מאמר שיטה

שיטת זיהוי כמותית למיקרו-רנ"א בכליה של מודל עכבר פגיעה כלייתית איסכמית

DOI:

10.3791/61378

⸱

11 בספטמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של מודל עכברי פגיעה כלייתית חריפה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת. פרוטוקול זה מדגיש מודל עכבר של פגיעה כלייתית איסכמית ומיצוי זהיר של דגימות מיקרו-RNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-רנ"א (miRNAs) מעורבים במצבי מחלה שונים ומהווים סמנים ביולוגיים יעילים לאבחון מוקדם של מחלות וטיפול בעכברים. עם זאת, פרוטוקולים סטנדרטיים לטיהור miRNAs וזיהוי ביטוים בכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית חריפה (AKI) לא הוכחו היטב. מחקר זה פיתח פרוטוקול יעיל ופשוט לטיהור וכימות miRNAs בכליות של מודל עכבר AKI המושרה על ידי איסכמיה-רפרפוזיה כלייתית באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR). פרוטוקול זה כולל חמישה שלבים: 1) אינדוקציה של AKI על ידי איסכמיה-רפרפוזיה כלייתית, 2) קצירת כליות, 3) טיהור של סך ה-RNA, כולל miRNAs, מהכליות, 4) סינתזת cDNA על ידי שעתוק הפוך של miRNA, ו-5) qRT-PCR לאיתור ביטוי miRNA. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ליצור את מודל הפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כלייתית עם צורות קלות עד חמורות של AKI. בנוסף, אם ההליך מתבצע כראוי, ניתן להשיג מודל AKI עקבי עם הבדלים אינדיבידואליים מינימליים. בדיקת qRT-PCR זו מציגה טווח דינמי רחב מאוד ומאפשרת הבחנה של miRNAs בוגרים, אותם ניתן לכמת במדויק עם ספציפיות גבוהה. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את פרופיל ביטוי ה-miRNA בכליות AKI.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI) של הכליה מייצגת את אחד מגורמי הסיכון העיקריים להתפתחות פגיעה כלייתית חריפה (AKI)1. AKI ממלא תפקיד משמעותי בפרוגנוזה של המטופלים, אך לא נקבעו טיפולים ספציפיים וסמנים ביולוגיים לאבחון מוקדם.

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם רנ"א קצרים שאינם מקודדים עם כ-18-25 בסיסים. miRNAs יציבים בנוזלי הגוף, והרצפים שלהם נשמרים מאוד בקרב בעלי חיים2. MiRNAs מווסתים את הביטוי של חלבונים מרובים באמצעות אלפי מטרות, ובכך משפיעים על מסלולי איתות מגוונים 2,3,4,5,6,7,8. בשנים האחרונות דווח כי miRNAs מעורבים במצבי מחלה שונים ומהווים סמנים ביולוגיים יעילים לאבחון מוקדם של מספר מחלות.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לטהר ולזהות בהצלחה miRNAs בכליות של מודל עכבר AKI המושרה על ידי IRI. מודל IRI זה הוא מודל בשימוש נרחב של AKI ופיברוזיס כלייתי. היתרונות של מודל IRI כוללים את היכולת לאשר חזותית אם הושגה איסכמיה-רפרפוזיה ולקבוע את הזמן המדויק של הופעת AKI. עם זאת, משך מהדק ארוך מספיק כדי לגרום לנזק צינורי רחב קשור לשיעור תמותה גבוה, בעוד שמשך מהדק קצר אינו גורם לנזק צינורי, מה שמביא לשונות גדולה בהתקדמות הנזק הצינורי במודל ניסיוני זה. בהשוואה למודל ההידוק הדו-צדדי, רקמת כריתת הכליה הימנית שנקטפה במודל IRI הכליה החד-צדדי פועלת כבקרה ומבטיחה אי ספיקת כליות.

דגימת הכליה מועכת באמצעות הומוגנייזר זכוכית, שבו מופרדים חלבונים וחומצות גרעין, ו-DNA ו-RNA מופרדים9. סך ה-RNA, כולל miRNA, מטוהר מדגימת הכליה באמצעות עמודת ספין9 המבוססת על ממברנת סיליקה. לאחר מכן, סינתזת cDNA (שעתוק הפוך) מתבצעת מ-RNA כולל באמצעות פולי (A) פולימראז ופריימרים oligo-dT10. לבסוף, ביטוי ה-miRNA נקבע על ידי qRT-PCR באמצעות צבע אינטרקלציה10. qRT-PCR יכול לכמת בצורה מדויקת יותר את ביטוי הגנים בהשוואה ל-PCR של נפחי הגברה בנקודות קצה. qRT-PCR מודד ריכוזים גבוהים ומאופיין בטווח דינמי רחב, המאפשר כימות מדויק התלוי במספר המחזורים. מחקרים קודמים דיווחו כי ניתן להשתמש בתהליכים פשוטים כדי לטהר ולזהות ביעילות miRNA ברקמות 8,9,10. דווח כי השיטות המתוארות בפרוטוקול זה לסינתזת cDNA (שעתוק הפוך) וזיהוי ביטוי miRNA על ידי qRT-PCR באמצעות צבע אינטרקלציה הראו דיוק ורגישות גבוהים10.

בנוסף, פרוטוקול זה פשוט ומשיג תוצאות עקביות בין מעבדות. לכן, פרוטוקול זה שימושי במחקרים הדורשים זיהוי miRNA מדויק ורגיש ביותר בכליות AKI של עכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל פרוטוקולי הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ובוצעו בהתאם להנחיות השימוש והטיפול בחיות ניסוי מהמדריך של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לחיות מעבדה.

1. מודל IRI

הערה: עקוב בקפידה אחר היפותרמיה, לחות מעיים ועומק ההרדמה לאורך כל ההליך.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל המכיל כותנה ספוגה באיזופלורן, כרית כירורגית מחוממת, צלחת פטרי עם מי מלח עם פוספט (PBS), מספריים כירורגיים ומלקחיים. שמור על ה-PBS על 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: מודל IRI זה נוצר באמצעות עכברי C57BL/6 זכרים (9 שבועות; 20-25 גרם) השוכנים בחדר עם טמפרטורה מבוקרת, לחות ומחזור אור-חושך של 12 שעות.
  2. הרדמה של בעל החיים באמצעות איזופלורן: ריכוז אינדוקציה 3%-5%, ריכוז תחזוקה 2%-3% וריכוז במהלך הידוק 1%-1.5%. אשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן רפלקסים. להרדמה באינהלציה יש יתרון שניתן לכוונן את הזמן. ההליך עשוי להימשך זמן משמעותי בגלל קילוף הרקמה המקיפה את הכליה. עם זאת, החיסרון של הרדמה באינהלציה הוא שטמפרטורת הגוף נוטה לרדת. לאורך כל ההליך, הימנע מהרדמה מיותרת.
  3. הרכיבו את העכבר המורדם על כרית כירורגית מחוממת על גבו, הסירו את השיער המקיף את אזור החתך ורססו את עור הבטן של העכבר באתנול 70%.
  4. בצע חתך בקו האמצע בעור הבטן, השריר וקרום הצפק באמצעות מספריים ומלקחיים.
  5. בעזרת צמר גפן רטוב ב-PBS, דחפו בעדינות את המעי לכיוון הצד השמאלי של החלל החוץ-בטני, וחשפו את הכליה והשופכן הימניים. זמן ההליך הארוך עלול לגרום לפגיעה במעי לאחר הניתוח. לפיכך, עדיף לנתח מבלי להוציא את המעיים מחלל הבטן כאשר ניתן להשיג שדה ראייה. הימנע מייבוש המעיים. ספוגיות יבשות או גזה עלולות לגרום לנזק למעי.
  6. הרם את השופכן הימני בעזרת מלקחיים זוויתיים. קשרו את השופכן הימני פעמיים באמצעות תפרים קלועים במשי 4/0. חותכים בין התפרים ומשאירים את התפר הקרוב יותר לכליה ארוך יותר.
  7. החזק בזהירות את התפר שנותר מבלי למשוך יותר מדי, ונתח בבוטות את רקמת החיבור והשומן לאורך הכליה. ביצוע ניתוח מאחור מפחית את הסיכון לנזק לכבד.
    1. זהה כלי דם, מלבד עורקי הכליה והוורידים, המספק דם לכליה הימנית, ולאחר מכן קשר או הצמד אותו. כאשר הכליה הימנית מנותקת מספיק, קשרו את עורק הכליה והווריד הימני באמצעות תפר קלוע משי 4/0. במקום לתפור, השתמש בקליפ המוסטטי.
    2. בעזרת צמר גפן רטוב ב-PBS, דחפו בעדינות את המעי לכיוון הצד הימני של החלל החוץ-בטני כדי לחשוף את הכליה השמאלית, ולאחר מכן כסו את המעי בווילון לח כדי למנוע את התייבשותו. נתח את רקמת החיבור והשומן סביב הכליה השמאלית.
  8. זהה כלי דם, מלבד עורקי הכליה והוורידים, המספק דם לכליה השמאלית, ולאחר מכן קשר או הצמד אותו. מהדק את עורק הכליה ווריד הכליה כדי לגרום לאיסכמיה של הכליה השמאלית. מקם את הקליפ ההמוסטטי במרחק של כ-1 ס"מ מהכליה כדי למנוע נזק לפרנכימה הכלייתית. ניתן לאשר איסכמיה מוצלחת חזותית על ידי התכהות אחידה הדרגתית של הכליה.
  9. החזר את המעיים לחלל הבטן, הקפד להימנע מפיתול מעיים; סגור זמנית את עור הבטן והווילון כדי לשמור על סביבה לחה. הפחיתו ככל האפשר את ריכוז ההרדמה באינהלציה ונסו לשמור על חום החיה. זמן ההידוק הוא 25-45 דקות. זמן הידוק ארוך יותר גורם לנזק כלייתי חמור יותר אך גם מגביר את התמותה לטווח הארוך. התאם על ידי ניתוח תוצאות הפתולוגיה.
  10. הסר את המהדק לאחר סיום תקופת האיסכמיה. ודא שזרימת הדם וצבע הכליות משתפרים. ודא שהמעי אינו מעוות לפני סגירת עור הבטן. יש להחדיר PBS תוך צפקי כתוסף נפח לפני סגירת הבטן בשתי שכבות. סגור את עור הבטן באמצעות 4-0 תפרי ניילון. לתקופות ארוכות יותר של הסרת כליות, ניתן להפחית את האפשרות להידבקויות במעי על ידי סגירה נפרדת של דופן הבטן והצפק.
  11. כדי למזער את הסיכון לזיהום לאחר הניתוח, יש למרוח חומר חיטוי (למשל, תמיסת יוד/אלכוהול) על אזור הניתוח.

2. איסוף דגימות כליה

הערה: לסרטון זה יש זמן הידוק של 45 דקות, איסוף הכליות 24 שעות לאחר מכן.

  1. להרדים את החיה עם איזופלורן 5% ולאשר את עומק ההרדמה על ידי אובדן רפלקסים.
  2. בצע חתך בקו האמצע בעור הבטן, השריר וקרום הצפק באמצעות מספריים ומלקחיים. אסוף את הדם מהווריד הנבוב התחתון המנוקב על ידי מחט 27 גרם.
  3. בצע חתך בקו האמצע בדופן החזה והכנס מחט 23 גרם לחדר השמאלי. אשר זרימה חוזרת. בצע חתך בכבד והזריק 20 מ"ל PBS. כאשר הדם מתנקז, הכבד משנה את צבעו מאדום לוורוד, מה שמאשר שמספיק דם נוקז.
  4. הסר את הכליה השמאלית בעזרת מלקחיים ומספריים ושטוף אותה עם PBS בצלחת פטרי. הסר את הפאשיה הכלייתית באמצעות מלקחיים, היזהר לא לייבש את הכליה.
  5. חותכים את הכליה לשניים ומשתמשים בחצי אחד להיסטופתולוגיה ובחצי השני לשלב הבא. הימנע מאגן הכליה, וקצור 30 מ"ג מהכליה. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

3. טיהור miRNAs מדגימות כליה

הערה: כאן, דגימות כליה במשקל 30 מ"ג הומוגניות באמצעות הומוגנייזר זכוכית ומערכת גריסה ביופולימרית בעמודת ספין מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, miRNA מדגימת הכליה מבודד באמצעות עמודת ספין מבוססת קרום סיליקה.

  1. הכן את הפריטים הבאים: צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 או 2.0 מ"ל, 100% אתנול, כלורופורם, הומוגנייזר זכוכית, קרח, מערכת גריסה ביופולימרית בעמודת ספין מיקרוצנטריפוגה9, עמודות ספין מבוססות קרום סיליקה9, מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין, מאגר כביסה המכיל גואנידין ואתנול (מאגר כביסה 1), ומאגר כביסה המכיל אתנול (מאגר כביסה 2).
  2. הכניסו דגימת כליה של 30 מ"ג להומוגניזטור זכוכית והוסיפו 700 מיקרוליטר של ריאגנט ליזה על בסיס פנול/גואנידין. בצע שלב זה על קרח מכיוון שהרקמה עוברת דנטורציה על ידי חום.
  3. הומוגניזציה של דגימת הכליה על ידי לחיצה איטית של העלי על הדגימה על ידי סיבובה. חזור על תהליך זה כמה עשרות פעמים על קרח עד שדגימת הכליה התמוססה לחלוטין לתוך מגיב הליזיס המבוסס על פנול/גואנידין. כאשר miRNA לא מתקבל במדידות הבאות, סביר להניח שזה בגלל המסה לא מספקת.
  4. להומוגניזציה נוספת, העבירו את הליזט ההומוגני למערכת גריסת הביופולימר בעמוד ספין מיקרו-צנטריפוגה המונח בצינור איסוף של 2.0 מ"ל. צנטריפוגה זה ב -14,000 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. העבירו את הליזאט ההומוגני לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
  6. הוסף 140 מיקרוליטר כלורופורם לליזט ההומוגני וכסה את הצינור היטב. מערבבים את הצינור בהיפוך למשך 15 שניות.
  7. דגרו את הדגימות למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה אותם ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. העבירו את הסופרנטנט (בדרך כלל 300 מיקרוליטר) לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש מבלי להפריע למשקעים והוסיפו 1.5 נפחים (בדרך כלל 450 מיקרוליטר) של 100% אתנול. מערבבים את הדגימה על ידי מערבולת למשך 5 שניות.
  9. פיפטה עד 700 מיקרוליטר מהדגימה לתוך עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה המונח בצינור איסוף של 2.0 מ"ל. סגור את מכסה העמודה, וצנטריפוגה ב -15,000 × גרם למשך 15 שניות. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף.
  10. הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1 לעמוד הסיבוב המבוסס על קרום סיליקה כדי לשטוף היטב את הדגימה. סגור את מכסה העמוד וצנטריפוגה אותו ב -15,000 × גרם למשך 15 שניות. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף.
  11. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה 2 לעמודת הסיבוב המבוססת על קרום סיליקה כדי להסיר עקבות מלח. סגור את מכסה העמוד, וצנטריפוגה ב -15,000 × גרם למשך 15 שניות. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף.
    1. חזור על שלב 3.11.
  12. צנטריפוגה עמודת הספין המבוססת על קרום סיליקה שוב ב-15,000 × גרם למשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף.
  13. הנח את עמוד הספין המבוסס על קרום סיליקה בצינור איסוף חדש של 1.5 מ"ל. העבירו 25 מיקרוליטר של מים נטולי RNase לתוך העמודה, וסגרו את מכסה העמודה. השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה אותה בחום של 15,000 × גרם למשך דקה.
  14. העבירו את ה-25 מיקרוליטר המכיל miRNAs לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. מכיוון ש-miRNA מתפרק על ידי פירוק חוזר ונשנה, מומלץ לחלק את הדגימה ל-2 או 3 צינורות. יש לאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

4. שעתוק הפוך של miRNA

הערה: כאן, 1.0 מיקרוגרם של RNA מבודד מתועתק לאחור באמצעות טרנסקריפטאז הפוך, פולי (A) פולימראז ופריימרים אוליגו-dT.

  1. הכן את הפריטים הבאים: צינורות מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מ"ל; צינורות רצועה 8 בארות; מים ללא RNase; קרח; תערובת חומצות גרעין פי 10 המכילה דאוקסינוקלאוטידים, ריבונוקלאוטידים טריפוספטים ופריימרים אוליגו-dT; תערובת פולימראז פולי (A) וטרנסקריפטאז הפוך; ומאגר מפעיל, כולל Mg2+, דאוקסיריבונוקלאוטידים, פריימרים אוליגו-dT ופריימרים אקראיים10.
  2. הכן תמיסת תערובת מאסטר המכילה 2.0 מיקרוליטר של תערובת חומצות גרעין 10x, 2.0 מיקרוליטר של פולימראז פולימראז ותערובת טרנסקריפטאז הפוך, ו-4.0 מיקרוליטר של מאגר הפעלה פי 5, כולל Mg2+, דאוקסיריבונוקלאוטידים, פריימרים אוליגו-dT ופריימרים אקראיים, בסך הכל 8.0 מיקרוליטר לשפופרת.
  3. יש להוציא 8.0 מיקרוליטר מתמיסת תערובת המאסטר לכל צינור.
  4. הוסף 1.0 מיקרוגרם של miRNAs מבודדים מטוהרים מדגימת הכליה לכל צינור.
  5. הוסף מים ללא RNase לכל שפופרת לסך של 20 מיקרוליטר. ערבב היטב על ידי פיפטינג, וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 15 שניות.
  6. דגרו את הדגימות למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מיד דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. ניתן לבצע שלב זה במחזור תרמי.
  7. העבירו את ה-cDNA לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ודללו 10 פעמים (1:10) במים נטולי RNase.
  8. אחסן את ה-cDNA המדולל לטווח קצר על קרח ולטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

5. qRT-PCR של miRNA

הערה: qRT-PCR של miRNA מבוצע באמצעות צבע אינטרקלציה. כאן נעשה שימוש בפריימרים עבור U6 Small Nuclear 2 (RNA-2), miRNA-17-5p, miRNA-18a-5p, miRNA-21a-5p, miRNA-132-3p, miRNA-212-3p, miRNA-223-3p ו-miRNA-574-5p.

  1. הכן את הפריטים הבאים: צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, לוחות תגובה של 96 בארות עבור qRT-PCR, סרט דבק ללוחית התגובה של 96 בארות, פריימרים ספציפיים ל-miRNA, PCR Master Mix המורכב מפולימראז DNA Taq, מאגר PCR, דאוקסינוקלאוטידים ופריימרים אוניברסליים10, ומכשיר PCR בזמן אמת.
  2. הכן תערובת מאסטר המכילה 12.5 מיקרוליטר של 2x PCR Master Mix, 2.5 מיקרוליטר מכל פריימר miRNA (5 מיקרומטר) מומס במים נטולי נוקלאז, ו-1.25 מיקרוליטר של 10x פריימרים אוניברסליים לכל באר.
  3. הוציאו 22.5 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של צלחת 96 הבארות.
  4. הוסף 2.5 מיקרוליטר של תבנית cDNA לכל באר.
  5. אטום את הצלחת עם סרט ההדבקה עבור לוחית התגובה של 96 בארות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב -1,000 × גרם למשך 30 שניות.
  6. באמצעות מכשיר ותוכנת ה-PCR בזמן אמת, הפעל את תוכנית הרכיבה על אופניים של PCR באופן הבא.
    1. הנח את הצלחת במכשיר ה-PCR בזמן אמת. הקצה שם לדגימה ול-miRNA היעד בכל באר באמצעות תוכנת Real-Time PCR.
    2. הזן את תנאי הרכיבה הבאים של PCR בתוכנת ה-PCR בזמן אמת בהתאם להוראות: דגירה מוקדמת ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחריה 40 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  7. נתח את נתוני ה-qRT-PCR באמצעות התוכנה של מכשיר ה-PCR בזמן אמת. בדוק אם יש תגובות לא ספציפיות. נתח את עקומת הדיסוציאציה או את עקומת ההיתוך כדי לאשר שלא התרחשה הגברה אחרת מזו המיועדת.
    1. לנרמל את רמת הביטוי של miRNAs מטרה ל-RNU-6 כבקרה אנדוגנית. חשב את רמת הביטוי היחסית של miRNAs מטרה באמצעות שיטת 2−ΔΔCT 11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, פרופיל ביטוי ה-miRNA בעכברי AKI נחקר. פרופיל ביטוי ה-miRNA נחקר באיברים ורקמות שונות בעכברים. MiRNAs הם מווסתים חשובים לאחר שעתוק וכעת נחקרים בהרחבה באפיון של מגוון מחלות, כולל AKI. ל-MiRNAs יש פוטנציאל לסייע בהבהרת מצבים פתולוגיים ולהיות מיושמים לטיפול ב-AKI12. הגורמים העיקריים ל-AKI הם IRI, עלבון נפרוטוקסי ואלח דם. IRI של הכליה מהווה את אחד מגורמי הסיכון העיקריים להתפתחות AKI. דווח על miRNA רבים המעורבים ב-AKI13.

מחקר זה חקר miRNAs שמשתנים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה, miRNAs מכליה של עכברי IRI טוהרו וזוהו בהצלחה באמצעות qRT-PCR. נקודות קריטיות בהליך השראת IRI בפרוטוקול כוללות ניטור קפדני של טמפרטורת הגוף וריכוזי ההרדמה, הידועים כמשפיעים על AKI20. כוחו של פרוטוקול זה הוא בכך שהוא מאפשר אישור חזותי אם הושגה איסכמיה-רפרפוזיה. עם זאת, ישנן כמה מגבלות למודל IRI זה. הארכת זמן המהדק כדי לגרום לאיסכמיה חמורה מגדילה את התמותה. בנוסף, כאשר איסכמיה כלייתית אינה מושגת באמצעות מהדק עורק הכליה השמאלי, הסיב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-Nam Nguyen, PhD על עריכת טיוטה של כתב היד הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פינצטה מחודדת עם קצה כפוף ללא ווNatsume SeisakushoMA-47
מאגר RLTQiagen79216מאגר כביסה 1
מאגר כביסה RWTQiagen10679332
עכברי C57B6SLCלא להקצות
מלקחיים עם שינייםNatsume SeisakushoMA-49
מלקחיים ללא שינייםNatsume SeisakushoMA-48-1
קליפים המוסטטייםNatsume SeisakushoKN− 353
MicroAmp אופטי 96 באר צלחת תגובה עבור qRT-PCRתרמו פישר מדעי431681396 באר צלחת תגובה
מיקרו אמפ סרט דבק אופטיתרמו פישר4311971מדעי סרט דבק לצלחת תגובה 96 באר
miRNA-132-3p פריימרQiagenMS000034585'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p פריימרQiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p פריימרQiagenMS000315145'UAAGGUGCAUCUAGCAGAUAG
miRNA-212-3p פריימרQiagenMS000038155'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p פריימרQiagenMS000090795'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p פריימרQiagenMS000038715'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p פריימרQiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU
miRNeasy מיני ערכתQiagen217004סיבוב מבוסס קרום סיליקה
miScript II RT ערכתQiagen218161
miScript SYBR ערכת PCR ירוקהQiagen218073
QIA מגרסהQiagen79654מערכת גריסה ביופולימר במיקרו צנטריפוגה ספין עמוד
QIAzol מגיב ליזהQiagen79306מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין
QuantStudio 12K Flex Flex מערכת PCR בזמן אמתThermo Fisher Scientific4472380מכשיר PCR בזמן אמת
QuantStudio 12K Flex תוכנה גרסה 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380תוכנת מכשיר PCR בזמן אמת
RNU6-2 פריימרQiagenMS00033740 מספריים כירורגיות לא נחשפו
Natsume SeisakushoB-2
כלי דם קליפ אפליקציהVITALITEC1621420
עמוד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, K. J. Acute renal failure: much more than a kidney disease. Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).
  2. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clinical Chemistry. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  3. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  4. Yang, G., et al. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. Journal of Surgical Oncology. 111 (8), 992-999 (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinial Medicine. 169, 47-66 (2016).
  9. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  10. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  11. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  12. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).
  13. Ichii, O., Horino, T. MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).
  14. Ma, L., et al. Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).
  15. Saikumar, J., et al. Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury. Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).
  16. Li, Y. F., et al. MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury. Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).
  17. Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing. Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).
  18. Liu, Y., et al. MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury. Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).
  19. Colbert, J. F., et al. A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).
  20. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MicroRNAqRT PCRRNAcDNAPCRMicroRNA

מאמרים קשורים