מאמר שיטה

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

DOI:

10.3791/61348

⸱

17 ביוני 2020

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטה לעכל עיניים שלמות לתוך השעיית תא יחיד לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה רב-פרמטרית על מנת לזהות אוכלוסיות פיגוציטיות מונונוקולריות עיניות ספציפיות, כולל מונוציטים, מיקרוגליה, מקרופאגים ותאים דנדריטיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת החיסון המולדת ממלאת תפקידים חשובים בפתופיזיולוגיה עינית כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל. תאים חיסוניים מולדים, במיוחד פיגוציטים מונונוקולריים, מבטאים סמני פני תא חופפים, מה שהופך את זיהוי אוכלוסיות אלה לאתגר. ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח בו-זמני כמותי של סמני משטח תאים מרובים על מנת להבדיל בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעיני העכבר. פרוטוקול זה מתאר את ההסתעפות של עיני עכבר שלמות, ניתוח עיני, עיכול להשעיית תא יחיד וכתמים של השעיית התא הבודד עבור סמני תאים מיאלואידיים. בנוסף, אנו מסבירים את השיטות המתאימות לקביעת מתחים באמצעות פקדי צבע יחיד ולתיאור שערים חיוביים באמצעות פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד. המגבלה העיקרית של ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא היעדר ארכיטקטורת רקמות. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי cytometry זרימה מרובת פרמטרים של תאי עיניים בודדים או כתמי כשל חיסוני חינם. עם זאת, כשל חיסוני מוגבל על ידי חוסר ניתוח כמותי שלה מספר מופחת של פלואורופורים על רוב המיקרוסקופים. אנו מתארים את השימוש בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לספק ניתוח כמותי מאוד של פיגוציטים מונונוקולריים בניאווסקולריזציה כורואידית הנגרמת על ידי לייזר. בנוסף, ניתן להשתמש בציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים לזיהוי ערכות משנה של מקרופאגים, מיפוי גורל ומיון תאים עבור מחקרים תעתיקומיים או פרוטאומיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת החיסון המולדת כוללת סוגי תאים מרובים המעוררים הפעלה משלימה ודלקת. תאים חיסוניים מולדים כוללים תאי רוצח טבעי (NK), תאי פיטום, בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים, ופגוציטים מונונוקלריים. פיגוציטים מונונוקלריים, המורכבים ממונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים, היו מעורבים בפתופיזיולוגיה של תנאים אופטלמולוגיים מרובים כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)1. בפרוטוקול זה, נתמקד בזיהוי של phagocytes מונונוקולרי באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה רב פרמטרים במודל העכבר של AMD neovascular2. פרוטוקול זה ניתן להתאמה למודלים של עכברים של רטינופתיה סוכרתית ו/או uveitis, אך ניתוח עיניים נרחב יותר מומלץ בגלל האופי המערכתי של מחלות אלה.

פגוציטים מונונוקולריים מבטאים סמני פני תא חופפים. מקרופאגים ומיקרוגליה של תושבי רקמות לאורך זמן מקורם באקרומניאלואיד שק החלמון3, בעוד מיחזור מקרופאגים ותאים דנדריטיים מבדילים מאבן התא הדנדריטית4שמקורה במח העצם . סמני פני השטח של תאי העכבר המשותפים למונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים כוללים את CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17, ואת הסמן התאי Iba18. על מנת להתגבר על אתגר זה, ניתוח תמלולומי של מקרופאגים, מונוציטים ותאים דנדריטיים מרקמות מרובות מגדיר את CD64 כסמן משטח תא ספציפי למאקרופג '6. מקרופאגים תוארו הקשתית, choroid, גוף ciliary, ועצב הראייה בעיניים בריאות3. לחלופין, זיהוי תאים דנדריטי קשה יותר; השיטה הספציפית ביותר לזיהוי תאים דנדריטיים דורשת מיפוי גורל באמצעות עכבר הכתב Zbtb46-GFP9. ללא תלות בשורת כתב זו, ביטוי של CD11c ו- MHCII בשילוב עם היעדר CD64 יכול לזהות תאים דנדריטיים פוטנציאליים6,10. תאים דנדריטיים זוהו בקרנית, הלחמית, הקשתית והכורוידים בעיניים רגילות11. Microglia הם מקרופאגים מיוחדים הממוקמים ברשתית, מוגנים על ידי מחסום רשתית הדם, ומופקים מתאי שק חלמון12. כתוצאה מכך, microglia הרשתית ניתן להבדיל מקרופאגים נגזר מונוציט על ידי רמות עמומות שלהם של ביטוי CD4513 ורמות גבוהות של Tmem119, אשר זמין כמו נוגדן cytometry זרימה14. עם זאת, עם הפעלת microglia, CD45 יכול להיות מוסדר עד15 ו Tmem119 עשוי להיות מוסדר למטה3, המדגים את המורכבות של ביולוגיה microglia וזה רלוונטי ככל הנראה הן AMD והן מודל העכבר שלה. לבסוף, ניתן לחלק מונוציטים לשני תת-סוגים לפחות, כולל קלאסי ולא קלאסי. מונוציטים קלאסיים מציגים CCR2+Ly6CגבוהCX3CR1 ביטוינמוך, מונוציטים שאינם קלאסיים להדגים CCR2-Ly6CנמוךCX3CR1 סמניםגבוהים 5.

בשל הצורך בניתוח כמותי של ביטוי סמן, כלומר, רמות גבוהות לעומת רמות נמוכות/עמומות, ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא השיטה האידיאלית לאפליה בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעין וברקמות אחרות. יתרונות נוספים כוללים זיהוי אוכלוסיות משנה, היכולת להשתמש במיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי למיין אוכלוסיות תאים לצורך ניתוח תמלולומי או פרוטאומי ומיפוי גורל. החיסרון העיקרי של cytometry זרימה רב פרמטרים הוא חוסר ארכיטקטורת רקמות. זה יכול להיות להתגבר על ידי ניתוח עיניים לתוך subcompartments העין השונים: קרנית, הלחמית, איריס, עדשה, רשתית, קומפלקס choroid-sclera. בנוסף, הדמיית כשל חיסוני מאשר יכולה להתבצע, אך מוגבלת על ידי מספר הסמנים וחוסר כמות איתנה.

מחקרי עמותה רחבת גנום קישרו גנים משלימים מרובים עם AMD16. הפעלה משלימה מובילה לייצור אנפילטוקסין, גיוס לויקוציטים ודלקת כתוצאה מכך. בעכברים משלימים קולטן לקוי, פגיעה בלייזר מפחית גיוס phagocyte mononuclear ו neovascularization choroidal הנגרמת על ידי לייזר (CNV) אזור17. באופן דומה, קולטן כימוקין מוטיב C-C 2 (CCR2) עכבר נוקאאוט, אשר חסר בגיוס מונוציט לרקמה, מדגים הן ירידה בגיוס phagocyte מונונוקארי ואזור CNV המושרה בלייזר18. נתונים אלה קישור משלים phagocytes מונונוקולרי עם CNV ניסיוני ואולי AMD neovascular. לתמיכה של עמותה זו, קולטנים משלימים הם dysregulated על מונוציטים בדם היקפי בחולים עם AMD neovascular19,20. נתונים אלה מראים קשר חזק בין AMD לבין פיגוציטים מונונוקאריים.

בכתב יד זה, נשתמש במודל CNV המושרה בלייזר ניסיוני כדי לאפיין את אוכלוסיות הפגוציטים המונו-גרעיניות בעין העכבר באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים. לייזר המושרה CNV הוא מודל העכבר הסטנדרטי של AMD neovascular, אשר הוכיח את היעילות של טיפול AMD ניאו-וסקולרי השורה הראשונה הנוכחי21. פרוטוקול זה יתאר התכווצות של עיני עכבר, ניתוח עיני, עיכול לתוך מתלה תא יחיד, כתמי נוגדנים, קביעת מתחי לייזר באמצעות פקדי צבע יחיד, ואסטרטגיית gating באמצעות פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) פקדים. לקבלת תיאור מפורט של דגם CNV המושרה בלייזר, עיין בפרסום הקודם22. באמצעות פרוטוקול זה, אנו נגדיר אוכלוסיות מיקרוגליה, מונוציטים, תאים דנדריטיים ומאקרופאג'. יתר על כן, נשתמש ב- MHCII וב- CD11c כדי להגדיר עוד יותר ערכות משנה של מקרופאגים במודל CNV המושרה בלייזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן. עכברי C57BL/6 שוכנו במתקן מחסום במרכז לרפואה השוואתית באוניברסיטת נורת'ווסטרן (שיקגו, אילינוי). כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור / כהה של 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.

1. אוסף רקמת עיניים

  1. להקריב עכברי C57BL/6J בני 10-12 שבועות משני המינים באמצעות ניהול מוסדר של פחמן דו חמצני עד שהעכבר לא מגיב וכבר לא שואף. בצע נקע בצוואר הרחם או שיטה משנית מאושרת אחרת כדי להבטיח המתת חסד.
    הערה: ניתן לבצע זלוף טרנסקרדיאלי כדי להסיר לויקוציטים במחזור שאינם ברקמות העין. בניסוי זה, זלוף מערכתי אינו מפחית את מספר המיקרוגליה, המונוציטים, המקרופאגים או התאים הדנדריטיים שזוהו בעיניים שלמות שאינן מטופלות או שטופלו בלייזר. לכן, רוב סוגי התאים האלה ממוקמים ברקמות העיניים וצעד זה הוא אופציונלי.
  2. כדי להסב את העיניים, לדחוף למטה ליד ארובת העין תוך הצבת זוג מלקחיים מעוגלים בעדינות מתחת לעין כפי שהוא בולט מתוך השקע. מלקחיים קמצוץ סגור מתחת לעין מבלי ללחוץ את העין בפועל. לעקור את העין מן הלחמית שמסביב (ראה פרסום מוקדם)23.
  3. משוך את העין לרוחב עד עצב הראייה הוא הקשר היחיד שנותר כדי לנתק את העין. עצב הראייה לעתים קרובות מנתק עם מתח, אבל מספריים קטנים לפעמים יש צורך לחתוך את עצב הראייה. מניחים את העין בתמיסת מלח אגירה (HBSS) קרה של האנק עם סידן ומגנזיום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל.

2. עיכול רקמת העין

  1. הכינו את מאגר העיכול המכיל אנזים עיכול של 0.1 מ"ג/מ"ל ו-0.2 מ"ג/מ"ל DNase ב-HBSS קר. לשקם 5 אנזים עיכול מ"ג ב 2 מ"ל של מים סטריליים בתחילה. הכן דילול ראשוני של 10 מ"ג / מ"ל DNase ב- HBSS. עבור כל 10 מ"ל של מאגר העיכול (מספיק עבור 3 בעלי חיים) לערבב 9.4 מ"ל של HBSS קר עם 0.4 מ"ל של אנזים עיכול מחדש ו 0.2 מ"ל של DNase אני מדולל.
    הערה: ריכוזים אלה נקבעו באופן אמפירי על פני ניסויים מרובים כדי לספק רמות אופטימליות של כתמי נוגדנים של תאים בודדים, תוך הפחתת מוות של תאים. Collagenase D נוסה כחלופה אנזים עיכול עם יכולת הכדאיות התא מופחתת וירידה CD45+ תאים. נא עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים אודות התהליך האיטרטיבי למיטוב העיכול.
  2. תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה כוללת של פי 10, הסר את הלחמית הנותרת ואת עצב הראייה באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים אביביים ב- HBSS קר.
  3. מעבירים עיניים נקיות לצלחת ניתוח יבשה או לסירת שקילה קטנה. להזריק 0.15-0.20 מ"ל / עין של מאגר העיכול באמצעות מזרק מצויד 30 G מחט לתוך החלל הזגוגי לאחר שני פצעים מחוררים נעשים בעין דרך הציר החזותי ו 90 ° מן הפצע הראשון הזה עבור יציאת חיץ העיכול.
  4. יש למרוח עיניים שלמות באמצעות מספריים אביביות ומלקחיים עדינים עם כל החלקים הקטנים מ-0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ. לנתק את רקמת העדשה עם הפרעה מכנית בוטה באמצעות מלקחיים כדי למנוע סתימת טיפים פיפטה בשלבים הבאים. עבור כל דגימה, לשטוף מלקחיים ומספריים כל אחד עם 0.75 מ"ל של חיץ העיכול לתוך צלחת קטנה. השתמשו בצלחת חדשה לכל דגימה.
  5. להעביר את התוכן של המנה לצינור דיסוציאציה על קרח באמצעות P1000 פיפטה מקפיד לא לאבד כל חומר בהעברת פיפטה. יש לשטוף את המנה עם 1.5 מ"ל נוספים של חיץ עיכול ולהביא את הנפח הכולל בצינור הדיסוציאציה ל-3.25-3.50 מ"ל.
  6. מניחים את צינור הדיסוציאציה הפוך על דיסוציאטור אלקטרוני ולהפעיל מחזור "m_brain_03_01", המורכב סיבוב חד כיווני 1 דקות ב 200 סל"ד בטמפרטורת החדר, שהיא תוכנית טעונה מראש. ודא שכל הרקמות נמצאות בתחתית צינור הדיסוציאציה במגע עם מאגר העיכול והרוטור לכך ולכל השלבים הנותרים.
  7. מניחים את צינור הדיסוציאציה באינקובטור רועד במשך 30 דקות ב 200 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
  8. חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 פעם נוספת. לאחר דגירה שנייה של 30 דקות לבצע עיכול מכני אחד אחרון באמצעות דיסוציאטור אלקטרוני כמו בשלב 2.6.
  9. לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ זרימה קרה ומניחים צינורות על קרח.

3. הכנת השעיית תאים

  1. כדי ליצור השעיה חד-תאית, יוצקים את תגובת עיכול העיניים המופסקת באמצעות מסנן 40 מיקרומטר המונח על החלק העליון של צינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. באמצעות הכוען ממזרק 2.5 מ"ל, לדחוף את כל החלקים הנותרים של רקמת העין מעוכל דרך המסנן.
  2. לשטוף את צינור הדיסוציאציה עם 10 מ"ל של מאגר זרימה ולשטוף מסנן לפני השימוש בוכנה אותו שוב להעביר חתיכות רקמת העין מעוכל דרך המסנן.
  3. חזור על שלב 3.2 באמצעות מאגר זרימה של 5 מ"ל.
  4. לשטוף את צינור הדיסוציאציה ולסנן עם 10 מ"ל הסופי של מאגר זרימה.
    הערה: נפח כולל של עיכול ומאגר זרימה הוא כ 38-40 מ"ל עבור כל מדגם.
  5. צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תכריז על העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.
  6. הכן פתרון lysing 1x על ידי הוספת פתרון lysing 10x למים סטריליים. לשבור את גלולה על ידי הבהוב צינור נגד צינור אחר. כדי ליזות כדוריות דם אדומות, להוסיף 1 מ"ל של 1x lysing פתרון עבור 30 s עם מערבולת בטמפרטורת החדר (RT).
  7. עצור את התגובה עם 20 מ"ל של מאגר זרימה.
  8. צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תכריז על העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.
  9. נתק את גלולה על ידי החלקת צינור נגד צינור אחר. הוסף 5 מ"ל של קר 1x HBSS לכל צינור.
  10. צינורות צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף על טבעי.

4. הכתמת השעיית תאים עבור פיגוציטים מונונוקולריים

  1. הכן 0.5 מ"ל של כתם חי / מת לכל מדגם על ידי דילול צבע חי / מת 1:5,000 ב HBSS קר.
  2. הוסף כתם חי / מת לכל דגימה באמצעות פיפטה P1000 הקפד לנתק את גלולה לחלוטין. העבר דגימות לצינורות 1.2 מ"ל מיקרו טיטר.
  3. קח aliquot קטן (10 μL) כדי לספור תאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי (ראה 4.4). דגימות דגירה עם כתם חי / מת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. ספירת תאים באמצעות Trypan כחול כדי לקבוע את מספר התאים החיים לכל מדגם.
    הערה: בדרך כלל, 2 עיניים מעכבר C57BL/6J בן 10-12 שבועות מכילות פחות מ- 2 x 106 תאים חיים.
  5. לשטוף דגימות על ידי הוספת 400 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  6. Resuspend תאים לחלוטין ב 500 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  7. חסום עד 5 x 106 תאים חיים ב- 50 μL של בלוק Fc (דילול של 1:50 במאגר זרימה קר של CD16/CD32 נגד עכבר מטוהר). אם יותר מ 5 x 106 תאים חיים, להגדיל את הנפחים כראוי.
  8. הוסף בלוקF c לכדור הקפד לנתק לחלוטין את המדגם. דגירה במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. הוסף 50 μL של פתרון כתמי נוגדנים (ראה טבלה 1 לבחירה וכמות של כל נוגדן הכלול בתמיסה) לכל 5 x 106 תאים חיים ישירות לתאים בבלוק Fc ומערבבים לחלוטין. דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: כמויות הנוגדנים תלויות בתצורת ציטומטר הזרימה ויש לצייןן באופן עצמאי עבור כל מעבדה ומכשיר. ראה טבלה 2 לקבלת תצורת כלי נגינה של מסננים ושיקוף. כדי לצייץ נוגדנים, התחל בהמלצת היצרן וחשב את מדד הכתמים. בצעו בדיקה של ריכוזי נוגדנים שונים (מעל ומתחת להמלצת היצרן) ובחרו את הריכוז הנמוך ביותר של נוגדנים שבהם נשמר מדד הכתמים. כמו כן, ודאו שצביעה חיובית פחות בהירה מהפקד בצבע אחד. השתמש בתאים לא מוכתמים כדי להבטיח כי תאים מוכתמים שלילית הם בקנה מידה ויש להם שיא או פחות מ 1 x 102. השתמש בפלואורסצנטיות פחות פקד אחד כדי להגדיר את התאים המוכתמים באופן חיובי.
  10. לשטוף דגימות על ידי הוספת 700 μL של מאגר זרימה קרה. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  11. באופן אופציונלי, לאחר כתמי נוגדנים, ניתן לתקן את הדגימות עם 500 μL של 2% paraformaldehyde במאגר זרימה. תיקון דגימות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצע שטיפה אחת כמתואר ב- 4.10. אחסן דגימות קבועות ב 4 מעלות צלזיוס. יש להוסיף חרוזי ספירה ביום איסוף נתוני ציטומטריית זרימה. דגימות קבועות צריך להיות מופעל על cytometer זרימה ב 1-2 ימים.
    התראה: Paraformaldehyde הוא מאכל ומפגע בריאותי.
  12. לשטוף דגימות שוב באמצעות 500 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף מחצית supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
  13. Resuspend כדורי ולהעביר ל 96 גם, U-bottom assay צלחת. צלחת צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. כדי לגנות את העל-טבעי, הפכו את הצלחת ותוך טלטול חזק אחד סלקו את הנוזל לתוך כיור, מבלי להפריע לכדור.
  14. בצינור חדש של 1.2 מ"ל מיקרו טיטר, מניחים 50 μL של חרוזי ספירה מערבולת היטב.
  15. גלולות resuspend ב 96 צלחת היטב ב 200 μL של מאגר זרימה קר. הוסף תערובת תאים על החלק העליון של חרוזים משלב קודם. לרוץ על ציטומטר זרימה בנפח כולל של 250 μL / צינור טיטר מיקרו.

5. איסוף נתוני ציטומטריית זרימה

  1. הפעל והכן ציטומטר זרימה. ההוראות המפורטות להלן הן עבור סיטופומטר לייזר שונה (טבלה 2).
  2. הפעל דגימת בדיקה, הכוללת aliquot קטן מכל מדגם, כדי להבטיח כי כל התאים נמצאים בקנה מידה עבור כל גלאי. כוונן מתחים כך שכל התאים יהיה בקנה מידה.
  3. הפעל פקדי צבע בודדים (SCC) עבור כל פלואורופור המשמש לקוקטייל מכתים(שולחן 3). מניחים צינור מיקרו טיטר לתוך צינור פוליסטירן גדול יותר 5 מ"ל למיקום על שלב סייטומטר זרימה.
    הערה: פלואורים שורש כמו BV421 (כחול האוקיינוס השקט), FITC, PE, Alexa647 (APC), ו Alexa700 אינם דורשים נוגדן זהה לקוקטייל (כלומר, CD19 PE עבור CD64 PE). עם זאת, פלואורופורים טנדם כמו PE-CF594, PE-Cy7, או APC-Cy7 דורשים את אותו נוגדן עבור SCC כמו קוקטייל עקב ניתוק פוטנציאלי של פלואורופורים מצומדים.
    1. צור את SCC עבור BV421 על ידי הוספת 2 טיפות של חרוזי פיצוי צינור טיטר 1.2 מ"ל יחד עם 1 μL של אוגר נגד עכבר CD11c BV421. חרוזי פיצוי משמשים מכיוון ש- CD11c BV421 הוא סוג משנה של למבדה של IgG במקום קאפה כמתואר ב- 5.3.3. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.
    2. צור את SCC עבור צבע חי / מת על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזי כתמים חיוביים (כובע ירוק) מן החרוזים תגובתי אמין, ואחריו 1 μL של צבע חי / מת. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים (כובע לבן) מן החרוזים תגובתי אמין. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.
    3. צור את SCCs הנותרים על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזי כתמים חיוביים (כובע ירוק) מן נגד עכברוש ואנטי אוגר Ig kappa חרוזים להגדיר, ואחריו כמות הנוגדנים המפורטים (טבלה 3) בצינור טיטר 1.2 מ"ל. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים (כובע לבן) מן אנטי עכברוש אנטי אוגר Ig קאפה חרוזים להגדיר. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.
    4. וורטקס כל תערובות חרוזים לחלוטין. אחסן SCCs ב 4 °C (69 °F) עד 3 ימים.
      הערה: SCC עבור עכברי כתב פלואורסצנטי הוא תאים מוכתמים.
    5. בעת הפעלת SCCs, הגדר מתחים כך שלדגימה SCC יש שיא גדול יותר מכל פלואורסצנטיות עבור מדגם של תאים באותו ערוץ גלאי. בנוסף, יש להגדיר מתחים כך שלכל SCC יהיה הפרש יומן רישום של לפחות 0.5 בין שיא ההיסטוגרמה בערוץ העניין לעומת כל ערוץ אחר (איור 1).
  4. הפעל דוגמאות על "נמוך" שמירה על אירועים / שני מתחת 4000. אם לא ניתן להוריד את קצב הזרימה כראוי, לדלל דגימות עם מאגר זרימת קור נוסף. רשום את אמצעי האחסון שנוסף מכיוון שהדבר יהיה נחוץ לחישוב הספירה (ראה תוצאות מייצגות).
  5. לאסוף לפחות 3 x 106 אירועים לכל מדגם. זה עשוי להיות גבוה יותר ממספר התא עקב גרגירי פיגמנט ופסולת לספור כאירועים על הסייטומטר שלך.
  6. רשום פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) עבור כל פלואור שאינו חי/מת עבור אסטרטגיית ג'ינג נאותה בסעיף 6.4. FMO הוא מדגם שהוכתם בכל הפלואורופורים למעט אחד.
  7. נקה וכבה את ציטומטר הזרימה בהתאם להוראות היצרן או המתקן.

6. ביאור של נתוני ציטומטריית זרימה

  1. פתח גליון עבודה חדש באמצעות תוכנת ניתוח. יבא קבצי FCS מסיטומטר עבור כל הדגימות והפקדים בצבע יחיד.
  2. השתמש ב- SCCs כדי ליצור מטריצת פיצוי.
  3. החל את מטריצת הפיצוי על הדגימות המוכתמות ו- FMOs שלך.
  4. השתמש ב- FMOs כדי לקבוע כתמים חיוביים כדי לצייר שערים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 הראה היסטוגרמות תדר לא מפוצות עבור ה- SCCs והתאים עבור הלייזר האדום: Alexa647, Alexa700 ו- APC-Cy7. באיור 1A, קו המג'נטה תיאר את פסגת ה- SCC עבור Alexa647, בעוד שקו הציאן הראה את הפרש יומן הרישום המיועד של 0.5. שים לב כי השיא Alexa700 ו- APC-Cy7 היה משמאל (פחות בהיר) של קו ציאן. כמו כן, שים לב שהתאים היו כולם משמאל לקו המגנטה. כל התאים מימין לשיא ה-SCC לא קיבלו פיצוי. ערוצים ספציפיים היו ידועים לשפוך לתוך אחרים המבוססים על הכימיה של צבעי פלואורוכרום (כלומ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח כמותי של סוגי תאים מרובים ברקמה מורכבת. בדו"ח זה, אנו מתארים את הזיהוי הציטומטרי הזרימה של אוכלוסיות פיגוציטים מונונוקליות, כולל מונוציטים, תאים דנדריטיים ותת-קבוצות מקרופאגים, לאחר פגיעה בלייזר בעין העכבר. Liyanage et al דיווח לאחרונה על אסטרטגיית gating דומה כדי לזהות נויטרופילים, אאוזינופילים, לימפוציטים, DCs, מקרופאגים, חדירה מקרופאגים, מונוציטים27. אסטרטגיית הגטינג שלנו שונה בעיקר על ידי תוספת של CD64. Liyanage et al מזהה DC כ- CD4-CD8

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JAL נתמכה על ידי מענק NIH K08EY030923; CMC נתמך על ידי מענק K01 (5K01AR060169) מהמכון הלאומי NIH למחלות דלקת פרקים ושרירים ומענק מחקר חדשני (637405) מברית המחקר זאבת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.6 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהפישר סיינטיפיק05-408-120
1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהCostar3620
10 מ"ל פיפטותפישר סיינטיפיק431031
15 מ"ל חרוטיםThermoFisher339650
1x HBSS, 500 מ"לGibco14025-092
2.5 מ"ל מזרקHenke סאס וולף7886-1
תמיסת 20% פרפורמלדהידאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית15713-S
25 מ"ל פיפטותפישר סיינטיפיק431032
30 גרם מחטאקסל26437
3 מ"ל מזרק נעילת לוארפישר סיינטיפיק14955457
41 x 41 x 8 מ"מ צלחת פוליסטירן לשקול פישרסיינטיפיק08-732-112
50 מ"ל חרוטיםFalcon352070
96 בארות, צלחת בדיקה תחתונה U ללא מכסהFalcon353910
אמין חרוזים תגובתייםThermoFisherA10628
תוכנת ניתוחFlowJov 10
נגד חולדות ואנטי אוגרים סט חרוזים Ig kappa BDBiosciences552845
C57BL/6J עכבריםמעבדת ג'קסון664
מונה תאיםInvitrogenAMQAX1000
שקופיות מונה תאיםInvitrogenC10283
חרוזי פיצויThermoFisher01-1111-42
חרוזי ספירהThermoFisher01-1234-42
מלקחיים מעוקליםפישר סיינטיפיק16-100-123
אנזים העיכולסיגמא אולדריץ'5401020001
מיקרוסקופ ניתוחאופטיים ומדעיים לאומיים, בע"מצינורות דיסוציאציה DC3-420T
Miltenyi Biotec130-096-334
DNaseRoche10104159001
דיסוציאטור אלקטרוניMiltenyi Biotec130-095-937
FACS Diva תוכנהBD Biosciences
Fc בלוק, חולדה נגד עכבר CD16 / CD32BD Biosciences553142
מלקחיים עדיניםאינטגרה Miltex17035X
מאגר זרימהMiltenyi Biotec130-091-221
ציטומטר זרימהBD Biosciences
צינורות זרימהFalcon352008
אוגר נגד עכבר CD11c BV421BD Biosciences562782
דלי קרחפישר סיינטיפיק07-210-123
צבע חי/מתThermoFisher65-0866-14
תמיסת ליזינג, פתרון 10xBD Biosciences555899
צינור מיקרו טיטר ומתלהפישר סיינטיפיק02-681-380
עכבר נגד עכבר CD64 PEBioLegend139304
עכבר נגד עכבר NK1.1 PECF594BD Biosciences562864
קצות פיפט P1000דנוויל סיינטיפיקP2404
P1000 פיפטורגילסוןFA10006M
P2 טיפים פיפטוראפנדורף22491806
P2 פיפטורגילסוןFA10001M
P20 פיפטורגילסוןFA10003M
P200 טיפים לפיפטדנוויל סיינטיפיקP2401
P200 פיפטורגילסוןFA10005M
פיפט מןפישר FB14955202
מדעי חולדה נגד עכבר B220 PECF594BD Biosciences562313
חולדה נגד עכבר CD11b APC-Cy7BD Biosciences557657
עכברוש נגד עכבר CD19 AlexaFluor 700BD Biosciences557958
חולדה נגד עכבר CD19 PEBD Biosciences553786
חולדה נגד עכבר CD4 PECF594BD Biosciences562314
חולדה נגד עכבר CD45 FITCThermoFisher11-0451-82
חולדה נגד עכבר CD45 PE-Cy7BD Biosciences552848
חולדה נגד עכבר CD8 PECF594BD Biosciences562315
חולדה נגד עכבר Ly6CBD Biosciences
חולדה נגד עכבר Ly6G PECF594BD Biosciences562700
חולדה נגד עכבר MHC II AlexaFluor 700BioLegend107622
חולדה נגד עכבר Siglec F PECF594BD Biosciences562757
עכברוש נגד עכבר Tim4 AlexaFluor647BD Biosciences564178
חממת טלטולLabnet311DS
מספריים קפיצייםFine Science Tools15024-10
מסננת תאים סטרילית, רשת ניילון 40 מ"מפישר סיינטיפיק22363547
מים סטריליים, 500 מ"לGibcoA12873-01
צנטריפוגת דלי מתנדנדתeppendorf5910 R
טריפאן כחול, תמיסה 0.4%Gibco15250061
מכשירים 561085

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099(2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935(2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313(2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636(2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים