות אלה קיבלו ציון באמצעות ציון תפיסה התנהגותית של מכרסם יילודים (BSS)16. בנוסף ל-BSS, סיווגנו אירועים לפי השאלה אם ההתנהגות הייתה מוקדית/חד-צדדית, דו-צדדית או מעורבת (איור 1B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצגנו מודל לניטור רציף של וידאו-EEG בעכברים יילודים במהלך התקפים היפוקסיים-איסכמיים. ניתוח וידאו בשילוב עם EEG מאפשר אפיון של סמיולוגיה התקפים. ניתוח של EEG מאפשר מיצוי ספקטרוגרמות כוח וניתוח משרעת רקע.

מיקום נכון וזהיר של אלקטרודות הוא קריטי בפרוטוקול זה, כמו פגיעה במהלך מיקום אלקטרודה או מיקום לא מדויק יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות. הערכה של פעילות EEG בסיסית נורמלית לפני הפציעה היא בעלת חשיבות עליונה, כמו דימום או פציעה במהלך מיקום אלקטרודה, בעוד נדיר, יכול לקרות. שנית, על מנת לאשר מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים במקורות המימון הבאים: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וירג'יניה (JB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ניתוח
מוליך נקודת כדורMetrex Research8300-FI-bond מוליך
קרניופלסט (אבקה/שרף)קולטןH00383פרם Reline/Power
I-BondKulzer GmbH, גרמניה
LOOK תפר משיהתמחויות כירורגיותSP115LOOK SP115 תפר כירורגי שחור קלוע לא נספג
RS-5168 מלקחיים בוטוויןרובוז מכשיר כירורגיRS5168מלקחיים לניתוח/קשירה
RS-5138 מלקחיים GraefeRoboz מכשיר כירורגיRS5138מלקחיים לניתוח/קשירה
אור UV עבור I-Bond BlastLite מאת First MediaBL778UV ligth עבור I-bond
Vannas מספרייםמיקרו-חיתוךRoboz מכשיר כירורגיRS5618מספריים לקשירה
וטרינר בונד3M Vetbond1469SBדבק
וטרינר<חזק>היפוקסיה
היפוקסידיאליסטאר חיישן
מוצריםרפואיים MiniOxI- מנתח חמצן / חיישן לאסדת היפוקסיה
<חזק>EEG הקלטה
מחבר שקע נקבה 0.079 אינץ'Mill-Max Manufacturing Corp832-10-024-10-001000הוזמן
ממגבר דשאNatus Neurology IncorporatedGrass
Product LabChart ProADI Instrumentsתוכנה להפעלת המערכת
מחבר שקע זכר 0.079 אינץ'Mill-Max Manufacturing Corp833-43-024-20-001000הוזמן מ- Digikey
Operational AmplifierTexas Instruments, דאלאס, טקסס, ארה"בTLC2274CDTLC2274 מגבר תפעולי מרובע מסילה למסילה עם רעש נמוך
מגבר תפעוליTexas Instruments, Dallas, TX, USATLC2272ACDRTLC2274 Quad Quarter-Noise Rail-to Rail מגבר תפעולי
חוט נירוסטהמערכות A-M7914000.005 אינץ' חשוף/0.008 אינץ' מצופה 100 רגל
חוט גמיש במיוחדMcMaster-Carr9564T136 חוט גזה בצבעים שונים
חמצן מדעי החיים Digikey

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vasudevan, C., Levene, M. Epidemiology and aetiology of neonatal seizures. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).
  2. Volpe, J., et al. Neonatal Seizures. Volpe's Neurology of the Newborn. , Elsevier. 275-321 (2018).
  3. Shankaran, S., et al. Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy. New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).
  4. Pappas, A., et al. Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy. Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).
  5. van Schie, P. E., et al. Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).
  6. Rensing, N., et al. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).
  7. Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Burnsed, J. C., et al. Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study. PLoS One. 10 (3), 0118889(2015).
  9. Semple, B. D., et al. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).
  10. Comi, A. M., et al. Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia. Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).
  11. Comi, A. M., et al. A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse. Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).
  12. Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).
  13. Burnsed, J., et al. Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice. Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).
  14. Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy. Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).
  15. Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).
  16. Kang, S. K., et al. and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).
  17. Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG. Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).
  18. Lewczuk, E., et al. EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).
  19. Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Video EEGEEGCarotid Artery LigationVideo EEG

מאמרים קשורים