גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

סיכום

פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.

תקציר

הפתוגן התוך תאי כלמידיה trachomatis עובר מחזור התפתחותי המורכב משתי צורות התפתחותיות מורפולוגית דיסקרטית. הגוף היסודי שאינו משוכפל (EB) יוזם זיהום של המחשב המארח. ברגע שנכנס, EB מבדיל לתוך הגוף reticulate (RB). לאחר מכן RB עובר סיבובים מרובים של שכפול, לפני ההבדיל בחזרה לטופס EB מדבק. מחזור זה חיוני להישרדות כלמידית ככישלון לעבור בין סוגי תאים מונע פלישה מארחת או שכפול.

מגבלות בטכניקות גנטיות בשל האופי התוך תאי המחייב של כלמידיה יש לעכב את הזיהוי של המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח סוג התא. עיצבנו מערכת פלסמיד מקדם-כתב-יזם-חדשני, שבילוב עם מיקרוסקופית תאים חיים, מאפשרת הדמיה של החלפת סוג תא בזמן אמת. כדי לזהות גנים המעורבים ברגולציה של פיתוח סוג תא, מערכת יחצ"ן-כתב תא חי היה ממונף לפיתוח גישה גנטית קדימה על ידי שילוב mutagenesis כימי של זן הכתב הכפול, הדמיה ומעקב של כלמידיה עם קינטיקה התפתחותית שונה, ואחריו בידוד clonal של מוטציות. זרימת עבודה גנטית זו קדימה היא כלי גמיש שניתן לשנות לחקירה מכוונת למגוון רחב של מסלולים גנטיים.

מבוא

כלמידיה trachomatis (Ctr) הוא פתוגן תאי חובה המתקדם דרך מחזור התפתחותי דו-פאזי חיוני להישרדותו^{והתפשטותו 1}. מחזור זה מורכב משתי צורות התפתחותיות, הגוף היסודי (EB) והגוף reticulate (RB). EB הוא שכפול לא יושר אבל מתווכת פלישה לתא באמצעות אפקט המושרה אנדוציטוזיס². פעם אחת במארח, EB מתבגר RB משוכפל. RB מבצע סיבובים מרובים של שכפול לפני המרה בחזרה EB על מנת ליזום סיבובים הבאים של זיהום.

המערך המוגבל של כלים גנטיים הגביל את רוב המחקר הכלמידלי למחקרים ביוכימיים או לשימוש במערכות חלופיות. כתוצאה מכך, ההבררה של ויסות גנים ושליטה במחזור ההתפתחותי היה^{קשה 3,4}. אחד האתגרים החשובים יותר בתחום הכלמידיאלי הוא מעקב זמני ברזולוציה גבוהה של מחזור התפתחותי כלמידיאלי וזיהוי החלבונים המעורבים בוויסותו. ביטוי גנים במהלך מחזור התפתחותי כלמידי בוצע באופן מסורתי על ידי הרסני "נקודת קצה" שיטות כולל RNAseq, qPCR, מיקרוסקופית תא^{קבוע 5,6}. למרות ששיטות אלה סיפקו מידע רב ערך, הטכניקות המועסקות הן מייגעות ויש להן^{רזולוציה זמנית נמוכה 5,6}.

בעשור האחרון, מניפולציה גנטית של Ctr התקדמה עם המבוא של טרנספורמציה פלסמיד ושיטות mutagenesis^7,,8,9. עבור מחקר זה, מערכת מבוססת פלסמיד פותחה כדי לפקח על התפתחות כלמידיאל בהכללות בודדות בזמן אמת במהלך זיהום. נוצר טרנספורמטציה כלמידית שהביעה הן RB והן EB סוג ספציפי יחצ"ן ספציפי-כתב. הכתב הספציפי RB נבנה על ידי היתוך היזם של הגן RB מוקדם euo במעלה הזרם של קלובר חלבון פלורסנט. EUO הוא רגולטור שעתוק המדכא תת קבוצה של גנים הקשורים EB מאוחר¹⁰. היזם של hctB, אשר מקודד חלבון דמוי היסטון מעורב עיסוק גרעין EB, שוכפל ישירות במעלה הזרם של mKate2 (RFP) כדי ליצור את הכתב הספציפי EB¹¹. עמוד השדרה של hctBנשף-mKate2 /euoהנשף-תלתן היה p2TK2SW2⁷. מקדמי HCTB ו-euo הוגדלו מהדנ"א הגנומי CTR-L2. כל רצף מקדם כלל ~ 100 זוגות בסיס במעלה הזרם של אתר ההתחלה שעתוק חזוי עבור הגן הכלמידיאלי שצוין בתוספת 30 נוקלאוטיד הראשון (10 חומצות אמינו) של ORF בהתאמה. גרסאות FP פלורסנט הושגו באופן מסחרי כמו Ctr קודון אופטימיזציה בלוקים גנים משוכפלים במסגרת עם 30 נוקלאוטיד הראשון של כל גן כלמידיאלי יחצ"ן. המחסל של ה-INCD שוכפל ישירות במורד הזרם של mKate2. האמרגן-כתב השני הוכנס במורד הזרם של המחסל של ה-INCD. גן התנגדות אאמפיצילין(bla)ב p2TK2SW2 הוחלף בגן aadA (התנגדות ספקטינומיצין) מ pBam4. התוצאה הייתה המבנה הסופי p2TK2-hctBנשף-mKate2/euoנשף-תלתן (איור 1A) שהפך Ctr-L2⁷. זן זה RB / EB כתב מותר להתבוננות של מחזור התפתחותי בתוך הכללות יחיד באמצעות מיקרוסקופי תא חי(איור 1B,C).

העסקת היזם-כתב שלנו מבנה בשילוב עם mutagenesis כימי, פרוטוקול הומצא כדי לעקוב ולבודד שיבוטים בודדים שהפגינו חריגות התפתחותיות מאוכלוסיות mutagenized של Ctr serovar L2. פרוטוקול זה מאפשר ניטור ישיר של הכללות כלמידיות בודדות, מעקב אחר פרופילי ביטוי גנים לאורך זמן, זיהוי שיבוטים כלמידיים המבטאים דפוס ביטוי גנים התפתחותי שונה, ובידוד מוחלט של כלמידיה מהכללות בודדות.

למרות פרוטוקול זה נוצר במיוחד לזיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות כלמידית, זה יכול להיות מותאם בקלות לחקור כל מספר של מסלולים גנטיים כלמידיים.

פרוטוקול

כל קבצי ה- Script של פיתון המשמשים בפרוטוקול זה זמינים ב- Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. כתב מוטגניז כלמידיה

הערה: Ctr-L2-hctBהנשף-mKate2/euoהנשף-תלתן EBs היו מוטאגניים ישירות באמצעות אתיל מתנסולפונט (EMS) במדיה axenic CIP-1 כמו מדיה זו תומכת חילוף חומרים EB ותחזוקה של EB^{זיהומית 12}.

1. להפשיר מלאי כלמיד על קרח המכיל ~ 3 x 10⁷ EBs טרנספורמציה עם p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover כתב plasmid וכדור ב >14,000 x g עבור 30 דקות ב 4 °C.
   הערה: אורגניזמים כלמידיה המשמשים לניסויים אלה היו 30% renografin צפיפות מטוהרת וקפוא ב -80 ° C ב 1x סוכרוז-פוספט-גלוטמט מאגר (SPG).
2. השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את גלולת ה-EB ב-100 μL של מאגר CIP-1 עם sonication על קרח ב-10% כוח עבור 10 שניות. לחלק את 100 μL של השעיית EB לשני 50 μL aliquots עבור mutagenized וללעוג לדגימות שטופלו.
3. הכן 20 מ"ג/מ"ל של פתרון EMS-CIP-1 בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מ"ל. כדי לעשות זאת, להוסיף 6.8 μL של EMS ב 375 μL נפח כולל.
4. להוסיף 50 μL של פתרון EMS-CIP-1 לאחד aliquots כלמידיאל עבור mutagenesis ו 50 μL של CIP-1 רק אליקו כלמידיאל אחרים עבור mutagenesis מדומה.
   הערה: ריכוז EMS הסופי הוא 10 מ"ג/מ"ל. טטר כלמידיאל, ריכוז EMS, ואת זמן החשיפה בשימוש בפרוטוקול זה להוביל לירידה של כ 60-80% בצידים זיהומיים. רמה זו של הפחתה מתאימה ~ 5-20 נגעים DNA לכל הגנום כלמידיאלי⁸.
5. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. ה-EBs המוגניים ישמשו ישירות להדבקת מונושכבות בסעיף 2.
   התראה: EMS הוא מסרטן ידוע. כל הציוד והחומרים באים במגע עם EMS חייב להיות ספוג 1 M NaOH במשך 24 שעות לפני ההשלכה, כפפות יש להשתמש בכל עת במהלך הפרוטוקול וניקוי של חומרי EMS.

2. הדמיה של Ctr מוטציה

1. תרבות תא מארחת להדמיה ובידוד של Ctr מוטאגניים
   1. זרע צלחת 6 גם זכוכית תחתית עם 6 x 10⁵ Cos-7 תאים (ATCC) לכל באר ב 2 מ"ל של מדיה מלאה (RPMI-1640 בתוספת עם 10% סרום לשור עוברי ו 10 מ"ג / מ"ל gentamicin). השתמש בצלחת התחתונה זכוכית זו להדמיה של Ctr mutagenized.
   2. זרע 24 צלחת פוליסטירן גם עם 1 x 10⁵ Cos-7 תאים (ATCC) לכל באר 1 מ"ל מדיה מלאה. השתמש בצלחת פוליסטירן זה לדבקות מחדש של כלמידיה מבודדת של עניין.
   3. דגירה שתי הצלחות ב 5% CO₂, 37 ° C עבור כ 18 שעות. ברגע תאים להגיע confluency, להחליף מדיה עם מדיה מלאה בתוספת 1 μg / מ"ל של ציקלוהקסמיד ותדגירה בן לילה.
2. הדבקת תרבות התא המארח עם Ctr מוטאגניים
   1. להדביק 5 בארות של צלחת תחתית זכוכית עם ~ 6 x 10⁵ של EBs mutagenized ב 1.5 מ"ל / גם קרח קר HBSS. כתוצאה מכך MOI של ~ 0.3 כמו ~ 70% שיעור התמותה צפוי עקב mutagenesis.
   2. להדביק את הבאר הנותרת עם ~ 2 x 10⁵ מדומה mutagenized EBs ב 1.5 מ"ל / גם קרח קר HBSS. ללא mutagenesis, לצפות פחות תמותה, ולכן שליש אינוקולום משמש כדי להשיג את MOI של ~ 0.3.
      הערה: MOI של ~ 0.3 מבטיח כי תאים מארח נגועים EB יחיד ומאפשר את ההפרדה מספיק בין תאים נגועים לבידוד clonal.
   3. דגירה את הצלחת במשך 15 דקות, עם נדנדה, ב 37 מעלות צלזיוס.
   4. לשטוף את התאים המארחים הנגועים עם מחממים מראש (37 °C) HBSS המכיל 1 מ"ג / מ"ל heparin ואחריו מיד שטיפה HBSS. חזור על שטיפה הפרין, מיד שטיפה 2x עם HBSS כדי להבטיח את ההפרין מוסר.
      הערה: הפרין מעכבת יכולה להפוך את האינטראקציות האלקטרוסטטיות המוקדמות בין התא המארח לבין^{13 13.} ההפרין שוטפת את האי.בי.אס שטרם נכנסו לתאים המארחים, ומסנכרנת את הזיהום. בעת שטיפת תאים לעשות זאת בעדינות כדי למנוע את ניתור התאים מפני השטח של בארות. פתרונות HBSS ו-Heparin מכילים שאריות EMS שיורית ויש למצוא אותן בבקת המכילה 1 M NaOH למשך 24 שעות לפני ההשלכה.
   5. החלף את HBSS עם 4 מ"ל/באר של מדיית הדמיה טרום-מחממת (37°C) (מדיה מלאה, 1 μg/mL ציקלוהקסמיד, 20 mM HEPES, ואין פנול אדום).
   6. מלא את החללים הפנימיים עם H₂O מחמם מראש (37°C) כדי לסייע בפקד הטמפרטורה ולהפחית את האידוי. דגירה את הצלחת ב 37 ° C אינקובטור עם 5% CO₂ עבור 10 שעות.
3. מיקרוסקופ להגדיר והדמיה
   הערה: הדמיית פלורסנט אוטומטית מרובת תאים חיים מרובת צבעים משמשת לאיסוף תמונות של זמן-לשגות כדי לזהות מוטנטים כלמידיים השונים בדינמיקה של ביטוי גנים התפתחותיים. פרוטוקול זה מנצל את חבילת התוכנה μManager קוד פתוח עבור בקרת מיקרוסקופ אוטומטית¹⁴.
   1. התחל את הגדרת מיקרוסקופ 10 שעות לאחר זיהום. הגדר את האינקובטור שלב מיקרוסקופ 5% CO₂, 37 ° C. מניחים את 6 צלחת זכוכית גם הנגועה לתוך אינקובטור הבמה ולהכניס את thermistor המדגם לתוך interwell H₂O.
   2. כיול שלב XY באמצעות תוסף הקרנת תוכן גבוה (HCS). לחץ על תוספים | כלי רכישה | HCS אתר מחולל בתוכנה בקרת מיקרוסקופ μManager (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
   3. בחר את תבנית לוח 6-באר וליצור רשימת מיקום הדמיה המורכבת 12 שדות תצוגה (FOV) לכל גם בתוך תוסף HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). פתח את רשימת מיקומי הבמה והתמקד באופן ידני והגדר את מיקום ה- Z המוקדם עבור כל FOV באמצעות התוסף בקרת במה (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). התאם את קואורדינטות ה- XY של כל FOV המכיל תאים חסרים או שאינו מכיל שכבת מונומרת אחידה.
      הערה: בשל הזמן שלוקח לכל תמונה ללכד, ניתן יהיה לקחת מספר מרבי של 72 FOV לכל מרווח זמן של 30 דקות.
   4. השתמש בעדשת מטרה של 20x להדמיה. הגדלה זו מאפשרת ~ 8 הכללות להיות תמונה לכל FOV תוך מתן הרזולוציה הרצויה.
   5. שמור את רשימת התפקידים כפי שישמש לאיתור הכללות של עניין לאחר ניתוח נתונים (JoVE61365_screenfile7).
   6. השתמש באפשרות מיקוד אוטומטי בתוכנה להדמיה, כדי להגדיר את המוקד להדמיה אוטומטית (JoVE61365_screenfile8).
   7. השתמש בבחירה ובערכים הבאים כדי להפיק את תוצאות המוקד העקביות ביותר באמצעות מיקוד אוטומטי מבוסס תמונה ב- μManager. בחלון מאפייני מיקוד אוטומטי, בחר OughtaFocus מהתפריט הנפתח והשתמש בהגדרות הבאות. SearchRange_350, אוטהפוקוס-Tolerance_: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: כן, צריךפוקוס-למקסם: חדים, צריךפוקוס-ערוץ: DIC.
      הערה: הפחתת חלון ההדמיה של המיקוד האוטומטי על-ידי הפחתת גורם החיתוך מאפשרת מיקוד אוטומטי עקבי יותר. בחירה באפשרות כן עבור OughtaFocus-ShowImages מאפשרת למשתמש להציג את תמונת הפוקוס האוטומטי.
   8. ללכוד את הקינטיות של מחזור התפתחותי על ידי הדמיה במשך 24 שעות עם מרווחי זמן 30 דקות (JoVE61365_screenfile9). הדמיה בין 12-36 HPI מבטיח כי כלמידיה משלים את המחזור ההתפתחותי, אך אינו lyse התא המארח.
   9. תמונה מונושכבות התא עם חשיפה של 250 ms בעוצמה של 4% ו 18% בערוצים GFP ו RFP,בהתאמה( JoVE61365_screenfile10 ). זהה את אות תלתן (GFP) על-ידי העירה ב- 470 ננ"מ עם מסנן פליטת bandpass 514/30 nm. זהה את אות mKate2 (RFP) על-ידי העירה ב- 595 ננ"מ ועם מסנן פליטת bandpass 641/75 ננ"מ.
      הערה: מזעור עוצמת העירור הוא קריטי למזעור פלואורופור פוטו-בלייע ופוטוטו-אקסיסיות לכלמידיה. עוצמת העירור המינימלית כדי ליצור תמונה נפתרה עם חשיפה של 200-300 ms צריכה להיקבע באופן אמפירי במחקרי פיילוט.
   10. לכוד פרוסות Z מרובות עם טווח מיקוד שמסתיים משני צדי פרוסת המיקוד. בניסוי זה, בהגדלה של פי 20, הושגה זו עם 4 פרוסות ב-10שלבים (JoVE61365_screenfile11).
   11. בחר יחסית Z להדמיה של פרוסות מרובות בחלון הרכישה. האפשרות Z יחסית משתמשת במיקום מישור Z שנשמר ברשימת מיקום ההדמיה כנקודת ההתחלה עבור מרווח הזמן הבא. הזן את ערכי היסט Z המתאימים עבור ערוצי הדמיה פלואורסצנטיים (JoVE61365_screenfile12).
       הערה: מערכת המיקוד המבוססת על תמונה אינה מושלמת ועל פני תקופת הדמיה של 24 שעות, הדבר מוביל להיסחף מיקוד. נמצא כי על ידי לכידת 3-4 Z מיקוד מטוסים עבור כל נקודת זמן תמונה בפוקוס נשמרה. היסט Z נדרש כדי לתקן את ההבדלים במטוסי המוקד בין ערוצי התמונה הפלורסנטיים לערוץ DIC. יהיה צורך בקביעה אמפירית של קיזוז ה-Z הזה.
   12. שמור תמונות על-ידי בחירת ספריית הבסיס ומתן שמות לניסוי. השתמש באפשרות קובץ מחסנית תמונות μManager כדי לשמור תמונות כקבצי מחסנית tiff (JoVE61365_screenfile13).
   13. רמת פרטים ניסיוניים בתיבה הערות רכישות בחלון רכישה מרובת D (JoVE61365_screenfile13). כלומר, ובכן A1: שליטה לא מטופלת. ובכן A2-3 ו B1-3: מוטנטים EMS. הדמיה: 12-36HPI. התחל את רכישת התמונה ב- 12 HPI.
       הערה: אם אתה משתמש ב- μManager, השאר את התוכנית, את ההתקנה הניסיונית ואת חומרת המיקרוסקופ הפועלת לאחר השלמת הניסוי. אתרי ההדמיה ייבחנו מחדש לבידוד הכללה לאחר השלמת ניתוח האוכלוסייה המוטגנית.

3. לזהות ולבודד כלמידיה מוטאגנית עם פנוטיפים התפתחותיים שהשתנו

1. יצירת מחסנית תמונות בפוקוס
   1. חלץ את התמונה המורכזת ביותר מערימות ה- Z באמצעות נתוני התמונה השמורים המכילים 4 פרוסות Z לנקודת זמן. השתמשו באפשרות מדידת קורטוזיס (נתח | מידה) ב- ImageJ/FIJI כדי לזהות באופן אוטומטי את הפרוסה Z המוקד ביותר (ציון קורטוזיס הגבוה ביותר) וליצור מחסנית תמונה חדשה עם תמונות אלה רק במוקד. קובץ Script של Python נכלל כקובץ משלים (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי.
2. לכמת ביטוי פלואורסנטי בהכללות בודדות
   הערה: כדי לכמת את הביטוי קינטיקה של שני הכתבים להשתמש ביישום ניתוח תמונה קוד פתוח ImageJ/FIJI ואת תוסף Trackmate¹⁵. Trackmate מזהה 'נקודות' (המתאימות להכללות במקרה זה) ועוקב אחריהם באמצעות מחסנית תמונה לשגות זמן המתעדת את המיקום X,Y ואת עוצמת האות עבור כל הכללה לאורךזמן (JoVE61365_screenfile14). מידע זה נשמר כקובץ CSV וייובא למחברת פיתון מותאמת אישית לצורך ניתוח.
   1. פתח את מחסנית התמונה המופחתת Z בפוקוס ב- ImageJ/FIJI באמצעות יבואן בפורמטים ביולוגיים על-ידי לחיצה על תוספים | ביופורמטים | ביו-פורמטים היבואן. בחר Hyperstack ו- Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
   2. חיסור את רקע התמונה על-ידי לחיצה על תהליך | חיסור רקע באמצעות רדיוס כדור מתגלגל של 50.0 פיקסלים ושפר את ניגודיות התמונה ל- 0.3% עבור פיקסלים רוויים (Process | שפר את הניגודיות). הכפל את ערכי התמונה ב- 10.0 (תהליך | מתמטיקה | להכפיל) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
   3. ב- מעקב (תוספים | מעקב | Trackmate), בחר קוטר בועה משוער של 48 פיקסלים (נקבע באופן אמפירי בהתבסס על גודל ההכללה בסוף ההדמיה). הפק רצועות הכללה לא מפוצלות על-ידי בחירת מרחק מרבי מקשר ומרחק מרבי של 8.0 פיקסלים ו- Gap-closing-frame gap של 1 ( JoVE61365_screenfile23 -JoVE61365_screenfile25).
      הערה: כדי לשפר את היכולת של Trackmate לזהות ולעקוב אחר הכללות לאורך כל המחזור ערוץ תמונה נפרד נוצר על ידי הוספת הנשף euo וערוצי הנשף hctBיחד באמצעות פונקציית מתמטיקה תמונה ImageJ / FIJI. לאחר מכן, ערוץ זה משמש את Trackmate כדי לזהות ולעקוב אחר הכללות לאורך זמן. ערכי הפלורסנט של נשף הסיום של האיחודהאירופי וערוצי הנשף של ה-HCTBנרשמים לאחר מכן בערוצים 2 ו-3.
   4. רצועות שיא הנורמות משך זמן רציף מינימלי: משך המסלול: 20 (JoVE61365_screenfile26). נתח את הרצועות ושמור את הנקודות בסטטיסטיקת מעקב כקובץ CSV (JoVE61365_screenfile27).
      הערה: תהליך זה הפך לאוטומטי באמצעות קובץ Script מותאם אישית של פיתון המסופק בנתונים המשלים (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
3. זיהוי רצועות הכללה עם פרופילים התפתחותיים שהשתנו
   הערה: כדי לזהות הכללות המכילות Chlamydia עם פרופילים התפתחותיים שהשתנו, כל רצועה כוללת הודמית באמצעות מחברת פיתון. פריטים חזותיים אלה מאפשרים זיהוי של הכללות עם פרופילי ביטוי גנים קינטיים השונים מהאוכלוסייה שטופלה בלעג. מחברת פיתון המשמשת לזיהוי הכללות עם תכנות התפתחותי שונה מסופקת בנתונים המשלים (EMS_Screen-מארקדאון).
   1. יבא את נתוני מסלול ההכללה Import מנקודות ברצועות סטטיסטיקה CSV קבצים לתוך מסגרת נתונים Pandas באמצעות התא ייבוא במחברת פיתון EMS_Screen-Markdown.
   2. תקן את תוכנית הבסיס כל רצועה על-ידי חיסור הערך המינימלי של כל רצועה משאר ערכי הרצועה באמצעות התאים חיסור בסיסי. שמור את הערכים המתוצרים כקובץ מלפפון חמוץ באמצעות התא שמור כמלפפון חמוץ. פעולה זו תשמור לצמיתות את ערכי הערוץ לאחר חיסור בסיסי לאחזור מאוחר יותר.
      הערה: חיסור בסיסי מגדיר את עוצמת הפלורסנט ההתחלתית של כל הכללה לאפס.
   3. בטל עקבות מהכללות ליד קצות ה-FOV באמצעות התא 'קצוות מסנן' מכיוון שפרופילי הפלורסנט שלהם לא יילכדו במלואם; עקבות אלה עשויים להפיק פרופילים התפתחותיים חיוביים כוזבים.
   4. כיול ערכי המסגרת (totalFrames) מפרוסות התמונה לזמן (startTime, interval) ערכים עם תא הכיול של זמן-lapse באמצעות שעת ההתחלה הניסיונית ומרווח זמן ההדמיה. אל תכלול קריאת הכללה חלקית על-ידי סינון עקבות שאינן משתרעות במהלך 20 השעות האחרונות של הניסוי (16-36 HPI) באמצעות התא Track Duration Duration Filter.
   5. הפרד מסלולים למסגרות נתונים בודדות לפי מצב ניסיוני באמצעות התא הקצאת טיפול. סנן עבור הכללות המציגות צמיחה מספקת באמצעות התא מסנן לצמיחה. בתא מסנן לצמיחה, באופן אמפירי להגדיר את סף עוצמת פלואורסצינטי עבור ערוץ הנשף euoעל ידי שינוי הערכים בתוך שתי שורות הקוד האחרונות. זה יסנון את כלמידיה שלא גדלה.
      הערה: היה זהיר בעת הגדרת מסנני סף, אם המסנן נמוך מדי, קווי הפיזור וכתוצאה מכך יהיו רועשים, אך אם הסינון מוגדר מוטנטים חשובים מדי עשויים להתבטל.
   6. חשב את אחוז התמותה הנגרמת על ידי EMS על ידי חלוקת מספר מסלולים מוטאגנים / גם על ידי מספר מסלולים שטופלו בלעג / גם. הכפל את מספר הרצועות שטופלו בלעג על-ידי גורם דילול ראשוני של 3 כדי לחשב את מספר הרצועות שטופלו בלעג/באר. השתמש ברצועות הכללת ספירה וחשב תאי תמותה אחוזים כדי לבצע משימה זו.
   7. חשב את השעה לביטוי חצי-ממקסימום עבור כתבים מוקדמים ואיחור עבור כל רצועה באמצעות התא חשב. ערכים אלה ישמשו להשוואה בין אוכלוסיות מוטגניות וללעג לזיהוי מוטנטים התפתחותיים.
   8. בתוך תא העלילה חצי מקס להשתמש בחבילת התוויית bokeh כדי לדמיין את הזמן לביטוי חצי מקסימום של כל יזם, גרף זמן הנשף euoלביטוי חצי מקסימום נגד זה של נשף HCTB. זהה הכללות מאוכלוסיית המוטנטים שנופלות מחוץ לענן הפיזור שטופל בלעג באמצעות סייר זיהוי המסלול האינטראקטיבי של בוקה. שים לב לנקודות הציון של FOV ו-XY של הכללות הריבית (איור 2).
      הערה: בחר הכללות מועמדים שבאופן חזותי נופלות מחוץ לענן הבקרה כאימות והערכה סטטיסטית של כל שיבוט יבוצעו לאחר מכן.
   9. בתוך תא העלילה אנימציה לדמיין שינויים בביטוי קינטיות היזם באופן דינמי לאורך זמן על ידי גרפים את עוצמת הביטוי של נשף הסיום של האיחודהאירופי נגד נשף hctBבאמצעות כלי התוויית העלילה¹⁶. פונקציית הפיזור של Plotly משמשת להנפיש את ביטוי הגן לאורך זמן(וידאו 1).
   10. הדמיה של תמונה מגרף המונפש העלילתי בתא איתור הכללה, התוויית נשף הסיום של euo וביטוי נשף hctBבנקודת זמן ספציפית (כלומר 28 HPI) באמצעות חבילת bokeh(איור 3). זהה הכללות מאוכלוסיית המוטנטים כמתואר בשלב 3.3.8.
       הערה: ניתוח זה צריך להתבצע במהירות (<4 h) כמו הכללות עדיין מתרחבים ויתחילו lyse תאים מארחים ~ 48 שעות לאחר הזיהום.
4. לבודד מוטנטים התפתחותיים מהכללות של עניין
   הערה: כדי לבודד כלמידיה מן הכללות שהיו נחושים להציג ויסות גנים שונה micromanipulator עם מחטי נימה הועסק. נקודות הציון של מזהה באר, FOV ו-X,Y של הכללות של עניין נקבעו באמצעות פריט חזותי של נתונים בסעיף 3.3.
   1. הכן מחטי ניים על ידי החזקת מרכז צינור נערך בלהבה ומושך את שני קצות צינור נערך עד שהוא נפרד. צור פתח במחט נמש משך על ידי שבירת הקצה משך על שקופית מיקרוסקופ. כדי לשבור את המחט, מניחים את הקצה הסגור על החלק הקפוא של שקופית המיקרוסקופ בזווית ולהפעיל לחץ.
      הערה: מפרטי צינור נימוי היו 1.0 מ"מ O.D., 0.5 מ"מ מספר זמן.
   2. ודא כי פתיחת המחט היא בערך בגודל של הכללה תחת מיקרוסקופ, 20x המטרה.
   3. Prepull ~ 25-30 מחטי נכי לבידוד של הכללות מועמדים (מחט אחת לכל הכללה).
   4. מלא את המיקרוב בשמן מינרלי כדי להבטיח שלא יהיו בועות אוויר.
   5. חבר מחט נכים מזכוכית למיקרו-מזרק וגרש שמן לקצה המחט, ומחק את כל בועות האוויר. מניחים את מחט הנתים בתקשורת מלאה ולמשוך את התקשורת באמצע הדרך. מילוי מחט נימה עם מדיה מונע זיהום שמן בבאר.
   6. באמצעות רשימת המיקום שנשמר ב- μManager מ- 2.3.5, העבר אל הבאר ואת FOV של הכללת עניין שזוהתה במחברת ההדמיה Python.
   7. השתמש ג'ויסטיק של micromanipulator כדי למצוא את מחט נימה לנקודות הציון XY של הכללת עניין.
   8. השתמש בערוץ 595 נארם excitation כדי לדמיין EBs עבור חילוץ ואת שלב / DIC לבן אור ערוץ עבור הדמיית מחט. לתמרן את מחט נמש להכללה, לקרוע את ההכללה ולאחר מכן למשוך את האי.בי.אס לתוך מחט נימות באמצעות microinjector.
   9. לגרש את EBs ממחט נמש לתוך באר אחת של 24 גם פוליסטירן צלחת מוכן בשלב 2.1.2. הסר את מחט נימים ולהחליף עם מחט נימים טריים לחילוץ הכללה הבאה. חזור על סעיף 3.4 עבור כל הכללות המועמדים.
      הערה: להרחבה ולהבטיח טיטר גבוה מספיק להדמיה מחדש, מוטציה דגירה מבודדת ב 5% CO₂, 37 ° C אינקובטור עד רוב התאים המארח נגועים (~ 1 שבוע). בארות צריך להיות במעקב צמוד כמו מבודדים שונים עשויים להפגין שיעורי צמיחה שונים.
5. מוטנט קציר מבודד
   1. על קרח, לשבש את המונו-שכבתית הנגועה על ידי גירוד עם קצה מיקרופיפט 1 מ"ל. להעביר את התקשורת, פסולת התא, ושחרר כלמידיה לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
   2. גלולה כלמידיה על ידי צנטריפוגציה במשך 30 דקות ב 4 ° C, >14,000 x g. הסר את גלולת supernatant וssuspend ב 75 μL של קרח קר 1x SPG. Aliquot לתוך שלוש 1.5 מ"ל בורג כובע צינורות microcentrifuge. לאחסן ב -80 °C.

4. אימות של פנוטיפים מוטנטים מבודדים

1. תרבות תא מארחת להדמיית מבודד מוטאגניים
   1. זרע 96 גם זכוכית תחתון צלחת עם 1.6 x^{10 4} Cos-7 תאים (ATCC) לכל באר ב 100 μL של מדיה מלאה. דגירה ב 5% CO₂, 37 °C. התאים אמורים להגיע לתופף בעוד כ-24 שעות. לאחר תאים הם confluent, להחליף מדיה עם מדיה מלאה בתוספת 1 μg / mL cycloheximide, דגירה בן לילה.
2. להדביק תאים עם מועמד מבודד לאימות פנוטיפיק
   1. להפשיר שיבוטים מוטנטים וכלמידיה פראית על קרח.
   2. בצלחת 96 באר מוכן, לבצע דילול סדרתי כפול של מבודד מוטציה, באמצעות עמודה אחת לכל מבודד (11 עמודות). התחל עם דילול ראשוני של 1:20 ב 100 μl HBSS.
      הערה: דילול טורי של כלמידיה מתבצע כדי להבטיח דגימות מוטנטים הם תמונה ב MOI < 1.
   3. להדביק את העמודה הנותרת (12th) עם כלמידיה wildtype ב MOI ~ 0.5.
      הערה: כלמידיה Wildtype משמשים כפקד להשוואה נגד מבודד mutagenized.
   4. דגירה במשך 15 דקות נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס.
   5. לשטוף תאים מארחים נגועים עם מחממים מראש (37 °C) HBSS עם 1 מ"ג / מ"ל של הפרין ו HBSS כפי שצוין בסעיף 2.2.
   6. החלף ב- 200 μL לכל באר של מדיית הדמיה חנוכת מראש (37°C).
   7. מלא את החללים המשולבים ב- H₂O המיוער מראש (37°C).
   8. דגירה ב 5% CO_2,37 °C עבור 10 שעות.
3. כיוונון מיקרוסקופ
   הערה: עיין בסעיף 2.3 עבור הגדרת מיקרוסקופ, סעיף זה יכיל רק את השינויים הדרושים בהתקנה.
   1. בחר את תבנית צלחת 96 באר מתוך תוסף HCS.
   2. באופן אמפירי לקבוע בארות המתאימות MOI < 1 עבור כל מוטנט לבודד. ביטוי תלתן תחת שליטה של מקדם euo הוא נצפה ב ~ 10 HPI מה שהופך את ההדמיה המוקדמת של הכללות אפשרי(איור 1B).
   3. בחר שלוש בארות לכל מבודד מוטציה התואמות ל- MOI < 1 וצור רשימת מיקומי הדמיה המורכבת משני FOV לבאר.
      הערה: ניתן לשים לב רק 72 תמונות לכל מרווח זמן עקב אילוצי חומרה, זה משווה לשלוש דילול (בארות) לכל זן באמצעות שני אתרי הדמיה לכל באר אם 12 דגימות הן תמונה.
   4. רמת את המחזור ההתפתחותי של כל מוטנט מבודד למשך 36 שעות במרווחי זמן של 30 דקות החל מ- 12 HPI.
   5. רטוט את הפרטים הניסיוניים בתיבה הערות רכישות. כלומר, איי.בי.סי1. ובכן ABC2: זן מוטציה 1, ABC3: זן מוטציה 2, וכו '... הדמיה: 12-48 HPI.
   6. התחל את רכישת התמונה ב- 12 HPI.

5. ניתוח נתונים לאימות מבודד

1. יצירת ערימות תמונה בפוקוס וכמת ביטוי פלואורסקנציה בהכללות בודדות
   1. צור עקבות עוצמת פלורסנט עבור כל הכללה כפי שצוין בסעיף 3.1 - 3.2.
2. אימות מבודד mutagenized Ctr
   הערה: כדי לאמת את הפרופילים ההתפתחותיים שהשתנו של מבודדים מוטנטים, פרופילי הביטוי שלהם מושווים לפרופיל הביטוי wildtype באמצעות מחברת Python. מחברת פיתון המשמשת לאימות שיבוטים מוטנטים עם תכנות התפתחותי שונה מסופקת בנתונים המשלים (clone_check-Markdown).
   1. יבא וסנן את נתוני מעקב ההכללה במחברת clone_check-Markdown Python כפי שנעשה בסעיף 3.3.
   2. חשב את ממוצע וסטיית התקן (STD) מהעקבות של כל אוכלוסיית בקרה מבודדת ו- wildtype באמצעות התא חשב ממוצע ו- STD.
   3. עם Graph Iso לעומת WT התא להתוויה השגיאה הרגילה והממושעת של הצבע (SEM) של כל שיבוט מוטציה מול פקד wildtype כדי לקבוע אם קינטיות ביטוי מוטציה מפוצלים מדגימת wildtype(איור 4).
   4. לקבוע אם אוכלוסיית המוטנטים המבודדת היא clonal על ידי התוויית עקבות מוטציה והשוויה אותם עקבות הכללה wildtype באמצעות חלקת פיזור כפי שנעשה בסעיף 3.3 (שלבים 3.3.7-3.3.10) (איור 2, איור 3). אם המבודד הוא אוכלוסייה מעורבת, העלילה תראה אוכלוסייה אחת שכבה עם wildtype ואוכלוסייה נפרדת שנייה מחוץ לענן פיזור wildtype. אם האוכלוסייה נראית מעורבת, ניתן לבודד מחדש את המוטנט באמצעות ההליך המקורי המתואר בסעיף 3.4.
      הערה: כדי לקבוע אם הפרופיל ההתפתחותי של מבודד שונה סטטיסטית מסוג wildtype יש להשוות את הקימורים עבור כל מבודד ל- wildtype באמצעות ANOVA.

תוצאות

מוטגנזה EMS ישיר של זן כלמידיאל היזם-כתב שלנו הביא לירידה של ~75% בהדבקה. באמצעות פרוטוקול הדמיה תא חי המתואר, כ-600 הכללות נותינו ואותרו במשך תקופה של 24 שעות. הביטוי הפלורסנט קינטיקה של שני הכתבים בכל הכללה היה חזותי באמצעות סקריפטים ניידים פיתון מותאם אישית. שתי גישות הדמיה יושמו כדי לזהות מועמד mutagenized כלמידיה לבידוד. המתודולוגיה הראשונה (שלב 3.3.8) מדמיינת את הזמן לביטוי חצי-מקסימלי של מקדמי euo ו-HCTB מבודדים כלמידיים בודדים בחלקת פיזוראינטראקטיבית (איור 2).

דיון

ניתוח המנגנונים לשלוט מחזור התפתחותי כלמידיאלי כבר התעכב על ידי המגבלות של הכלים הגנטיים הזמינים כיום. העסקת היזם שלנו-כתב כלמידיה בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטי תא חי, מערכת נבנתה המאפשר ניטור של פיתוח סוג תא בהכללות בודדות על פני תקופה של 24 שעות. מערכת זו, בשילוב עם mutagenesis כימי ובידוד הכללה ישירה הקימה שיטה כדי לבחור במהירות וclonally כלמידיה המביעה פרופילים התפתחותיים שונה(איור 5).

EBs כלמידיאלי פעילים באופן מטבולית מחוץ למארח כאשר מסופקים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
לוחות פוליסטירן 24 בארות	Corning	3524	גידול תרבית תאים להדבקה חוזרת של מבודדים
לוחות תחתונים מזכוכית 6 בארות	Cellvis	P06-1.5H-N	גידול תרבית תאים להדמיה
צלחות תחתונות זכוכית 96 בארות	Nunc	165305	גידול תרבית תאים להדמיה
יחידת CO2 קו מודגש	OKO Labs	יחידת CO2 שלב BL	בקרת CO2
קו מודגש T Unit	OKO Labs	H301-T-UNIT-BL-PLUS	בקרת טמפרטורה של חממת במה צינורות
נימיים מזכוכית בורוסיליקט	Sutter Instrument	B1005010	צינורות נימיים
מסנן פליטת פס פס BrightLine (514/30 ננומטר)	Semrock	FF01-514/30-25	קוביית מסנן פלואוסנט
מסנן פליטת פס פס BrightLine (641/75 ננומטר)	Semrock	FF02-641/ 75-25	קוביית מסנן פלואוסנט
CellTram Vario	Eppendorf	5196000030	מיקרו-מזרק
כלמידיה טרכמטיס סרובר L2	ATCC	VR-577	כלמידיה טרכומטיס
CIP-1 מדיה	בבית	NA	Axenic. IPB בתוספת 1% FBS, 25 ו-mu; חומצות אמינו M, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT ו-50 μ M GTP, UTP, ו CTP. (Omsland, A. 2012) תוצרת החברה.
תאי Cos-7 (ATCC)	ATCC	CRL-1651	תא כליה של קוף ירוק אפריקאי (תאי מארח)
Cycloheximide	MP Biomedicals	194527	מעכב צמיחת תאי מארח
אתיל מתאן סולפונט, 99%	Acros Organics	AC205260100	Mutagen
Fetal Plex	Gemini Bio-Products	100-602	תוסף למדיית גידול בסיס
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/Fiji	NA	תוכנה לניתוח תמונות מקורות פתוחים. https://imagej.net/Fiji
חממת CO2 גלקסי 170	S Eppendorf	CO1700100X	של דגירה של תרבית תאים
(גרסאות FP פלואורסצנטיות: Clover ו-mKate2)	טכנולוגיות DNA משולבות	NA	gblock ORFs של גרסאות FP מותאמות ל-Ctr לשיבוט לתוך p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml	Gibco	15710-064	אנטיביוטיקה למצע גידול
HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק)	קורנינג	21-020-CM	תאי מארח שוטפים
את הפרין נתרן	אמרשם מדעי החיים	16920	מעכב והופך את האינטראקציות האלקטרוסטטיות המוקדמות בין התא המארח ל-EBs
HEPES 1M	GE Life Sciences	SH30237.01	מאגר pH למצע גדילה
InjectMan	Eppendorf	5179 000.018	Micromanipulator
Jupyter Notebook	https://jupyter.org/	NA	הדמיה של עקבות הכללה. https://jupyter.org/
Lambda 10-3	Sutter Instrument	LB10-3	שולט גלגל מסנן
Oko Touch	OKO Labs	ממשק מגע Oko Touch	לשליטה בקו המודגש T ויחידת CO2
שלב XY קודם	קודם	H107	ממונע שלב מיקרוסקופ XY פריזמה
צנטריפוגה	Labnet	C2500-R	מיקרוצנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה
תנור היברידיזציה Problot	Labnet	H1200A	חממת נדנדה לזיהום בכלמידיה
Proscan II	קודם	H30V4	XYZ בקרת שלב מיקרוסקופ
מטהר Class 2 ארון בטיחות ביולוגית	Labconco	362804	עבודת תרבית תאים
RPMI-1640 (ללא פנול אדום)	Gibco	11835-030	מדיית גידול בסיס להדמיה
RPMI-1640 (פנול אדום)	GE Life Sciences	SH30027.01	מדיית גידול
בסיסנוריות עירור LED (470nm, 595nm)	scopeLED	F140	אור עירור
Sonic Dismembrator דגם 500	Fisher Scientific	15-338-550	סוניקטור, השעיית גלולה כלמידית
חממת שלב	OKO Labs	H301-K-FRAME	אשכול תא דגירה של צלחת
מאגר סוכרוז-פוספט-גלוטמט 1X (SPG)	בבית	NA	מאגר אחסון כלמידיה. (10 מ"מ נתרן פוספט [8 מ"מ K 2HPO 4, 2 מ"מ KH 2PO 4], 220 מ"מ סוכרוז, 0.50 מ"מ חומצה L-גלוטמית; pH 7.4)
T-75 צלוחיות	Thermo Scientific	156499	גידול תרבית תאים
TE 300 מיקרוסקופ הפוך	Nikon	16724
THOR LED	Thor Labs	LEDD1B	אור לבן
Trypsin	Corning	25-052-CI	מסיר תאים מארחים מבקבוק לזריעה לצלחות
Zyla sCMOS	Andor	ZYLA-5.5-USB3
ומיקרו; מנהל 2.0gamma	https://github.com/micro-manager/micro-manager	NA	חבילת תוכנה לבקרת מיקרוסקופ אוטומטי מקור פתוח